CN114324658A - 三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三聚氰胺的分散固相萃取‑高效液相色谱联用检测方法。本发明是以巯基功能化共价有机框架微球作为新型分散固相萃取吸附剂，利用巯基功能化共价有机框架微球和三聚氰胺间的亲水相互作用，实现实际样品中痕量三聚氰胺的萃取、富集与净化，并与高效液相色谱联用，实现实际样品中痕量三聚氰胺的高灵敏检测。本发明方法简单，操作简便，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广，可实现奶粉等复杂实际样品中痕量三聚氰胺的高效富集净化与高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法。
背景技术
三聚氰胺俗称蛋白精、密胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化工原料。三聚氰胺的分子结构中含有大量氮元素，含氮量高达66.6%。蛋白质的成分主要为氨基酸，含氮量约为18%。凯氏定氮法是测定食品中蛋白质含量的经典方法。凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量是以含氮量来确定食品中的蛋白质含量。由于该方法不能准确判断氮元素的来源，因而为牟取暴利在食品和饲料中添加三聚氰胺以虚假增加其蛋白质含量。三聚氰胺是非食品用化学物质，长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石，对身体造成伤害。因此，食品和饲料中严禁添加三聚氰胺。
目前，三聚氰胺的分析检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、酶联免疫法和红外光谱法等。然而，由于实际样基质复杂、干扰严重，易给后续分析结果带来不利影响，直接检测实际样中的微量三聚氰胺困难重重，高效的样品前处理技术不可或缺。在样品前处理技术中，新型吸附剂的开发始终居于核心位置。共价有机框架（COF）有着多样的构筑单元（如:含硼类、亚胺类、三嗪类等）和十分灵活的分子设计特性，它可以精确地引入官能团或催化位点以控制表面化学性质，因此被广泛应用于气体储存、催化、生物传感、光电子等领域。鉴于其高稳定性、大比表面积和可控的物化性质等优点，COF材料也在样品前处理领域拥有广阔的应用前景。本发明利用COF可修饰的特点，以含烯基的COF材料作为基质COF材料，利用巯烯点击化学合成巯基功能化COF微球。通过巯基的功能化，改变了基质COF微球的表面性能，在COF微球表面赋予了大量的氢键作用位点，为实际样品中微量三聚氰胺的富集萃取提供了大量的高效作用位点。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术缺陷，提供一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法。本发明是以巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）作为分散固相萃取剂，建立分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，发展一种食品中痕量三聚氰胺的富集检测方法。得益于巯基功能化共价有机框架微球与三聚氰胺之间的亲水作用，实现实际样中痕量三聚氰胺的净化富集萃取和高灵敏分析检测。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，所述方法以巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）作为分散固相萃取吸附剂，利用巯基功能化共价有机框架微球与三聚氰胺间的氢键相互作用，实现实际样品中痕量三聚氰胺的萃取、富集与净化，并与高效液相色谱联用，实现三聚氰胺的分析检测。
一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，包括以下步骤：
（1）分散固相萃取：取2 mL以富集溶剂制备的样品溶液于离心管中，加入1.5 mg巯基功能化共价有机框架（COFTAPB-DVA@SH）微球，超声分散均匀；放置于孵育器中，室温恒温孵育2小时；将孵育完成后的离心管放置于离心机，以8000转/分钟的离心转速，离心5分钟，完成后移除上清液；所述的富集溶剂为乙腈；
（2）解吸附：向离心管中加入1 mL洗脱溶剂，超声解吸附15分钟，然后以8000转/分钟的离心转速，离心5分钟，收集并针头过滤器过滤洗脱液；所述的洗脱溶剂为甲醇；
