CN108168992B - 一种基于二维多孔晶体氮掺杂碳材料的富集分离糖肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学等领域。本发明涉及一种糖肽的分离富集方法，该方法是使用一种具有二维多孔晶体结构的高掺氮量的碳材料与蛋白酶解物接触，利用材料与糖肽间的亲水作用、静电作用、CH3‑π等作用，采用固相萃取(SPE)或者分散固相萃取(dSPE)分离模式分离富集糖肽，并对样品进行质谱分析。该方法通过优化上样液、淋洗液和洗脱液的组成、酸碱性、缓冲盐等参数，实现了对糖肽的选择性富集。该方法具有稳定性好、选择性高、吸附量大、灵活性强、操作简便可控等优点，可用于标准品和复杂样品的糖肽富集。
Description
技术领域
本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学领域，尤其涉及一种富集分离糖肽的方法。
技术背景
蛋白质的糖基化是生物体内最重要、最常见的翻译后修饰之一，与细胞粘附、信号转导、细胞凋亡、免疫应答[2-4]等生物学过程及生理机能密切相关。糖蛋白作为重要的生物标志物，目前已被广泛应用于疾病的诊断、预警和药效评价[5]。目前对糖蛋白酶解物中的糖肽结构进行质谱分析是获取蛋白质糖基化信息的主要手段，其面临的问题是：由于糖肽离子化效率低，数量又仅占所有酶解后肽段的2％～5％[6]，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽所抑制。并且由于糖链的微不均一性，同一糖基化位点上，糖链的类型可达几十种，进一步降低了糖肽的相对量而使其很难被检测到。因此，需要在质谱检测前对糖肽进行选择性富集。现有的糖肽富集方法主要有凝集素亲合法、酰肼化学法、亲水作用色谱法、硼亲和法等[7-10]，每种方法各有其缺点和局限性，例如凝集素只针对特定的糖型，糖肽的覆盖范围小；酰肼化学法操作繁琐；亲水作用色谱法存在亲水性材料糖肽选择性不足的问题等。
因此，有必要开发更高效、高选择性及稳定性的糖肽富集新材料及新方法。
二维有序晶体结构材料是近几年功能材料研发的热点之一，本发明所采用的二维多孔晶体氮掺杂碳材料，其制备方法于2015年首次见诸报道[1]，因其新颖的制备方法、独特的结构和电子性质，被认为是一种在吸附、储氢、电池、传感等领域具有潜力的新型功能材料。而将其应用于样品预处理，特别是标准品及复杂样品中糖肽的富集，尚属首次。申请人认为由于该二维多孔晶体氮掺杂碳材料具有独特的2D片层结晶结构而具有超大比表面积和丰富的微孔，吸附量大；表面有氨基、羧基等亲水基团；并且由于氮原子的引入，引起表面局部电子密度的改变，其独特的物理化学性质及电负性，使其成为一种具有潜力的高效富集糖肽的新型材料。本发明采用SPE及dSPE等模式，通量高，方法灵活，操作简便，并且通过优化酸、缓冲盐及上样液、淋洗液、洗脱液的组成及比例，实现了对糖蛋白酶解物中糖肽的高选择性富集。
参考文献：
[1]J.Mahmood,E.Lee,M.Jung,D.Shin,I.Jeon,S.Jung,H.Choi,J.Seo,S.Bae,S.Sohn,N.Park,J.Oh,H.Shin and J.Baek,Nat.Commun.,6(2015)6486.
[2]M.Taichi,S.Kitazume,K.Vong,R.Imamaki,A.Kurbangalieva,N.Taniguchi,K.Tanaka,Glycoconjugate J.,7(2015)497.
[3]H.Cai,F.Degliangeli,B.Palitzsch,B.Gerlitzki,H.Kunz,E.Schmitt,R.Fiammengo,U.Westerlind,Bioorg.Med.Chem.Lett.,5(2016)1132.
[4]A.Joshi,M.Sedano,B.Beauchamp,E.Punke,Z.Mulla,A.Meza,O.Alozie,D.Mukherjee,H.Garg,Clin.Dev.Immunol.,4(2016)1768.
