CN108434783B - 固相萃取柱和固相萃取柱填料的制作方法及利用该固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固相萃取柱和固相萃取柱填料的制作方法及利用该固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法，属于食品检测领域。一种固相萃取柱，包括固相萃取柱套筒、注射进样口、出液口，固相萃取柱套筒上设有盖子，盖子上设有注射进样口，固相萃取柱套筒内腔设有上玻璃纤维挡板和下玻璃纤维挡板，上玻璃纤维挡板和下玻璃纤维挡板之间放置固相萃取混合填料。一种固相萃取柱填料的制作方法，包括载体合成步骤和离子液体固载化步骤。本发明超快速固相萃取柱处理时间短，检测成本低，本发明方法具有很好的重现性和稳定性。本快速提取方法完全利用高效的萃取技术，更稳定，更快捷。本发明固相萃取柱应用于检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的含量。

Description

固相萃取柱和固相萃取柱填料的制作方法及利用该固相萃取 柱检测黄曲霉毒素的方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种固相萃取柱和固相萃取柱填料的制作方法及利用该固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法。
背景技术
黄曲霉毒素M1(AFM1)属于黄曲霉毒素(Aflatoxins)一类结构相似的化合物中的一种，该类毒素是由常见的黄曲霉菌(Asperillus Flavus)和寄生曲霉菌(AsperillusParasiticus)产生的代谢产物，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)是最主要的一种毒素，哺乳类动物摄入被AFB1污染的饲料或食品后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，生成AFM1。AFM1也可由一些黄曲霉菌和寄生曲霉直接产生。AFM1毒性主要表现在致癌性和致突变性，生理学致癌机制的研究表明:AFM1的远端呋喃环环氧结构与体内DNA嘌呤残基共价结合，从而造成DNA的某些损伤，引起DNA结构和功能的改变，产生癌变，与AFB1的致癌性基本相似，但毒性低于AFB1，然而与氰化钾和砒霜相比，仍属特别剧毒物质，为强致癌剂。由于缺乏行之有效的防治和去毒方法，因此针对食品特别是乳制品，制定严格的AFM1限量标准就尤为重要，一方面能最大限度地控制人体对AFM1的摄入量，减轻对人体的危害，另一方面也能加强乳及乳制品生产企业品质管理，保证向消费者提供营养安全的食品。中国对婴儿乳品中AFM1的限量标准为不得检出，及牛乳中0.5μg/kg。限量标准的实施必须建立灵敏、准确、快捷的检测方法，自发现牛奶中含有AFM1以来，对AFM1的检测方法各国科学家做了大量的研究，取得了很大的进展，现分类介绍如下:
薄层色谱法(TLC)样品经提取、浓缩、薄层分离后，AFM1在波长365nm的紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量与标准溶液的荧光强度相比较来测定含量。TLC操作复杂，AFM1标准品浓度较高，潜在的污染性较高，特异性较差，灵敏度也相对较差，检测耗时长，检出限量为0.3μg，样品回收率为67％(鲜奶)，和80％(奶粉)，不适合大批量样品检测。需提取净化的分析方法样品前处理操作烦琐，复杂，费时，劳动强度大。高效液相色谱法(HPLC)自动化程度高，稳定性好，灵敏度高，但所需仪器设备投资大，操作技术要求高，净化柱消耗较多，检测成本较高，免疫亲和柱特异性较好，但需结合HPLC仪和荧光光度计才能定量检测，检测技术要求和成本较高，而ELISA法相比而言，操作简便，快捷，污染较小，灵敏度也较高，适合批量样品的普检和筛选，但存在假阳性和假阴性的可能，且只能半定量。
发明内容
本发明的目的是提供一种萃取效果好的固相萃取柱；
本发明的另一个目的是提供一种萃取速度快的固相萃取柱填料的制作方法；
本发明的再一个目的是提供一种利用固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法。
本发明所采用的技术方案是：一种固相萃取柱，包括固相萃取柱套筒、注射进样口、出液口，固相萃取柱套筒上设有盖子，盖子上设有注射进样口，固相萃取柱套筒内腔设有上玻璃纤维挡板和下玻璃纤维挡板，上玻璃纤维挡板和下玻璃纤维挡板之间放置固相萃取混合填料。
一种固相萃取柱填料的制作方法，包括载体合成步骤和离子液体固载化步骤，下述步骤中原料的份数均指质量份数，
