CN101809048A - 黄曲霉毒素的固相萃取 - Google Patents
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Abstract
从丙烯胺、亚甲双丙烯酰胺(MBAA)、丙烯酰胺、乙二醇甲基磷酸酯(EGMP)、4-乙烯基吡啶或2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)单体制备聚合物,该聚合物适合用于在黄曲霉毒素的固相萃取中结合黄曲霉毒素,和将黄曲霉毒素固定在固相萃取(SPE)盒中以对从食品或饲料提取的溶液中的黄曲霉毒素进行定性或定量分析。优选的实施例是含有丙烯酰胺基的聚合物,如丙烯酰胺和MBAA。聚合物最好是例如使用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)或二乙烯基苯(DVB)交联的和大孔性的(macroporous)。
Description
技术领域
本发明涉及适用于结合黄曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)的聚合物。该聚合物可用于黄曲霉毒素的固相萃取和将黄曲霉毒素固定在固相萃取(SPE)盒中以对从食品或饲料提取的溶液中的黄曲霉毒素进行定性或定量分析。
发明背景
各种各样的人类食品和动物饲料,其中包括食用坚果、油籽、谷物、草料和用它们生产的产品,很容易受到霉菌毒素的污染,这是霉菌的有毒代谢副产物,它们可能会在收获前和后在粮食和饲料作物中存在。其中最重要的是黄曲霉毒素,由霉菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一组密切相关的霉菌毒素。并非所有的霉菌隔离群都产生黄曲霉毒素,因此仅仅存在黄曲霉或寄生曲霉并不意味着黄曲霉毒素将在基体上存在。因此直接测量黄曲霉毒素水平是食品和饲料的质量控制的一个重要方面。
这种测量通常使用高效液相色谱法(HPLC)进行。然而,在高效液相色谱设备无法使用或不适于使用的情况下,通过薄层色谱法(TLC)来测定也是可行的。在TLC分离后,用发射波长366纳米的汞灯作为光源以激发荧光,可以使用商用扫描仪进行霉菌毒素测量,该荧光用光电倍增管检测和量化。对于定量检测,还有放射免疫检定技术和以免疫化学为基础的技术,如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。
在从食品样品中仪萃取法得到的溶液例如使用HPLC定量测定之前,可使用固相萃取对该溶液进行“清理”工序,以去除可能会干扰霉菌毒素的评估的化合物。
可以使用小型色谱柱(称为“微型柱”,mini-column)进行霉菌毒素的定量检测,其中在微型柱的矿物吸附剂内霉菌毒素被固定为一层。在紫外线光下观察微型柱,被固定的霉菌毒素会产生荧光。多种微型柱方法已经被采纳成为AOAC国际(官方分析化学家协会Association ofOfficial Analytical Communities)的正式测试。
WO 2006/123189描述了一种对固定在微型柱的层中的霉菌毒素进行定量荧光测定的装置,并且还提到了分子印迹聚合物和非分子印迹(空白)聚合物作为SPE盒中霉菌毒素吸附剂的用途。
WO 2003/101580公开了一种用于将霉菌毒素与固体载体结合的方法,其中包括利用霉菌毒素作为模板来准备分子印迹聚合物(MIP)。从所提到的霉菌毒素和功能单体的大批清单中,实际制备的一些MIP仅使用霉菌毒素脱氧萎镰菌醇(mycotoxins DON)和玉米赤霉烯酮(ZON)作为模板。对于DON的MIP以二乙氨乙基-甲基丙烯酸甲酯(DEAMA)、4-乙烯基吡啶(4-VP)或甲基丙烯酸(MAA)与作为交联剂的乙二醇-甲基丙烯酸酯(EDMA)或二乙烯基苯(DVP)聚合而成。对于ZON的MIP是用EDMA作为交联剂以三氟甲基丙烯酸(TFM)或4-VP聚合得到的。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用作对于黄曲霉毒素有选择性的SPE吸附剂的聚合物。