[5]L.Chia,J.Chen,E.Chan,C.Wu,K.Yu,K.Chen,C.Tsou,C.Tsai,C.Chien,Y.Kuo,P.Lin,J.Yu,C.Hsueh,M.Chen,C.Chan,Y.Chang,Y.Chen,Mol.Cell.proteomics 2011
[6]K.Hiroyuki,S.Haruna,Y.Yoshio,Nat Biotechnol,21(2003)667.
[7]W.Zhang,H.Wang,L.Zhang,Talanta,85(2011)499.
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[9]Y.Pan,C.Ma,W.Tong,C.Fan,Q.Zhang,W.Zhang,F.Tian,B.Peng,W.Qin andX.Qian,Anal.Chem.，87(2015)656.
[10]Y.Wang,M.Liu,L.Xie,C.Fang,H.Xiong and H.Lu,Anal.Chem.,86(2014)2057.
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高选择性、覆盖率广、普适性强、操作简单的糖肽富集方法。本方法使用一种高掺氮量的具有二维晶体结构的多孔碳材料，以糖蛋白酶解液样品为富集对象，采用亲水作用色谱分离模式，通过优化酸或缓冲盐的类型和浓度，上样液、淋洗液及洗脱液中有机相和水相的比例等参数，实现了对糖肽的高效、高选择性富集。
本发明的技术方案如下：
一种富集分离糖肽的方法，该方法是将二维多孔晶体氮掺杂碳材料与蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽，并对样品进行质谱分析，通过优化缓冲盐的类型和浓度，以及上样液、淋洗液和洗脱液的组成和比例等富集条件，实现对糖肽的高吸附量、高选择性富集。
所述二维多孔晶体氮掺杂碳材料是由1,2,3,4,5,6-苯六胺和环己六酮充当氮源及碳源，于N-甲基吡咯烷酮溶液中聚合得到，该材料具有2D片层结构，层间距
其单层片层表面则为多孔网络状结构，孔的排列呈规则、有序结晶构型，孔径
其结构式如下：
上述方案中，采用柱固相萃取(SPE)模式具体步骤如下：
1)在SPE模式下，首先将二维多孔晶体氮掺杂碳材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者SPE小柱上，采用洗脱液冲洗材料，之后用上样液平衡材料，然后将溶解在上样液中的样品加载到材料上，之后采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽。
2)上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比为70-90％，pH在1-5范围内，缓冲盐的浓度为0-200mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％。
淋洗液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比为55-80％，pH＝1-5，缓冲盐的浓度为0-200mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％。
洗脱液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比为0-50％，pH值在0-5或10-14范围内，缓冲盐的浓度为0-500mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％。
3)采用3-50倍材料体积的洗脱液冲洗萃取柱；
4)采用3-50倍材料体积的上样液平衡萃取柱；
5)采用5-200倍材料体积的上样液溶解蛋白酶解物上样；
6)采用5-100倍材料体积的淋洗液洗脱非糖肽；
7)采用5-10倍材料体积的洗脱液洗脱糖肽，上述整个过程在15-50摄氏度下进行。
上述方案中，采用分散固相萃取(dSPE)模式具体步骤如下：
1)在dSPE模式下，将富集材料放在离心管中，采用洗脱液冲洗材料，然后用上样液平衡材料，之后把材料与溶解在上样液中的样品混合，孵化时间10-120分钟，离心弃上清液，沉淀部分用淋洗液冲洗，需要振荡3-10分钟，离心取上清液，浓缩即为非糖肽，沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽，需要震荡5-30分钟，离心取上清液，浓缩即为糖肽。
2)上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比为70-90％，pH在1-5范围内，缓冲盐的浓度为0-200mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％。
淋洗液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比为55-80％，pH＝1-5，缓冲盐的浓度为0-200mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％。
洗脱液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比为0-50％，pH值在0-5或10-14范围内，缓冲盐的浓度为0-500mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％。
3)采用3-500倍材料体积的洗脱液与离心管中的材料混合，震荡3-10分钟，冲洗材料，离心弃上清液，收集沉淀；
4)采用3-500倍材料体积的上样液与上步收集到的沉淀(材料)混合，震荡3-10分钟，平衡材料，离心弃上清液，收集沉淀；
5)采用3-1000倍材料体积的上样液溶解蛋白酶解物并与上步收集到的沉淀(材料)混合，震荡孵化10-120分钟，离心弃上清液，收集沉淀；
6)采用3-1000倍材料体积的淋洗液与上步收集到的沉淀(材料)混合，震荡3-10分钟，离心取上清液，上清液浓缩即为非糖肽。
7)采用5-100倍材料体积的洗脱液与上步收集到的沉淀(材料)混合，震荡5-30分钟，离心取上清液，上清液浓缩即为糖肽，上述整个过程在15-50摄氏度下进行。