A、载体合成步骤如下：向三口烧瓶中加入70-80份的蒸馏水和1份聚乙烯醇粉末，充分搅拌溶解作为分散相备用；称取甲苯、正辛烷、N－乙烯吡咯烷酮和二乙烯苯至小烧杯中，加入偶氮二异丁腈混匀后倒入三口烧瓶中快速搅拌25-35min，加热至,65-75℃，冷凝回流，搅拌反应,11.5-12.5h后停止反应，用水和甲醇清洗产物，于75-85℃下，真空干燥3.5-4.5h，得二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，该共聚物微球粒径大小为30-50μm；
B、离子液体固载化的步骤如下：秤取干燥的1份的二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，加入0.8-1.2份的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，加入10-15份的甲醇，超声处理25-35min；于65-75℃下，真空干燥，得到固相萃取填料。
作为本发明的进一步改进，所述步骤A中以下原料的具体质量份数为，15份甲苯、5份正辛烷、9份N－乙烯吡咯烷酮、15份二乙烯苯、0.15份偶氮二异丁腈。
作为本发明的进一步改进，所述1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体的合成步骤如下，步骤中的份数均指质量份数，称取25份N-甲基咪唑和26份1-氯正辛烷于100mL烧瓶中，加热回流10h，用热乙酸乙酯多次洗涤反应后的液体，弃去乙酸乙酯，在70℃温度下旋转蒸发，得到淡黄色粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐，备用；称取1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐35份溶于200mL蒸馏水中，加入六氟磷酸钾47-50份，搅拌1h，分为两层，弃去上层后，用蒸馏水反复洗涤除去氯离子，在洗涤过离子液体的水中滴加0.1mol/L的硝酸银溶液，直到不产生白色沉淀；65-75℃旋转蒸发去除水分，得到淡黄色粘稠液体；将该液体溶于200份色谱纯甲醇中，加入活性炭脱色；取上清液过大孔树脂固相萃取柱，接收全部流出液，65-75℃旋转蒸发去除多余溶剂；得到无色透明粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体。
一种利用固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：
步骤1、取上述固相萃取柱，向固相萃取柱套筒中加1mL蒸馏水，弃去流出液；向萃取柱中加入处理样品的上清液，弃去流出液，控制上清液流出速度小于30mL/min；上清液全部留出后，加入5mL蒸馏水，弃去流出液，并通过10mL空气，将萃取柱中残留水吹出；再用注射器加入2mL甲醇，并通过5mL空气，吹出萃取柱中液体，收集所有流出液，将流出液定容至2.00mL，过0.45μm滤膜，进行高效液相色谱仪测定；
固相萃取柱的使用方法如下：M1样品液从固相萃取柱套筒的注射进样口端快速注射式上样，样品液带着杂质从固相萃取柱套筒的出液口快速流出；被检测物质M1富集在固相萃取混合填料上，洗脱液从固相萃取柱套筒的注射进样口快速注射式上样，洗脱液带着M1从固相萃取柱套筒的出液口快速流出；
步骤2、配制黄曲霉毒素M1标准溶液，绘制黄曲霉毒素M1标准溶液的工作曲线；
步骤3、根据步骤2测得的样品制备液的峰面积值，从步骤3绘制的系列黄曲霉毒素M1标准溶液的工作曲线上找到该峰面积值对应的黄曲霉毒素M1的含量，计算待测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的含量。
作为本发明的进一步改进，所述样品由如下步骤处理，称取液态乳样品35g，加入5mL蛋白沉淀剂一，5ml蛋白沉淀剂二，充分摇匀后再加入5mL缓冲盐试剂，于5000r/min离心3min，得到沉淀和上清液；称取发酵乳及固体乳粉、乳酪样品5g，加30mL水溶解，加入5mL蛋白沉淀剂一，5ml蛋白沉淀剂二，充分摇匀后再加入5mL缓冲盐试剂，于5000r/min离心3min，得到沉淀和上清液。
作为本发明的进一步改进，蛋白沉淀剂一由亚铁氰化钾16份，溶于84份蒸馏水中得到；蛋白沉淀剂二由乙酸锌22份，加入3份盐酸，溶于75份蒸馏水中得到；缓冲盐试剂由乙酸铵10份，溶于90分蒸馏水中得到。
本发明固相萃取混合填料以二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球为载体，以1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体作为上述载体的涂层，既保证填料对黄曲霉毒素M1吸附能力，同时保证填料微粒之间有较大的空隙，样品溶液经过固相萃取柱的速度非常快，是普通固相萃取柱的5-10倍。而且目标物很容易被少量溶剂洗脱，更节约试剂。