本发明是基于以下发现:含有酰胺、胺、吡啶、磷酸盐或磺酸盐部分的聚合物在用作SPE吸附剂时能够固定黄曲霉毒素。
因此从广义上看,本发明提供了含有酰胺、胺、吡啶、磷酸盐或磺酸基的聚合物作为SPE吸附剂以固定黄曲霉毒素的用途。
如果这种聚合物本身是新颖的,它们也形成本发明的另一个方面。
所述聚合物最好含有由丙烯酰胺基单体而来的部分,例如一种或多种亚甲双丙烯酰胺(MBBA)、丙烯酰胺或丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA),或它们的衍生物。
用于本发明的聚合物可通过常规聚合技术制备,不使用黄曲霉毒素或结构类似物作为模板(template)。所述聚合物优选被制备为大孔性的(macroporous),例如通过在聚合过程中使用致孔剂形成。
本发明的另一个方面是一种SPE吸附剂单元,包括装有或涂有上述聚合物的吸附剂层的柱、试管、棒、针、膜或平整表面。
本发明的另一个方面是一种黄曲霉毒素的荧光分析方法,包括以下步骤:将黄曲霉毒素吸附在装入或装在试管、盒、棒或平整表面中的所述聚合物上,使所固定的黄曲霉毒素曝露在紫外线光中,以及检测由所述固定的黄曲霉毒素发出的荧光。
可用于聚合物的制备并在聚合物中占有适当的部分的单体包括:丙烯胺;亚甲双丙烯酰胺(MBAA);丙烯酰胺,甲基丙烯酸磷酸乙二醇酯(EGMP);4-乙烯基吡啶和2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)。优选实施例是含有丙烯酰胺部分的聚合物,如丙烯酰胺和MBAA,它们特别有效。
优选地,所述功能单体与交联剂有效交联,所述交联剂不干扰与黄曲霉毒素的相互作用。合适的交联剂包括多元醇二丙烯酸酯,如乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)以及乙烯基苯(DVB)及其类似物。
附图说明
图1是根据本发明的SPE吸附剂盒的剖视图;
图2是图1的SPE吸附剂盒的一种变型的剖视图。
具体实施方式
包括含有酰胺、胺、吡啶、磷酸盐或磺酸盐部分的聚合物单元的聚合物是本发明的主要组成部分,它可以通过将含有酰胺、胺、吡啶、磷酸盐或磺酸盐部分(功能单体)的适当单体聚合而制备。
聚合物最好是作成多孔的,以增加可与黄曲霉毒素相互作用的表面积。多孔聚合物可在致孔剂存在下通过聚合功能单体和交联剂而制备,致孔剂即是可分散在单体中的物质,并在单体的反应后仍然分散在聚合物中,但可以在聚合物形成后被去除以在聚合物中形成孔。通常孔隙度的增加会导致表面积增大,这可用于使结合力达到最大。
通常情况下,一种合适的致孔剂在聚合反应过程中是惰性的。致孔剂可以是固体、液体或气体。固体或液体可以通过分解或溶解在一个合适的溶剂中而去除。通常情况下液体致孔剂可通过搅拌而在聚合物混合物中弥散,并可通过用合适的溶剂清洗聚合物而被去除。
当以上列出的功能单体与常用的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和二乙烯基苯(DVB)交联时,合适的致孔剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。也可以使用在实践中用于自由基引发聚合反应的乙腈、甲醇、甲苯、乙醇、甘油或其它溶剂。