（3）高效液相色谱系统检测：将洗脱液用氮气吹干后，以0.2 mL流动相重溶，制备待测溶液；将待测溶液直接进样至高效液相色谱（HPLC）系统检测，HPLC系统使用的液相色谱分析柱为C18分析柱，检测使用的流动相为体积比为1:9的乙腈/水溶液，流动相流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm，柱温为40℃。
上述方法步骤（1）中巯基功能化共价有机框架（COFTAPB-DVA@SH）微球的制备，包括以下步骤：
1）基质共价有机框架微球（COFTAPB-DVA）的制备：先将14.1 mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯（TAPB）和11.2 mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛（DVA）溶于5 mL的乙腈中，超声10分钟使其溶解；加入0.35 mL浓度为12 mol/L的乙酸溶液，在室温下反应72小时得到均匀的黄色悬浊液；将黄色悬浊液离心5分钟后过滤，依次用5 mL的四氢呋喃和乙醇清洗三次，在60℃下真空干燥24小时，得到黄色的基质共价有机框架微球（COFTAPB-DVA）；
（2）巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）的制备：以偶氮二异丁腈为引发剂，将20 mg上述的COFTAPB-DVA微球和2 mg偶氮二异丁腈置于烧瓶中，加入4 mL的1,2-乙二硫醇；室温搅拌48小时，利用巯烯点击化学反应，制得黄褐色悬浊液；将黄褐色悬浊液离心5分钟后过滤，用5 mL丙酮清洗三次，60 ℃下真空干燥24小时，得到黄褐色的巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）。
上述一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法在三聚氰胺检测中的应用。
本发明的显著优点在于：
本发明根据分析对象三聚氰胺的结构特点，针对性选择具有大量氢键作用位点的吸附剂，开发高效的前处理技术。共价有机框架（COF）材料具有可调节的孔结构、较大的比表面积、良好的可修饰性等特点；本发明充分发挥了COF材料的可修饰性，在基质COF材料表面进行巯基功能化，改变基质COF微球的表面性能；优选的室温修饰条件，保持了基质COF材料优良的孔结构、较大的比表面积；这些针对性的功能化，赋予了巯基功能化共价有机框架微球在实际样中微量三聚氰胺的净化富集萃取中的卓越性能，检测限为0.5 ng/mL，展示了COF材料在样品前处理方面的应用潜力。
附图说明
图1是巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）的X射线光电子能谱图。图中光电子峰从右到左依次为O、N、C、S元素的特征峰。
图2是分别以COFTAPB-DVA微球（COF）和COFTAPB-DVA@SH（COF-SH）微球作为分散固相萃取吸附剂，比较不同吸附剂对三聚氰胺的萃取富集情况图。
图3是高效液相色谱图。a是500 ng/mL的三聚氰胺标准溶液直接HPLC检测的色谱图；b是加标20 ng/mL三聚氰胺的实际样品溶液直接HPLC检测的色谱图；c是加标20 ng/mL三聚氰胺的实际样品溶液经分散固相萃取后HPLC检测的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法：
步骤一、分散固相萃取吸附剂巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）的制备：
（1）基质共价有机框架微球（COFTAPB-DVA）的制备：称取14.1 mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和11.2 mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛于离心管中，添加5 mL乙腈作为反应溶剂，超声10分钟使其溶解；然后加入0.35 mL 12 mol/L乙酸作为催化剂，震荡均匀，室温反应72小时后得到均匀的黄色悬浊液；黄色悬浊液离心5分钟后过滤，依次用5 mL的四氢呋喃和乙醇清洗三次，在60 ℃下真空干燥24小时，得到黄色的COFTAPB-DVA微球；
（2）巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）的制备：称取20 mg上一步合成的COFTAPB-DVA微球和2 mg偶氮二异丁腈于烧瓶中；再加入4 mL的1,2-乙二硫醇，室温反应48小时得到黄褐色悬浊液；黄褐色悬浊液离心5分钟后过滤，用5 mL丙酮清洗三次，60 ℃下真空干燥24小时，最后得到黄褐色的COFTAPB-DVA@SH微球。