本发明超快速固相萃取柱处理时间短，检测成本低，本发明方法具有很好的重现性和稳定性。本快速提取方法完全利用高效的萃取技术，更稳定，更快捷。本发明固相萃取柱应用于检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的含量。
本发明创新点如下：一、以共聚物微球为载体，离子液体为涂层的材料；二、快速注射式上样，速度更快(其他固相萃取柱为滴加上样，流速一般为2-3mL/min；三、少量洗脱溶剂，即可将目标物全部洗脱，其他固相萃取柱柱一般需要10-30mL洗脱液，本发明固相萃取柱只需要2-3mL洗脱液。
附图说明
图1是一种固相萃取柱的结构示意图；
图2是用本发明固相萃取柱进行萃取的萃取液的色谱图；
图3是黄曲霉毒素M1的标准色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
如图1所示，一种固相萃取柱，包括固相萃取柱套筒(2)、注射进样口(4)、出液口(5)，固相萃取柱套筒(2)上设有盖子(1)，盖子(1)上设有注射进样口(4)，固相萃取柱套筒(2)内腔设有上玻璃纤维挡板(61)和下玻璃纤维挡板(62)，上玻璃纤维挡板(61)和下玻璃纤维挡板(62)之间放置固相萃取混合填料(3)。防止混合填料外漏。该填料固相萃取柱装填：称取200mg固相萃取填料于注射式固相萃取套管中，压实填料，加盖玻璃纤维垫片，给套管加盖。得到黄曲霉毒素M1注射式超快速固相萃取柱。
固相萃取柱的使用方法如下：M1样品液从固相萃取柱套筒(2)的注射进样口(4)端快速注射式上样，样品液带着杂质从固相萃取柱套筒(2)的出液口(5)端快速流出；被检测物质M1富集在固相萃取混合填料(3)上，洗脱液从固相萃取柱套筒(2)的注射进样口(4)端快速注射式上样，洗脱液带着M1从固相萃取柱套筒(2)的出液口(5)端快速流出。
实施例1
固相萃取填料的制作方法：
一、载体合成：向250ml三口烧瓶中加入75g蒸馏水和1g聚乙烯醇粉末充分搅拌溶解作为分散相备用。精密量取15g甲苯、5g正辛烷、9gN－乙烯吡咯烷酮和15g二乙烯苯至小烧杯中，加入0.15g偶氮二异丁腈混匀后倒入三口烧瓶中，快速搅拌30min，加热至70℃冷凝回流，在1000r/min转速下搅拌反应12h后停止反应，用水和甲醇清洗产物，于80℃温度下真空干燥4h，得二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，该共聚物微球粒径大小为30-50μm。
二、离子液体合成：称取25g的N-甲基咪唑和26g的1-氯正辛烷于100mL烧瓶中，加热回流,10h，用热乙酸乙酯多次洗涤反应后的液体，弃去乙酸乙酯，70℃旋转蒸发，得到淡黄色粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐，备用；称取1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐35g，溶于200mL蒸馏水中，加入六氟磷酸钾48g，搅拌1h，分为两层，弃去上层后，用蒸馏水反复洗涤除去氯离子，在洗涤过离子液体的水中滴加0.1mol/L的硝酸银溶液，直到不产生白色沉淀，证明氯离子洗涤干净。在70℃温度下旋转蒸发去除水分，得到淡黄色粘稠液体。将该液体溶于200mL色谱纯甲醇中，加入活性炭脱色。取上清液过大孔树脂固相萃取柱，接收全部流出液，在70℃温度下旋转蒸发去除多余溶剂。得到无色透明粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，备用。
三、离子液体固载化：秤取干燥的二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球1.0g，加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体1.0g，甲醇12g，超声处理30min。在60℃温度下真空干燥2h，得到固相萃取填料。
该填料固相萃取柱装填：称取200mg固相萃取填料于注射式固相萃取套管中，压实填料，加盖玻璃纤维垫片，给套管加盖。得到黄曲霉毒素M1注射式超快速固相萃取柱。
按照实施例4的步骤1-步骤4处理不同浓度的加标样品，结果如表1，以验证该发明的可靠性及稳定性。黄曲霉毒素M1回收率为90.2～92.7％，固相萃取耗时1-2min，RSD％≤2％。
表1
Figure GDA0002590368790000061
实施例2
固相萃取填料的制作方法：
一、载体合成：向250ml三口烧瓶中加入70g蒸馏水和1g聚乙烯醇粉末充分搅拌溶解作为分散相备用。精密量取15g甲苯、5g正辛烷、9gN－乙烯吡咯烷酮和15g二乙烯苯至小烧杯中，加入0.15g偶氮二异丁腈混匀后倒入三口烧瓶中，快速搅拌25min，加热至65℃冷凝回流，在1000r/min转速下搅拌反应11.5h后停止反应，用水和甲醇清洗产物，于75℃温度下真空干燥3.5h，得二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，该共聚物微球粒径大小为30-50μm。