功能单体与选定的交联剂之间的反应在适合反应的常规条件下进行。例如,列出的功能单体与交联剂乙二醇二甲基和二乙烯基苯的反应可在高温(即高于环境温度)下进行,或在低温条件下(即低于环境温度)在UV光照射下进行,或在合适的引发剂如1,1-偶氮(环己烷腈)存在时沉淀聚合。许多不同的自由基、原子转移、离子聚合的引发剂,也可用于制备适当的聚合物。
使用本领域技术人员已知的化学、UV或等离子体工艺,所述单体也可用于在珠子、膜或其它物品的表面上形成接枝聚合物。
在SPE聚合物中,源自功能单体的单位与来自交联剂的单位的比例可以从约5∶1到约1∶100。已发现在约1∶3至1∶20范围中的比例是特别有效的。例如,1∶4的比例在热聚合产生的聚合物中提供了有效的吸附剂,且1∶19的比例在低温UV聚合产生的聚合物中提供了有效的吸附剂。
虽然EGDMA和二乙烯基苯(DVB)是优选的交联剂,也可以使用其它的能够交联功能双丙烯酰胺聚合物的单体。该交联剂的反应活性最好与功能单体类似。适当的交联剂包括,但不仅限于,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA),三甲基丙烯酸酯(TRIM),二乙烯基苯(DVB)和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
本领域的技术人员能够选择一些适用于某一特定系统的其它单体和交联剂。
为在固定的黄曲霉毒素中供分析使用,最终的聚合物可装入或装在合适的用作SPE吸附剂单元的柱、试管、针、膜、棒或平整表面中,或与这些部件集成为一体。SPE吸附剂载体最好选择为不发荧光的材料,在这一点上看,其将不会对吸附的黄曲霉毒素的荧光检测造成干扰,或者其以可控的背景值发荧光。聚合物最好是粉末或预制的整块材料装入,如在市售的空SPE盒中所见的一样,其以一层靠在预制熔合物上,或作为一均匀层施加在棒、试管、针、膜或平整表面上。
图1所示为一个典型的单元。一个空的圆柱形SPE盒1(可从例如英国Poole的Supelco公司买到)具有一个喷出口2和在其入口的支持法兰3。该盒由塑料材料制造,具有合适的低荧光,且在黄曲霉毒素的受激发荧光的条件下理想地不发荧光。多孔熔合物4,最好是非荧光材料如聚四氟乙烯(PTFE),并且横过可以接近喷出口2的孔径。粉末形式的聚合物吸附剂装入盒中,形成聚合物层5。另一个保持熔合物6放在聚合物层5的上表面上。替代地,适当形状的多孔聚合物单体放在熔合物4的顶上。
在使用SPE单元时,从可能含有黄曲霉毒素的物质中提取的液体注入盒中,(自然地或通过抽吸)使其流过吸收层5,通过喷出口3流出该盒。样品中的任何黄曲霉毒素(如果有的话)被聚合物吸收,在熔合物6下面、在聚合物的上部区域中形成了一层或带。
通过将该单元插入到例如在WO 2006/123189中所述的分析荧光计中,这样形成的SPE吸附剂单元可用于定量分析所吸附的黄曲霉毒素,上述专利的全文在此引入作为参考。
在分析过程中为了降低背景荧光,在盒的表面上提供一个不透明的区或条是有用的,以覆盖正好在将出现所吸附的黄曲霉毒素的荧光带的区域之下的聚合物。该效果可由该盒的另一个不透明区或条得益增补,所述另一个不透明区或条正好在熔合物6或将出现荧光带的区域之上。
所述不透明区可以通过在装入聚合物后在盒上贴上胶纸而形成,如纸胶带或电气绝缘胶带,最好是黑色胶带。另外,胶带可在装入聚合物前施加,如果聚合物的上层高度可以准确地预测的话。
在以准确控制的条件装入聚合物的一个商业化工艺中,可以使用在制造过程中例如通过涂覆或喷洒不透明材料而形成不透明区的盒。
这种减少背景荧光的技术也适用于其它SPE盒,或前面提到的含有矿物吸附剂的微型柱,其中以吸附剂材料形成吸附化合物的荧光带。因此,它形成了本发明的另一个方面,与上述的本发明聚合物吸附剂的用途无关。