本发明具有如下优点：
1.富集材料的吸附量大：本发明所述的方法采用的二维多孔晶体氮掺杂碳富集材料具有较大的比表面积，与样品之间的作用面积大，因此吸附量较大。
2.富集方法的选择性高：由于二维多孔晶体氮掺杂碳富集材料对糖肽和非糖肽不同的静电作用力和亲水作用，可以特异性的分离糖肽和非糖肽，获得高富集选择性。
3.富集方法的普适性强：本发明所述的方法通过向上样液、淋洗液、洗脱液中添加合适的酸或缓冲盐，优化其浓度和pH值，可以实现对糖蛋白酶解样品中糖肽的选择性富集。
4.富集方法的通量高：本发明所述的方法可采用分散固相萃取模式，可以在同一时间操作多个实验，通量高。
5.本发明所述的方法操作灵活简便，重复性好。该方法具有稳定性好、选择性高、吸附量大、灵活性强、操作简便可控等优点，可用于标准品和复杂样品的糖肽富集。
附图说明
图1为采用二维多孔晶体氮掺杂碳材料富集胎球蛋白酶解液中糖肽的质谱图。
图2采用二维多孔晶体氮掺杂碳材料在dSPE模式下富集胎球蛋白酶解物中糖肽的质谱图。
图3二维多孔晶体氮掺杂碳材料的片层结构及层间距示意图以及孔径、孔结构示意图；其是按照文献[1]制备方法合成，由1,2,3,4,5,6-苯六胺和环己六酮充当氮源及碳源，于N-甲基吡咯烷酮溶液中聚合得到，该材料具有2D片层结构，层间距
其单层片层表面则为多孔网络状结构，孔的排列呈规则、有序结晶构型，孔径
具体实施方式
为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。
实施例中所用原料及设备:
1,2,3,4,5,6-苯六胺、环己六酮、甲酸、胎球蛋白、牛血清白蛋白、辣根过氧化酶、三氟甲基磺酸、N-甲基吡咯烷酮、氨水、硫酸、碳酸氢铵均购自Sigma-Aldrich公司。所用水为Milli-Q(Billerica公司)系统净化得到的去离子水，其他试剂如三氟乙酸、乙腈等均使用市售色谱级。去盐所用GELoader枪头购自Eppendorf公司，去盐所用C18材料(5μm，
)购自华谱新创科技有限公司(北京)。质谱分析结果由ESI-Q-TOF MS(Waters公司)获得。
本发明以下实施例所使用的二维多孔晶体氮掺杂碳材料(以下简称C2N)结构式为：
制备方法如文献[1]所述：在冰浴环境中，氩气氛下，在三口圆底烧瓶中加入2g(7.20mmol)1,2,3,4,5,6-苯六胺与2.248g(7.20mmol)环己六酮，充分搅拌下缓慢添加80mL混合3-8滴浓硫酸的N-甲基吡咯烷酮，或80mL新蒸馏的三氟甲基磺酸。滴加完成后撤去冰浴，烧瓶回暖至室温，反应2小时，再用油浴将烧瓶加热至175℃反应8小时，随后将烧瓶冷却至室温，加入去离子水，沉淀出的固体产物用0.5μm的聚四氟乙烯膜抽滤收集，收集到的黑色固体产物再依次用水和甲醇索氏提取。最后在0.05mmHg压力下，-120℃冻干3天得到二维多孔晶体氮掺杂碳富集材料。制备流程如下所示：
实施例1
以C2N作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 85％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为200μL的80％乙腈/0.1％甲酸、70％乙腈/0.1％甲酸和60％乙腈/0.1％甲酸溶液淋洗，最后用30μL50％乙腈/0.1％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。结果如图1所示，质谱图中都是糖肽的信号，说明所用材料对糖肽的选择性高。
实施例2
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 85％乙腈/1％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为200μL的80％乙腈/1％甲酸、70％乙腈/1％甲酸和60％乙腈/1％甲酸溶液淋洗，最后用30μL50％乙腈/1％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。结果如图2所示，质谱图中都是糖肽的信号，说明所用材料对糖肽的选择性高。
实施例3
以C2N作为富集材料，所用材料的片层结构及层间距示意图以及孔径、孔结构示意图如图3所示，在SPE模式下富集糖肽。将1mg材料装入tip中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于30μL 85％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为30μL的80％乙腈/1％甲酸、70％乙腈/1％甲酸和60％乙腈/1％甲酸溶液淋洗，最后用30μL50％乙腈/1％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例4
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为200μL的75％乙腈/0.1％甲酸、70％乙腈/0.1％甲酸溶液淋洗，最后用30μL50％乙腈/5mM碳酸氢铵溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例5
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 70％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为200μL的70％乙腈/0.1％甲酸、40％乙腈溶液淋洗，最后用30μL40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。
实施例6
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 70％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为200μL的70％乙腈/0.1％甲酸、40％乙腈溶液淋洗，最后用30μL40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。