二、离子液体合成：称取25g的N-甲基咪唑和26g的1-氯正辛烷于100mL烧瓶中，加热回流,10h，用热乙酸乙酯多次洗涤反应后的液体，弃去乙酸乙酯，70℃旋转蒸发，得到淡黄色粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐，备用；称取1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐35g，溶于200mL蒸馏水中，加入六氟磷酸钾47g，搅拌1h，分为两层，弃去上层后，用蒸馏水反复洗涤除去氯离子，在洗涤过离子液体的水中滴加0.1mol/L的硝酸银溶液，直到不产生白色沉淀，证明氯离子洗涤干净。在65℃温度下旋转蒸发去除水分，得到淡黄色粘稠液体。将该液体溶于200mL色谱纯甲醇中，加入活性炭脱色。取上清液过大孔树脂固相萃取柱，接收全部流出液，在65℃温度下旋转蒸发去除多余溶剂。得到无色透明粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，备用。
三、离子液体固载化：秤取干燥的二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球1.0g，加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体0.8g，甲醇10g，超声处理25min，在55℃温度下真空干燥2h，得到固相萃取填料。
该填料固相萃取柱装填：称取200mg固相萃取填料于注射式固相萃取套管中，压实填料，加盖玻璃纤维垫片，给套管加盖。得到黄曲霉毒素M1注射式超快速固相萃取柱。
按照实施例4的步骤1-步骤4处理不同浓度的加标样品，结果如表2所示，以验证该发明的可靠性及稳定性。黄曲霉毒素M1回收率为90.0～93.0％，固相萃取耗时1-2min，RSD％≤2％。
表2
Figure GDA0002590368790000071
Figure GDA0002590368790000081
实施例3
固相萃取填料的制作方法：
一、载体合成：向250ml三口烧瓶中加入80g蒸馏水和1g聚乙烯醇粉末充分搅拌溶解作为分散相备用。精密量取15g甲苯、5g正辛烷、9gN－乙烯吡咯烷酮和15g二乙烯苯至小烧杯中，加入0.15g偶氮二异丁腈混匀后倒入三口烧瓶中，快速搅拌35min，加热至75℃冷凝回流，在1000r/min转速下搅拌反应12.5h后停止反应，用水和甲醇清洗产物，于85℃温度下真空干燥4.5h，得二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，该共聚物微球粒径大小为30-50μm。
二、离子液体合成：称取25g的N-甲基咪唑和26g的1-氯正辛烷于100mL烧瓶中，加热回流,10h，用热乙酸乙酯多次洗涤反应后的液体，弃去乙酸乙酯，70℃旋转蒸发，得到淡黄色粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐，备用；称取1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐35g，溶于200mL蒸馏水中，加入六氟磷酸钾50g，搅拌1h，分为两层，弃去上层后，用蒸馏水反复洗涤除去氯离子，在洗涤过离子液体的水中滴加0.1mol/L的硝酸银溶液，直到不产生白色沉淀，证明氯离子洗涤干净。在75℃温度下旋转蒸发去除水分，得到淡黄色粘稠液体。将该液体溶于200mL色谱纯甲醇中，加入活性炭脱色。取上清液过大孔树脂固相萃取柱，接收全部流出液，在75℃温度下旋转蒸发去除多余溶剂。得到无色透明粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，备用。
三、离子液体固载化：秤取干燥的二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球1g，加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体1.2g，甲醇15g，超声处理35min。在65℃温度下真空干燥2h，得到固相萃取填料。
按照实施例4的步骤1-步骤4处理不同浓度的加标样品，结果如表3所示，以验证该发明的可靠性及稳定性。黄曲霉毒素M1回收率为90.2～92.9％，固相萃取耗时1-2min，RSD％≤2％。
表3
Figure GDA0002590368790000091
实施例4