步骤二、分散固相萃取-高效液相色谱系统联用检测：
（1）分散固相萃取：取2 mL以富集溶剂制备的样品溶液于离心管中，加入1.5 mgCOFTAPB-DVA@SH微球，超声分散均匀；放置于孵育器中，室温恒温孵育2小时；将孵育完成后的离心管放置于离心机，以8000转/分钟的离心转速，离心5分钟，完成后移除上清液；所述的富集溶剂为乙腈；
（2）解吸附：向离心管中加入1 mL甲醇，超声解吸附15分钟，然后以8000转/分钟的离心转速，离心5分钟，收集洗脱液过针头过滤器过滤；
（3）高效液相色谱系统检测：将洗脱液用氮气吹干后，以0.2 mL流动相重溶，制备待测溶液；将待测溶液直接进样至HPLC系统检测，HPLC系统使用的液相色谱分析柱为C18分析柱，检测使用的流动相为体积比为1:9的乙腈/水溶液，流动相流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm，柱温为40℃。
实施例1巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）的制备
（1）基质共价有机框架微球（COFTAPB-DVA）的制备：称取14.1 mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和11.2 mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛于离心管中，添加5 mL乙腈作为反应溶剂，超声10分钟使其溶解；然后加入0.35 mL 12 mol/L乙酸作为催化剂，震荡均匀，室温反应72小时后得到均匀的黄色悬浊液；黄色悬浊液离心5分钟后过滤，依次用5 mL的四氢呋喃和乙醇清洗三次，在60 ℃下真空干燥24小时，得到黄色的基质共价有机框架微球（COFTAPB-DVA）；
（2）巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）的制备：称取20 mg上一步合成的COFTAPB-DVA微球和2 mg偶氮二异丁腈于烧瓶中；再加入4 mL的1,2-乙二硫醇，室温反应48小时得到黄褐色悬浊液；黄褐色悬浊液离心5分钟后过滤，用5 mL丙酮清洗三次，60 ℃下真空干燥24小时，最后得到黄褐色的巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）。
制备的巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）进行X射线光电子能谱表征。如图1所示，在COFTAPB-DVA@SH 微球的X射线光电子能谱图中可以看到了O、N、C、S元素的特征峰，表明微球中存在S元素，证明了巯基对基质共价有机框架（COFTAPB-DVA）的成功功能化。
实施例2
实施例制备的巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）和基质共价有机框架微球（COFTAPB-DVA）分别作为分散固相萃取吸附剂，结合高效液相色谱分析系统，对两者的饱和吸附量进行测试（图2）。在最优分散固相萃取条件（即：2 mL标准品溶液；1.5 mg吸附剂微球；室温恒温孵育2小时；然后以8000转/分钟的离心转速，离心5分钟）下，COFTAPB-DVA@SH微球对三聚氰胺的饱和吸附量明显远远大于COFTAPB-DVA微球，显示出巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）对三聚氰胺的高效富集能力。如图2所示，在各自最优条件下，COFTAPB-DVA@SH微球对三聚氰胺的饱和吸附量为14.8 mg/g，而COFTAPB-DVA微球对三聚氰胺的饱和吸附量不到5 mg/g，说明了COFTAPB-DVA@SH微球和三聚氰胺之间的相互作用明显大于COFTAPB-DVA微球和三聚氰胺间的相互作用。这主要是由于巯基功能化改变了基质COFTAPB-DVA微球的表面性能，提供了大量的巯基结合位点增强了其与三聚氰胺之间的氢键作用。
实施例3
实施例1制备的巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH），将其作为分散固相萃取剂，结合高效液相色谱系统，检测实际奶粉样品中添加的微量三聚氰胺：
（1）分散固相萃取：取2 mL以富集溶剂制备的奶粉样品溶液于离心管中，加入1.5mg COFTAPB-DVA@SH微球，超声分散均匀；放置于孵育器中，室温恒温孵育2小时；将孵育完成后的离心管放置于离心机，以8000转/分钟的离心转速，离心5分钟，完成后移除上清液；所述的富集溶剂为乙腈；