SPE吸附剂单元也可用于在HPLC或ELISA的定量分析之前清理样品。
任选地,该聚合物可用矿物油处理,以改善在聚合物上固定的黄曲霉毒素带的结合和荧光输出(见Piletska E.V.,Romero-Guerra M.,Guerreiro A.R.,Karim K.,Turner A.P.R,Piletsky S.A.(2005)Adaptationof the molecular imprinted polymers towards polar environment.(分子印迹聚合物对极地环境的适应)Anal.Chim.Acta,542,47-51。)
已发现以乙二醇二甲基丙烯酸酯或二乙烯基苯作为优选的交联剂、由亚甲基双丙烯酰胺的多孔聚合物制备的SPE吸附剂对固定黄曲霉素B1,B2,G1和G2是特别有效的。
在本发明的另一实施例中,如图2所示,另一聚合物层7可加到盒中SPE吸附剂上的熔合物6上。在需要时这可以用来向加入盒中的样品溶液提供额外的清理。
对于黄曲霉毒素,由二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯(DEAEM)为基的聚合物作为一个合适的额外清理层,已发现它可以成功去除取自落花生(花生)的样品中可能干扰的化合物。其它合适的清理材料和程序对于那些熟悉分析黄曲霉毒素的存在的人来说将是众所周知的。必须要小心以避免在清理样本时减少黄曲霉毒素的数量。
与上述用于定量分析的用途一样,本发明的SPE聚合物还可用作结合黄曲霉毒素的片或膜的用途,或用在如WO2006/120381所公开的传感器中。
此外已经发现,通过先用甲醇洗然后用水洗,可轻易地从聚合物中去除黄曲霉毒素。这可用来“再生”聚合物以供进一步使用,但在进行重要的定性或定量检测时不建议重复使用聚合物。
然而这意味着聚合物可作为将在荧光分析以外方法如色谱法中受到定量测定的样本的清理步骤。使从可能含有黄曲霉毒素的食品中提取的液体样品与聚合物接触,以吸附存在的任何黄曲霉毒素,而样品中存在的其它材料通过用合适的溶剂清洗而从聚合物中去除。然后黄曲霉毒素从聚合物中洗脱出,且用作对任何存在的黄曲霉毒素进行定量测定例如HPLC的清洁溶液。
本发明的实施方式从下面的实施例将得到进一步的理解。(所述聚合物的背景荧光的强度和所固定的黄曲霉毒素的荧光强度可由WO2006/120381中公开的传感器装置确定。)
例1聚合物的制备
通过搅拌功能单体亚甲双丙烯酰胺(MBAA),5g;交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),20g;致孔剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF),25克;和引发剂,1,1-偶氮(环己烷腈),500mg,来制备聚合混合物。使用Honle 100UV灯(强度0.157瓦/厘米2)(Honle UV公司,UK)照射该聚合混合物20分钟,然后在80℃的油浴中热退火12小时。用甲醇清洗以除去溶剂(DMF),由此产生的聚合物是一种大孔材料。由此产生的本体聚合物经研磨和在甲醇中湿筛。粒径范围为25至63μm的部分被收集和干燥。
制备之后,将75mg的聚合物加入到空的1ml无荧光塑料盒(Supelco公司,英国)中,该盒中装有无荧光的特氟隆(聚四氟乙烯PTFE)熔合物(Supelco公司,英国)。
例2在MBAA基聚合物上固定AFB1