实施例7
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 85％乙腈/0.2％三氟乙酸溶液中，上样后，用体积为200μL的80％乙腈/0.2％三氟乙酸淋洗两次，最后用30μL20％乙腈/2％甲酸溶液洗脱，洗脱液直接在质谱上进行分析，结果如图1所示。
实施例8
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的辣根过氧化酶酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 85％乙腈/0.2％三氟乙酸溶液中，上样后，用体积为200μL的80％乙腈/0.2％三氟乙酸淋洗两次，最后用30μL 20％乙腈/2％甲酸溶液洗脱，洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例9
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的辣根过氧化酶酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 80％乙腈/0.2％三氟乙酸溶液中，上样后，用体积为200μL的75％乙腈/0.2％三氟乙酸淋洗两次，最后用30μL 20％乙腈溶液洗脱，洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例10
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 85％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，用体积均为200μL的80％乙腈/2％甲酸、40％乙腈溶液淋洗，最后用30μL40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。
实施例11
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于100μL 75％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，用体积均为200μL的73％乙腈/2％甲酸、70％乙腈/2％甲酸溶液淋洗，最后用30μL30％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。
实施例12
以C2N作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将1mg材料装入tip中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于30μL 70％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为30μL的70％乙腈/0.1％甲酸、40％乙腈溶液淋洗，最后用30μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。
实施例13
以C2N作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将1mg材料装入tip中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于30μL 80％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用体积均为30μL的80％乙腈/1％甲酸、40％乙腈溶液淋洗，最后用30μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。
实施例14
以C2N作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将1mg材料装入tip中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于30μL 80％乙腈/0.1％三氟乙酸溶液中，上样后，用体积均为30μL的75％乙腈/0.1％三氟乙酸和70％乙腈/0.1％三氟乙酸溶液淋洗，最后用30μL50％乙腈/2％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例15
以C2N作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将1mg材料装入tip中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于30μL 85％乙腈/0.1％三氟乙酸溶液中，上样后，用体积均为30μL的80％乙腈/0.1％三氟乙酸和75％乙腈/0.1％三氟乙酸溶液淋洗，最后用30μL50％乙腈/2％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例16
以C2N作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将1mg材料装入tip中，5μL旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)重溶于30μL 85％乙腈/1％三氟乙酸溶液中，上样后，用体积均为30μL的80％乙腈/1％三氟乙酸和75％乙腈/1％三氟乙酸溶液淋洗，最后用30μL50％乙腈/2％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例17
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL胎球蛋白酶解物(1mg/mL)和358μL牛血清白蛋白酶解物混合去盐，旋干后重溶于100μL 80％乙腈/0.1％甲酸，上样后，用体积为200μL的75％乙腈/0.1％甲酸淋洗六次，然后用30μL 40％乙腈溶液淋洗一次，最后用30μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。
实施例18