（2）解吸附：向离心管中加入1 mL甲醇，超声解吸附15分钟，然后以8000转/分钟的离心转速，离心5分钟，收集洗脱液过针头过滤器过滤；
（3）高效液相色谱系统检测：将洗脱液用氮气吹干后，以0.2 mL流动相重溶，制备待测溶液；将待测溶液直接进样至HPLC系统检测，HPLC系统使用的液相色谱分析柱为C18分析柱，检测使用的流动相为体积比为1:9的乙腈/水溶液，流动相流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm，柱温为40℃。
以未经巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）分散固相萃取的加标20 ng/mL三聚氰胺的实际样品溶液直接高效液相色谱检测为对照。
检测结果如图3所示，直接检测奶粉中添加的三聚氰胺（加标浓度20 ng/mL），奶粉基质干扰严重，无法利用高效液相色谱系统直接测得奶粉中痕量三聚氰胺（曲线b）；但是如果在检测前使用巯基功能化共价有机框架微球（COFTAPB-DVA@SH）对奶粉中的三聚氰胺进行分散固相萃取处理，即可通过高效液相色谱系统测得奶粉中痕量三聚氰胺（曲线c）。由此充分说明了以巯基功能化共价有机框架微球为吸附剂的分散固相萃取方法，可明显减弱奶粉中的基质干扰作用，使得高效液相色谱检测过程中三聚氰胺的信号峰清晰识别；并且，通过巯基功能化共价有机框架微球的高效富集萃取，提高了检测方法的灵敏度。本发明所提供的三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法在5-8000 ng/mL 浓度范围内表现出良好的线性(R2>0.9998)，检测限为0.5 ng/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：所述检测方法是以巯基功能化共价有机框架微球作为分散固相萃取吸附剂，利用巯基功能化共价有机框架微球与三聚氰胺间的氢键相互作用，实现实际样品中三聚氰胺的萃取、富集与净化，并与高效液相色谱联用，实现三聚氰胺的分析检测。
2.根据权利要求1所述的一种三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
分散固相萃取：取2 mL以富集溶剂制备的样品溶液于离心管中，加入1.5 mg巯基功能化共价有机框架微球，超声分散均匀，于孵育器室温孵育2小时，然后离心，去除上清液；所述的富集溶剂为乙腈；
解吸附：向离心管中加入1 mL洗脱溶剂，超声解吸附15分钟，然后离心，取上清液并过滤收集洗脱液；所述的洗脱溶剂为甲醇；
高效液相色谱检测：将洗脱液用氮气吹干后，以0.2 mL流动相重溶，制备待测溶液；将待测溶液直接进样至高效液相色谱系统检测，高效液相色谱系统使用的液相色谱分析柱为C18分析柱，检测使用的流动相为体积比为1:9的乙腈/水溶液，流动相流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm，柱温为40℃。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述巯基功能化共价有机框架微球的制备方法包括以下步骤：
1）基质共价有机框架微球的制备：称取14.1 mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和11.2 mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛于离心管中，添加5 mL乙腈作为反应溶剂，超声10分钟使其溶解；然后加入0.35 mL 12 mol/L乙酸作为催化剂，震荡均匀，室温反应72小时后得到均匀的黄色悬浊液；将黄色悬浊液离心5分钟后过滤，依次用5 mL的四氢呋喃和乙醇清洗三次，在60 ℃下真空干燥24小时，得到黄色的基质共价有机框架微球；
2）巯基功能化共价有机框架微球的制备：称取20 mg基质共价有机框架微球和2 mg偶氮二异丁腈于烧瓶中；再加入4 mL的1,2-乙二硫醇，室温反应48小时得到黄褐色悬浊液；将黄褐色悬浊液离心5分钟后过滤，用5 mL丙酮清洗三次，60 ℃下真空干燥24小时，最后得到黄褐色的巯基功能化共价有机框架微球。
4.权利要求1所述三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法在三聚氰胺检测中的应用。
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