通过加入2毫升水(例如HPLC级的水)预处理例1中制备的盒。将在4毫升甲醇中的黄曲霉毒素B1(AFB1)溶液(甲醇的浓度为从80%至20%,AFB1的浓度为从10至200ng)加入到盒中,以将黄曲霉毒素加到MBAA聚合物的层上。然后使用1毫升的20%甲醇(80∶20,水∶甲醇)清洗该盒,以去除干扰化合物。在MBAA聚合物层中固定的黄曲霉毒素层的存在,则通过利用WO2006/120381中公开的传感器装置观测到对UV光曝光所产生的荧光而显示。
在SPE盒顶部熔合物的正下方观察到一尖锐的荧光带。对MBAA基聚合物上AFB1的检测灵敏度是非常好的,特别是在被20%甲醇吸附时。
例3黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的固定
随后,在20%甲醇溶液中搀入100ng的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2毒素且加到例1中制备的各个盒中,随后用1毫升20%甲醇进行清洗。结果发现,所有毒素被吸附在非常相似的地方,接近顶部熔合物。
例4对玉米和花生基质中的MBAA聚合物的测试
将搀入20ng AFB1的花生基质装在按照例1制备的盒上。用1毫升20%的甲醇清洗所述装有样品的盒。通过利用WO2006/120381中公开的传感器装置观测到对UV光曝光所产生的荧光,表明在MBAA聚合物层中固定的AFB1层的存在。
例5用于去除干扰化合物的合并聚合物的盒
在按照例1制备的盒中加入一个二乙基氨基甲基丙烯酸酯(DEAEM)基聚合物的上聚合物层,以提供用于固定任何干扰化合物的清理层,同时使黄曲霉毒素能够到达MBAA基聚合物层。该DEAEM基聚合物层,有效地去除了很大一部分存在于落花生(花生)中的干扰成分。
例6对AMPSA基聚合物结合AFB1的测试
使用例1的方法,其中用AMPSA替换MBAA作为功能单体,制备聚合物盒。用2ml水清洗聚合物盒,且将4ml搀入200ngAFB1的80%甲醇装入盒中。接下来用2ml水清洗新的聚合物盒,且将4ml搀入200ng AFB1的20%甲醇装入盒中。
可以看到吸附在AMPSA基聚合物上的AFB1带。
例7对4-乙烯基吡啶基聚合物结合AFB1的测试
使用例1的方法制备聚合物盒,其中作为功能单体的MBAA更换为4-VP。用2ml水清洗聚合物盒,且将4ml搀有200ng AFB1的80%甲醇装入聚合物盒中。接下来用2ml水清洗聚合物盒,且将4ml搀有200ngAFB1的20%甲醇装入盒中。
4-VP基聚合物证明结合20%甲醇溶液中的AFB1。
例8对丙烯胺基聚合物结合AFB1的测试
使用例1的方法制备聚合物盒,其中作为功能单体的MBAA更换为丙烯胺。用2ml水清洗聚合物盒,且将4ml搀有200ng AFB1的80%甲醇装入聚合物盒中。接下来用2ml水清洗聚合物盒,且将4ml搀有200ng AFB1的20%甲醇装入盒中。
该丙烯胺基聚合物对80%和20%甲醇溶液都表现出一些结合。
例9对EGMP基聚合物结合AFB1的测试
使用例1的方法制备聚合物盒,其中作为功能单体的MBAA更换为EGMP。用2ml水清洗聚合物盒,将4ml搀入200ng AFB1的80%甲醇装入聚合物盒中。接下来用2ml水清洗聚合物盒,将4ml搀入200ngAFB1的20%甲醇装入盒中。
EGMP基聚合物表现出从20%甲醇对AFB1的结合。
例10对丙烯酰胺基聚合物结合AFB1的测试
丙烯酰胺聚合物表现出对AFB1的结合,但该结合弱于MBAA。带较小且位于层的中间。
例11矿物油处理
按照例1准备MBAA基聚合物盒。按以下步骤用矿物油处理聚合物:
-1毫升乙腈
-1毫升氯仿
-2毫升含有1%矿物油的氯仿
-1毫升氯仿
-1毫升乙腈
-2毫升水
在矿物油处理后,MBAA盒显示结合到被处理的聚合物上的AFB1的荧光增强了。
例12MBAA基盒的再生
按照例1准备的MBAA基聚合物盒在经过例2的测试后,按照以下步骤进行清洗,以供重新使用:
