FR2914066A1 - Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant - Google Patents

Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant Download PDF

Info

Publication number
FR2914066A1
FR2914066A1 FR0753941A FR0753941A FR2914066A1 FR 2914066 A1 FR2914066 A1 FR 2914066A1 FR 0753941 A FR0753941 A FR 0753941A FR 0753941 A FR0753941 A FR 0753941A FR 2914066 A1 FR2914066 A1 FR 2914066A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
target molecule
marker
molecular
polymer
mip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR0753941A
Other languages
English (en)
Other versions
FR2914066B1 (fr
Inventor
Celine Perollier
Kaynoush Naraghi
Sami Bayoudh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
POLYINTELL SARL
Original Assignee
POLYINTELL SARL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by POLYINTELL SARL filed Critical POLYINTELL SARL
Priority to FR0753941A priority Critical patent/FR2914066B1/fr
Priority to EP08775729A priority patent/EP2125195A2/fr
Priority to US12/532,288 priority patent/US20100105076A1/en
Priority to PCT/FR2008/050487 priority patent/WO2008132384A2/fr
Publication of FR2914066A1 publication Critical patent/FR2914066A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR2914066B1 publication Critical patent/FR2914066B1/fr
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/268—Polymers created by use of a template, e.g. molecularly imprinted polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • G01N33/9413—Dopamine
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2600/00—Assays involving molecular imprinted polymers/polymers created around a molecular template
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
    • Y10T436/144444—Glucose
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/145555—Hetero-N
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y10T436/173845—Amine and quaternary ammonium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement identiques ou différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s), et au moins un marqueur, ledit marqueur étant apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (ii) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s).