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL胎球蛋白酶解物(1mg/mL)和358μL牛血清白蛋白酶解物混合去盐，旋干后重溶于100μL 80％乙腈/0.2％三氟乙酸，上样后，用体积为200μL的78％乙腈/0.2％三氟乙酸淋洗六次，然后用30μL 20％乙腈/2％甲酸溶液洗脱，洗脱液直接在质谱上进行分析，结果如图2所示。
实施例19
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL胎球蛋白酶解物(1mg/mL)和358μL牛血清白蛋白酶解物混合去盐，旋干后重溶于100μL 80％乙腈/0.1％甲酸，上样后，用体积为200μL的75％乙腈/0.1％甲酸淋洗六次，然后用30μL 50％乙腈/2％甲酸溶液洗脱，洗脱液直接在质谱上进行分析。
实施例20
以C2N作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将2mg材料装入离心管中，5μL胎球蛋白酶解物(1mg/mL)和358μL牛血清白蛋白酶解物混合去盐，旋干后重溶于100μL 80％乙腈/1％甲酸，上样后，用体积为200μL的75％乙腈/1％甲酸淋洗六次，然后用30μL 50％乙腈/2％甲酸溶液洗脱，洗脱液直接在质谱上进行分析。
综上所述，本发明所述的基于二维多孔晶体氮掺杂碳材料的糖肽富集方法对于糖肽具有较高的选择性、回收率和较好的重复性，可将其应用于复杂体系中糖肽的选择性分离富集，本发明所述的方法将在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。
Claims (7)
1.一种基于二维多孔晶体氮掺杂碳材料的富集分离糖肽的方法，其特征在于，是将二维多孔晶体氮掺杂碳材料与蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽；
所述二维多孔晶体氮掺杂碳富集材料结构式示意为：
将所述二维多孔晶体氮掺杂碳材料作为富集材料，采用柱固相萃取模式（SPE）和分散固相萃取模式（dSPE）富集和纯化糖肽；
在SPE模式下，首先将二维多孔晶体氮掺杂碳材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者SPE小柱上，采用洗脱液冲洗材料，之后用上样液平衡材料，然后将溶解在上样液中的样品加载到富集材料上，之后采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽；
在dSPE下，将富集材料置于离心管中，采用洗脱液冲洗材料，然后用上样液平衡材料，之后把材料与溶解在上样液中的样品混合，孵化后，离心弃上清液，所剩沉淀部分用淋洗液冲洗，震荡后，离心取上清液，浓缩即为非糖肽，沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽，震荡后，离心取上清液浓缩即得糖肽。
2.如权利要求 1所述的方法，其特征在于：所述二维多孔晶体氮掺杂碳材料是由1,2,3,4,5,6-苯六胺和环己六酮充当氮源及碳源，于N-甲基吡咯烷酮或三氟甲基磺酸溶液中170－180oC聚合得到。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为70-90%，pH在1-5范围内，缓冲盐的浓度为0-200 mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1%-5%；
淋洗液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为55-80%，pH=1-5，缓冲盐的浓度为0-200mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1%-5%；
洗脱液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为0-50%， pH值在0-5或10-14范围内，缓冲盐的浓度为0-500 mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1%-5%。
4.按照权利要求3所述方法，其特征在于，所用的蛋白酶解物应旋干去盐，重溶于上样液，样品的上样量与二维多孔晶体氮掺杂碳材料量之间的体积比例为1:3-1:1000，实验操作温度为15-50摄氏度。
5.按照权利要求1或3所述方法，其特征在于，采用SPE模式富集糖肽，冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3-50倍,上样体积为材料体积的5-200倍，淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的5-100倍，洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5-30倍；采用dSPE模式富集糖肽，冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3-500倍，平衡材料所用的上样液体积为材料体积的3-500倍，上样体积为材料体积的3-1000倍，淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的3-1000倍，洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5-200倍。
6.按照权利要求1或3所述方法，其特征在于，采用dSPE模式富集糖肽，振荡转数为100-2500rpm，样品与材料之间的孵化时间为10-120分钟，孵化温度为15-50摄氏度。
7.按照权利要求1或3所述方法，其特征在于，有机溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇中的一种或二种以上，缓冲盐包括甲酸铵，乙酸铵，碳酸氢铵，酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或二种以上。
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