-4毫升纯甲醇
-4毫升水
该处理是足够的,以便彻底去除吸附在MBAA基聚合物上的AFB1和为下一次使用而准备盒。
例13用DVB作为交联剂制备的聚合物
按照例1准备MBAA基聚合物盒,但使用二乙烯基苯(DVB)作为交联剂,而不是EGDMA。将加有100ng AFB1的20%甲醇装在聚合物上。
结果发现,用DVB替换EGDMA对吸附在盒上的毒素没有造成任何明显变化。
例14MBAA聚合物在定量测定AFB1中的用途
按照例1准备五个盒,且增大被装在聚合物上的20%甲醇中的AFB1的含量,以便让盒装有分别包含0、10、20、50和100ng AFB1的荧光带。使用WO2006/120381中公开的传感器装置测量每个盒上固定的毒素的含量,在每个含量执行六个测量。在各个增大含量的平均读数为0.73、9.04、20.24、56.56和99.76ng,分别与4.41、3.38、2.64、2.47和1.63%的变化的系数相对应。
例15冰上的UV聚合(聚合物1)
为了调查聚合物形态的可能变化,采用弱紫外灯(光强度为0.015千瓦)进行聚合。聚合溶液保持在4℃(在冰上)。聚合进行了4小时。由于MBAA在DMF中的溶解度在较低的温度下较低,聚合物中的MBAA浓度由例1中热聚合制备的聚合物中的20%减至UV聚合中的5%。聚合混合物是:1克MBAA,19克EGDMA(95%交联),20克DMF,200mg引发剂1,1-偶氮(环己烷腈)。
使用甲醇(使用约100个周期)通过Soxhlet(索氏)提取从聚合物中去除DMF;和然后在真空中彻底干燥聚合物。由此产生的聚合物使用超离心磨机(Ultracentrifiuge Mill)(Retsch公司,英国)研磨,以获得尺寸更规则均匀的颗粒。一些粒度的部分被收集,其背景荧光的强度和对黄曲霉毒素B1的结合能力被评估。其中包括粒度为25-63μm,63-125μm和125-212μm的部分。
结果发现,所有的部分具有不同的背景荧光,其中最低的背景荧光由粒度为63-125μm和125-212μm的部分所提供(表1)。粒度为63-125μm的部分从所固定的黄曲霉毒素产生最强烈的荧光。
表1聚合物1的不同部分的性质和性能。
粒度 | 背景荧光 | 峰值高度 |
25-63μm | 80,000 | 10ngAFB1-45,000 |
63-125μm | 75,000 | 10ng AFB1-88,000 |
125-212μm | 75,000 | 10ng AFB1-70,000 |
将上述聚合物的性能与例1制备的其中包含20%MBAA的热聚合的聚合物进行比较。结果发现,UV聚合的聚合物产生了显着降低的背景荧光。虽然它减少了功能单体的数量(5%,与热聚合物情况下的20%相比),在盒顶部它在数量上将黄曲霉毒素结合成尖锐的带。
还与市售的SPE结合相吸附剂(Phenomenex公司的“Phenyl”(苯基))进行了背景荧光和对黄曲霉毒素的结合的比较。虽然“Phenyl”吸附剂的背景荧光明显小于UV聚合产生的MBAA聚合物,但MBAA聚合物强烈吸附黄曲霉毒素,成为聚合物盒顶部的一个高荧光带。
例16制备具有少量的溶剂(DMF)和5%MBAA的MBAA基聚合物(聚合物2)
为了进一步改变聚合物形态,聚合物被制备为只含有一半数量的溶剂(DMF)。所有其它条件仍然与例15相同。该聚合物被脱气、冷却并保持在冰上,并且用紫外(UV)光照射4小时以进行聚合。为了将5%MBAA溶解在减少溶剂的混合物中,有必要对混合物进行超超声处理30分钟。
表2.聚合物2的不同粒度的性质和性能。
粒度 | 背景荧光 | 峰值高度 |
25-63μm | 78,000 | 10ng AFB1-30,000 |