试剂准备：称取亚铁氰化钾16份，溶于84份蒸馏水中，得到蛋白沉淀剂(一)；称取乙酸锌22份，加入3份盐酸，溶于75份蒸馏水中，得到蛋白沉淀剂(二)；称取乙酸铵10份，溶于90分蒸馏水中，得到缓冲盐试剂。
利用该固相萃取柱萃取并检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1具体操作：
步骤1：样品处理，称取液态乳样品35g。加入5mL蛋白沉淀剂(一)，5ml蛋白沉淀剂(二)，充分摇匀后再加入5mL缓冲盐试剂，于5000r/min离心3min。得到沉淀和上清液，上清液待净化富集。称取发酵乳及固体乳粉、乳酪样品5g，加30mL水溶解，加入5mL蛋白沉淀剂(一)，5ml蛋白沉淀剂(二)，充分摇匀后再加入5mL缓冲盐试剂，于5000r/min离心3min。得到沉淀和上清液，上清液待净化富集。
步骤2：取本发明固相萃取柱，用注射器向萃取柱中加1mL蒸馏水，弃去流出液。用注射器向萃取柱中加入步骤1中得到的所有样品上清液，弃去流出液。控制上清液流出速度小于30mL/min。即单个样品上清液全部流出所需时间为1min。上清液全部留出后，用注射器加入5mL蒸馏水，弃去流出液，并通过10mL空气，将萃取柱中残留水吹出。再用注射器加入2mL甲醇，并通过5mL空气，吹出萃取柱中液体，收集所有流出液，将流出液定容至2.00mL。过0.45μm滤膜。进行高效液相色谱仪测定。
色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250mm分析柱；流动相：水+乙腈(v)＝60+40；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；激发波长：365nm，发射波长：425nm。色谱图见图2。其中，控制上清液流出速度小于30mL/min。即单个样品上清液全部流出所需时间为1min。是其他技术不能达到的。
步骤3：配制五个不同质量体积浓度的黄曲霉毒素M1标准溶液，该五个黄曲霉毒素M1质量体积浓度为1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；该五个不同质量体积浓度的黄曲霉毒素M1溶液作为系列标准溶液，将得到的黄曲霉毒素M1系列标准溶液于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定。
色谱柱：C18 4.6×250mm分析柱；流动相：流动相：水+乙腈(v)＝60+40；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；激发波长：265nm，发射波长：360nm。得到黄曲霉毒素M1标准色谱图，如图3所示同时得到系列标准溶液中黄曲霉毒素M1在该色谱条件下的出生时间，和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制黄曲霉毒素M1标准溶液的工作曲线；该标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限(3倍信噪比)、RSD％(n＝10)值见表4(标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、RSD％)所示：
表4
Figure GDA0002590368790000101
步骤4：根据步骤2测得的样品制备液的峰面积值，从步骤3绘制的系列黄曲霉毒素M1标准溶液的工作曲线上找到该峰面积值对应的黄曲霉毒素M1的含量，按下式计算待测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的含量X：
Figure GDA0002590368790000111
式中：X表示试样中的黄曲霉毒素M1含量，单位ng/g；C1表示步骤2测得的样品制备液的峰面积所对应的黄曲霉毒素M1的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中黄曲霉毒素M1的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，单位g；V表示步骤2中定容体积，单位mL。
《对比试验》
下面通过本方法与GB5009.24-2016和文献方法比较，突出该固相萃取柱在检测中的优越性：
(1)实验耗时对比：
国标方法GB5009.24-2016和大量文献方法中对黄曲霉毒素M1的样品前处理的提取过程都需要碳十八固相萃取柱或者免疫亲和柱。碳十八固相萃取柱或者免疫亲和柱流速为每分钟3到6mL，本发明固相萃取柱流速可以达到30mL/min；也就是说同样处理一份样品，其他固相萃取柱需要5-10min时间，本发明超快速固相萃取柱仅需要1-2min。
(2)稳定性实验对比：
按国标GB5009.24-2016和大量文献方法，RSD％均大于5％。而本发明实施例快速方法中RSD％≤2％左右。说明本发明方法具有很好的重现性和稳定性。