63-125μm | 80,000 | 10ng AFB1-80,000 |
125-212μm | >100,000 | - |
粒度为63-125μm的部分再次具有背景荧光和被固定的黄曲霉毒素的荧光强度的最佳组合;和表现出与聚合物1的相应部分类似的特点。
例17制备具有加倍数量的溶剂(DMF)和5%MBAA的MBAA基聚合物(聚合物3)
为了进一步改变聚合物形态,使用与例15相比加倍数量的溶剂(DMF)制备聚合物。所有其它条件仍然与例15相同。该聚合物被脱气、冷却并保持在冰上,并且用UV光照射4小时以进行聚合。由此产生的聚合物具有与聚合物1和2类似的背景强度,但只有不到一半的从固定的黄曲霉毒素发出的荧光。
例18在-20℃,1%MBAA条件下的UV聚合(聚合物4)
对进一步降低UV聚合时的温度的影响进行了测试。由于MBAA的溶解度在-20℃降低,其浓度降低到1%。所有其它参数保持不变。如前所述,对聚合物进行聚合和处理。虽然背景荧光略低于在+4℃制备的聚合物1-3,聚合物4提供了从固定的黄曲霉毒素发出的很小的荧光信号。
例19用三(乙二醇)二甲基丙烯酸酯交联剂和5%MBAA制备的MBAA基聚合物(聚合物5)
为了再次改变聚合物形态,采用不同的交联剂(三(乙二醇)二甲基丙烯酸酯,95%)制备聚合物5,其性能与采用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)作为交联剂制备的聚合物1相比较。背景荧光很低,而且所固定的黄曲霉毒素的荧光是相当高的。然而,聚合物5是柔性的,且可显著改变其体积,这取决于所吸附溶剂的数量。
例20使用不同的溶剂-DMSO(聚合物6)和甲苯(聚合物7)
使用不同的溶剂(分别是DMSO(二甲基亚砜)和甲苯)在冰上紫外光聚合4小时制作了两个聚合物(聚合物6和7)。MBAA在这些溶剂中的有限溶解度得到了只有1%的MBAA浓度。所有其它参数保持不变。聚合物6和7的背景荧光高且所固定的黄曲霉毒素产生了低的荧光。
例21经索氏(Soxhlet)清洗的聚合物1
5g聚合物1(5%MBAA;粒度为63-125μm的部分)在索氏提取器中用甲醇洗涤过夜(约100个周期的清洗)。上述清洗进一步通过减少聚合物的背景荧光而提高了聚合物的性能;且所固定的黄曲霉毒素的荧光强度与所吸附的毒素数量成比例。
例22将4ml 20%甲醇中的1ng AFB1与清洗后的聚合物1结合
对4毫升的20%甲醇中的低水平AFB1的结合进行了评价。当在4毫升20%甲醇中搀入1ng的AFB1和装在清洗后的聚合物1(粒度63-125μm的部分)上时,1ng的AFB1很容易被检测。
所有这些盒也使用WO2006/123189中的设备进行定量扫描。结果表明,UV聚合物的背景荧光是热聚合物的几乎一半,是“Phenyl”聚合物的大约两倍。
也可以在UV下得到SPE管的一个图象,该管包含吸附了100ng的黄曲霉毒素B1的UV聚合物的。可以看到,该聚合物对黄曲霉毒素具有较高的亲和力且黄曲霉毒素带位于紧接顶部熔合物的下方。
例23沉淀(precipitation)聚合
聚合混合物是:150mg MBAA,600mg EGDMA(95%交联),2g乙腈和30mg引发剂(偶氮二异丁腈(AIBN))。反应在被氮气流清洗的20ml矿物油中进行了15分钟。聚合物混合物还被氮气清洗5分钟和然后转送到矿物油中。使用匀浆器分散混合物15分钟,然后用光纤UV灯(Cermax公司,英国)照射2小时,之后用更强的UV灯(Honle公司,英国)照射20分钟。过滤珠子及用氯仿和丙酮洗涤以去除矿物油。虽然聚合物的背景荧光较低,且所固定的黄曲霉毒素发出较高的荧光,但聚合物的产量低。这一工艺还产生大量的废矿物油。
例24测量食品中的黄曲霉毒素