(3)回收率对比：
本发明实施例中黄曲霉毒素M1回收率为90.0～93.0％，该超快速固相萃取方法回收率高，而且稳定。本快速提取方法完全利用高效的萃取技术，更稳定，更快捷。

Claims (5)

1.一种利用固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1、取固相萃取柱，向固相萃取柱套筒中加1mL蒸馏水，弃去流出液；向萃取柱中加入处理样品的上清液，弃去流出液，控制上清液流出速度小于30mL/min；上清液全部留出后，加入5mL蒸馏水，弃去流出液，并通过10mL空气，将萃取柱中残留水吹出；再用注射器加入2mL甲醇，并通过5mL空气，吹出萃取柱中液体，收集所有流出液，将流出液定容至2.00mL，过0.45μm滤膜，进行高效液相色谱仪测定；
固相萃取柱的使用方法如下：M1样品液从固相萃取柱套筒的注射进样口端快速注射式上样，样品液带着杂质从固相萃取柱套筒的出液口快速流出；被检测物质M1富集在固相萃取混合填料上，洗脱液从固相萃取柱套筒的注射进样口快速注射式上样，洗脱液带着M1从固相萃取柱套筒的出液口快速流出；
填料采用以下方法制作；
该方法包括载体合成步骤和离子液体固载化步骤，下述步骤中原料的份数均指质量份数，
A、载体合成步骤如下：向三口烧瓶中加入70-80份的蒸馏水和1份聚乙烯醇粉末，充分搅拌溶解作为分散相备用；称取甲苯、正辛烷、Ｎ－乙烯吡咯烷酮和二乙烯苯至小烧杯中，加入偶氮二异丁腈混匀后倒入三口烧瓶中快速搅拌25-35min，加热至,65-75℃，冷凝回流，搅拌反应,11.5-12.5h后停止反应，用水和甲醇清洗产物，于75-85℃下，真空干燥3.5-4.5h，得二乙烯苯－Ｎ－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，该共聚物微球粒径大小为30-50μm；
B、离子液体固载化的步骤如下：秤取干燥的1份的二乙烯苯－Ｎ－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，加入0.8-1.2份的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，加入10-15份的甲醇，超声处理25-35min；于65-75℃下，真空干燥，得到固相萃取填料；
步骤2、配制黄曲霉毒素M1标准溶液，绘制黄曲霉毒素M1标准溶液的工作曲线；
步骤3、根据步骤2测得的样品制备液的峰面积值，从步骤3绘制的系列黄曲霉毒素M1标准溶液的工作曲线上找到该峰面积值对应的黄曲霉毒素M1的含量，计算待测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的含量。
2.根据权利要求1所述利用固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于：所述填料制作方法中步骤A中以下原料的具体质量份数为，15份甲苯、5份正辛烷、9份Ｎ－乙烯吡咯烷酮、15份二乙烯苯、0.15份偶氮二异丁腈。
3.根据权利要求1或2所述的利用固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于：所述填料制作方法中1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体的合成步骤如下，步骤中的份数均指质量份数，称取25份N-甲基咪唑和26份1-氯正辛烷于100 mL烧瓶中，加热回流10 h，用热乙酸乙酯多次洗涤反应后的液体，弃去乙酸乙酯，在70℃温度下旋转蒸发，得到淡黄色粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐，备用；称取1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐35份溶于200mL蒸馏水中，加入六氟磷酸钾47-50份，搅拌1h，分为两层，弃去上层后，用蒸馏水反复洗涤除去氯离子，在洗涤过离子液体的水中滴加0.1 mol/L的硝酸银溶液，直到不产生白色沉淀；65-75℃旋转蒸发去除水分，得到淡黄色粘稠液体；将该液体溶于200份色谱纯甲醇中，加入活性炭脱色；取上清液过大孔树脂固相萃取柱，接收全部流出液，65-75℃旋转蒸发去除多余溶剂；得到无色透明粘稠液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体。
4.根据权利要求3所述的利用固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于：所述样品由如下步骤处理，称取液态乳样品35g，加入5mL蛋白沉淀剂一，5ml蛋白沉淀剂二，充分摇匀后再加入5mL缓冲盐试剂，于5000r/min离心3min，得到沉淀和上清液；称取发酵乳及固体乳粉、乳酪样品5g，加30mL水溶解，加入5mL蛋白沉淀剂一，5ml蛋白沉淀剂二，充分摇匀后再加入5mL缓冲盐试剂，于5000r/min离心3min，得到沉淀和上清液。
5.根据权利要求4所述的利用固相萃取柱检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于：蛋白沉淀剂一由亚铁氰化钾16份，溶于84份蒸馏水中得到；蛋白沉淀剂二由乙酸锌22份，加入3份盐酸，溶于75份蒸馏水中得到；缓冲盐试剂由乙酸铵10份，溶于90分蒸馏水中得到。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111617514A (zh) * 2019-02-27 2020-09-04 中国水产科学研究院 一种上样体积可调的固相萃取柱
CN110180216B (zh) * 2019-06-11 2021-05-25 南京农业大学 一种超声波强化流化床式树脂吸附-解析提取纯化花色苷的方法及装置

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101809048A (zh) * 2007-02-09 2010-08-18 拓克西密特有限公司 黄曲霉毒素的固相萃取
CN102513064A (zh) * 2011-12-23 2012-06-27 广东工业大学 一种离子液体键合硅胶吸附剂的制备方法及其应用
CN103543221A (zh) * 2013-09-30 2014-01-29 王加启 同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法
CN104678039A (zh) * 2015-01-30 2015-06-03 湖南中烟工业有限责任公司 基于液相色谱-串联质谱联用同时测定烟草及烟草制品中四种黄曲霉毒素含量的方法
CN205360676U (zh) * 2016-01-29 2016-07-06 北京市理化分析测试中心 一种农药残留净化装置及其净化柱
CN105911157A (zh) * 2016-04-08 2016-08-31 云南健牛生物科技有限公司 一种快速检测食品中黄曲霉毒素的新方法
CN107233871A (zh) * 2017-07-18 2017-10-10 河南师范大学 氯甲基聚苯乙烯树脂固载1‑胺乙基‑3‑甲基咪唑溴盐固相萃取剂及其制备方法和应用
CN107456780A (zh) * 2017-08-07 2017-12-12 中国食品发酵工业研究院 一种用于食品中饱和烃类矿物油测定的固相萃取柱及其制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101809048A (zh) * 2007-02-09 2010-08-18 拓克西密特有限公司 黄曲霉毒素的固相萃取
CN102513064A (zh) * 2011-12-23 2012-06-27 广东工业大学 一种离子液体键合硅胶吸附剂的制备方法及其应用
CN103543221A (zh) * 2013-09-30 2014-01-29 王加启 同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法
CN104678039A (zh) * 2015-01-30 2015-06-03 湖南中烟工业有限责任公司 基于液相色谱-串联质谱联用同时测定烟草及烟草制品中四种黄曲霉毒素含量的方法
CN205360676U (zh) * 2016-01-29 2016-07-06 北京市理化分析测试中心 一种农药残留净化装置及其净化柱
CN105911157A (zh) * 2016-04-08 2016-08-31 云南健牛生物科技有限公司 一种快速检测食品中黄曲霉毒素的新方法
CN107233871A (zh) * 2017-07-18 2017-10-10 河南师范大学 氯甲基聚苯乙烯树脂固载1‑胺乙基‑3‑甲基咪唑溴盐固相萃取剂及其制备方法和应用
CN107456780A (zh) * 2017-08-07 2017-12-12 中国食品发酵工业研究院 一种用于食品中饱和烃类矿物油测定的固相萃取柱及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
亲水-亲油复合固相萃取填料的制备及其在食品安全检测中的应用;包建民;《色谱》;20130930;第825-830页 *
离子液体分散萃取技术在β-激动剂检测中的应用研究;洪霞;《肉类工业》;20161231;第28-30页 *

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