对使用选定的聚合物从食品基质(玉米和花生)中提取黄曲霉毒素进行了评价。在SPE管中装入75mg例15的MBAA基聚合物,且加入1ml的20%甲醇。在80%甲醇中的食品提取物被水稀释4倍,且搀入10ng的黄曲霉毒素B1。作为对照样本,用水稀释食品提取物4倍,不加入毒素。
当被固定在玉米或花生提取物的MBAA基聚合物上时,10ng的黄曲霉毒素容易被检测到。
例25聚合物盒的光学特性的改进
当使用WO2006/120381中公开的一种传感器测量装置测量时,由热聚合(例1)产生的MBAA基聚合物的背景荧光通过使用黑色薄胶带直接在被固定的毒素的上面或下面来掩盖背景荧光的发射,而显著地减少了。
使用光学改进的盒容易检测和测量10ng的黄曲霉毒素B1。
Claims (16)
1.含有由丙烯酰胺基单体而来的部分的聚合物作为黄曲霉毒素的固相萃取(SPE)吸附剂的用途。
2.根据权利要求1的用途,其中所述单体是一种或多种亚甲双丙烯酰胺(MBBA)、丙烯酰胺或丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)或它们的衍生物。
3.根据要求1或2的用途,其中所述丙烯酰胺基单体已通过共聚和反应与交联单体交联。
4.根据权利要求3的用途,其中交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)或二乙烯基苯(DVB)。
5.根据权利要求3或4的用途,其中所述丙烯酰胺单体与交联剂单体的单位比例是从1∶3到1∶20。
6.根据权利要求1至5中任何一项所述的用途,其中黄曲霉毒素包括一种或一种以上的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
7.根据权利要求1至6中任何一项所述的用途,其中聚合物及其上所吸收的黄曲霉毒素用作荧光分析方法的样品。
8.根据权利要求1至6中任何一项所述的用途,其中从聚合物洗脱出所吸收的黄曲霉毒素,和用作定量测定方法的样品。
9.根据权利要求1至8中任何一项所述的用途,其中所述聚合物在低于环境的温度下通过紫外线聚合反应获得。
10.根据权利要求1至9中任何一项所述的用途,其中通过去除在聚合时出现的致孔剂而使所述聚合物变成大孔性的。
11.由亚甲双丙烯酰胺(MBAA)、丙烯胺、甲基丙烯酸磷酸乙二醇酯(EGMP)、4-乙烯基吡啶或2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)的交联聚合物作为黄曲霉毒素的SPE吸附剂的用途。
12.一种SPE吸附剂单元,包括装有或涂有一层由丙烯酰胺基单体而来的聚合物吸附剂的试管、盒、针、膜、棒或平整表面。
13.根据要求12的单元,其中所述单元是一个具有聚合物吸附剂内层的盒或试管,且在该单元的外表面上、在聚合物层的上表面以上和以下的一个区域是不透明的。
14.一种黄曲霉毒素的荧光分析方法,所述方法包括以下步骤:将黄曲霉毒素吸附在装入或装在试管、盒、针、膜、棒或平整表面上的由丙烯酰胺基单体而来的聚合物上,使所固定的黄曲霉毒素曝露在紫外光中,以及检测由固定的黄曲霉毒素发出的荧光。
15.根据权利要求14的方法,其中所述黄曲霉毒素包括一种或一种以上的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
16.一种在定量测定黄曲霉毒素之前的清理方法,其中使样本液体与由装入或装在试管、盒、棒、针、膜或平表面上的丙烯酰胺基单体而来的聚合物接触,以吸附存在的任何黄曲霉毒素,并从所述聚合物洗脱出黄曲霉毒素以对存在的任何黄曲霉毒素进行定量测定。
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