Description

La présente invention se rapporte au domaine des polymères à empreintes
moléculaires (encore appelés molecularly imprinted polymers ou MIPs en langue anglaise) utiles pour la reconnaissance de molécules cibles. Elle concerne plus particulièrement un kit d'analyse d'au moins une molécule 5 cible, ou d'une famille de molécules cibles, comprenant au moins deux MIPs et au moins un marqueur, ainsi qu'un procédé d'analyse utilisant un tel kit. La détection et la détermination de la concentration d'un analyte présent dans un milieu complexe et/ou présent à l'état de trace dans un échantillon, nécessitent généralement des procédés requérant encore de nos jours de fastidieuses étapes de 10 purification et/ou d'enrichissement, ainsi que l'utilisation de détecteurs très élaborés, à l'image par exemple des spectromètres de masse. Qui plus est, les procédés utilisés jusqu'à présent pour ces traitements manquent le plus souvent de spécificité. De plus, l'étape de détection fait classiquement intervenir des composés non stables chimiquement ou mécaniquement, qui ne peuvent pas 15 être réutilisés, et présente de surcroît généralement des temps d'analyse très longs. De ce fait, ces procédés induisent fréquemment une perte de temps et/ou une augmentation de l'incertitude sur le résultat. L'analyse de tels analytes peut toutefois être facilitée en effectuant, préalablement à la détection à proprement parler, un prétraitement convenable du milieu 20 complexe ou de l'échantillon. Ainsi, lorsque l'analyte est présent dans un milieu complexe tel par exemple l'urine, qui comprend de nombreuses entités annexes susceptibles de perturber la mesure, ou encore lorsque l'analyte n'est présent qu'à l'état de trace dans un échantillon et que sa détection est alors difficile, il peut être nécessaire de procéder, dans une première étape, à une extraction dudit analyte. 25 Il est notamment déjà connu de faire appel à des techniques d'extraction de type séparation en phase solide (encore appelées solid phase extraction ou SPE en langue anglaise) pour concentrer, avant analyse, des analytes d'intérêt présents dans des échantillons liquides. A cet effet, on connaît déjà en particulier l'utilisation de MIPs pour la mise en 30 oeuvre d'extractions de type SPE. Les MIPs sont en effet avantageux de par leur forte spécificité et leur excellente stabilité chimique, mécanique et thermique. Ils sont en outre connus pour être facilement synthétisables et peu onéreux si l'entité patron est disponible à faible coût. Ainsi que rapporté dans Ohnmacht C.M., Chiel J.E., Hage D.S. Anal. Chem. 2006, 78, 7547-7556, l'utilisation de MIPs dans un procédé d'extraction en phase solide permet ainsi d'obtenir avantageusement, et en une seule étape, un extrait enrichi en un analyte donné. Par ailleurs, il est également déjà connu de détecter, voire de déterminer la concentration d'un analyte par des méthodes d'analyse mettant en oeuvre des MIPs. Ainsi, les MIPs peuvent par exemple être utilisés dans des tests de type radioimmunoanalyse, dans lesquels lesdits MIPs se substituent aux anticorps et dans lesquels ils peuvent, au même titre que les anticorps, être pourvus de marqueurs susceptibles d'être mis en compétition avec des analytes d'intérêt. De telles méthodes d'analyse sont notamment décrites dans la revue Molecularly imprinted polymers in pseudoimmunoassay de Richard J. Ansell, Journal of Chromatography B, 804 (2004) 151-155.
L'utilisation de MIPs dans des méthodes d'analyse de ce type présente de nombreux avantages, comme par exemple celui de mettre en oeuvre des composés plus stables que les anticorps, pouvant être utilisés à la fois dans des milieux aqueux et des milieux non aqueux, et ne nécessitant pas de couplage de l'analyte (dans le cas de petites molécules), ni l'utilisation d'animaux de laboratoire pour leur production. C'est pourquoi les MIPs remplacent progressivement les anticorps dans de nombreux domaines d'analyse. Il est enfin également déjà connu d'utiliser plusieurs MIPs, identiques ou différents, dans des procédés comprenant une première étape de pré-traitement suivie d'une seconde étape de détection d'analytes d'intérêt. Ainsi, Chianella et al. décrivent déjà l'utilisation d'un même MIP pour procéder, d'une part, à la concentration en molécule cible de l'échantillon à analyser par SPE, et d'autre part, à l'analyse consécutive de ladite molécule cible. La détection de la molécule cible est basée dans ce document sur l'utilisation d'un capteur piézoélectrique revêtu sur la surface du même MIP que celui utilisé pour l'étape de concentration SPE. La détection s'effectue alors par mesure de la fréquence, qui est proportionnelle à la masse en molécule cible (Chianella I., Piletsky S.A., Tothill I.E., Chen B. Turner A.P.F., Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18, 119-127).
Le procédé décrit dans ce document est toutefois difficile à mettre en oeuvre pour un usage courant dans la mesure où il requiert l'utilisation de capteurs piézoélectriques uniquement manipulables par du personnel fortement qualifié. Le document US 6 461 873 enseigne quant à lui la mise en oeuvre de deux MIPs distincts pour l'analyse de la caféine contenue dans une boisson. Le procédé décrit dans ce document comprend tout d'abord une première étape au cours de laquelle le premier MIP absorbe les interférents présents dans la boisson à analyser. Cette première étape a pour objet d'améliorer la mise en oeuvre de la seconde étape, dédiée pour sa part à la détection de la caféine à proprement parler via l'utilisation d'un deuxième MIP absorbant spécifiquement celle-ci. Le procédé décrit dans ce document est toutefois limité de part le format et la nature physique du dispositif, aux tests de chromatographie sur bandes. Ce format ne permet pas par ailleurs un enrichissement conséquent de l'analyte, dans l'hypothèse où celui-ci serait, par exemple, présent à l'état de trace dans 15 l'échantillon analysé. Qui plus est, dans la mesure où le premier MIP utilisé est destiné à reconnaître spécifiquement les interférents, l'étape de pré-traitement décrite dans ce document requiert que ces derniers aient été identifiés. Ainsi, le procédé selon cet enseignement ne permet donc pas l'analyse d'analytes mis en oeuvre dans des milieux trop complexes. 20 Par conséquent, il demeure un besoin d'un kit d'analyse d'utilisation simple et rapide permettant de détecter, voire de déterminer en outre la concentration, d'un analyte présent dans un milieu complexe ou présent à l'état de trace dans un échantillon. Il existe également un besoin d'un kit d'analyse utile pour détecter des analytes dénués de groupements facilement détectables, à l'image par exemple de 25 chromophores ou de fluorophores. Il demeure aussi un besoin d'un kit d'analyse de sensibilité améliorée, permettant notamment la détection et la détermination de la concentration d'analytes présents en de très faibles concentrations dans un échantillon. Les inventeurs ont précisément découvert que l'utilisation d'un kit d'analyse 30 comprenant au moins deux MIPs et au moins un marqueur spécifique permettait de répondre à ces besoins.
Ainsi, la présente invention concerne, selon un de ses aspects, un kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement identiques ou différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s), et au moins un marqueur, ledit marqueur étant apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (ii) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s).
En d'autres termes, la présente invention a pour objet de mettre à la disposition des utilisateurs un kit d'analyse offrant les moyens de réaliser des analyses ciblées, et qui soit modulable tant du point de vue de sa conception que du point de vue de son utilisation, comme cela apparaît clairement à la lecture de ce qui suit. En particulier, la large gamme de MIPs synthétisables (en terme de polarité, d'hydrophobicité, de densités de sites, de propriétés magnétiques et physico-chimiques, par exemple), les différentes conditions d'utilisation envisageables (en terme de pH, de salinité, de température, de débit, de pression ou de polarité des solvants, par exemple), les multiples marqueurs utilisables, et les divers supports disponibles sont autant de paramètres qu'il est possible de sélectionner, voire d'ajuster en fonction des besoins de l'utilisateur, et notamment en fonction de la nature de la (ou des) molécule(s) cible(s), ainsi que selon l'application visée (sensibilité de la détection, sélectivité limitée par exemple à une molécule cible particulière ou au contraire élargie à une famille de molécules cibles). Selon l'application visée, il est ainsi en particulier possible de moduler le kit via le choix du marqueur, et notamment d'adapter l'affinité de celui-ci pour les sites de reconnaissance du deuxième MIP en fonction de la sensibilité et/ou de la sélectivité recherchée(s). En effet, un marqueur présentant une forte affinité avec ces sites de reconnaissance ne pourra être déplacé que par une molécule cible particulière, tandis qu'un marqueur présentant une affinité plus faible pourra être déplacé plus facilement, par exemple par une famille de molécules cibles, voire par une faible concentration en une molécule cible particulière.
Ces différents choix, et notamment l'adaptation de l'affinité relative du deuxième MIP pour la (ou les) molécule(s) cible(s) et pour le marqueur, permettent de disposer d'un kit modulable, tant dans sa spécificité que dans sa sensibilité. Une telle adaptation peut en particulier être avantageuse pour aboutir, par exemple lors d'une étape de pré-traitement, à une sélectivité optimale, à savoir telle que les entités interférentes présentes initialement dans la solution à analyser soient, le cas échéant, éliminées, tout en conservant dans la solution pré- traitée la (ou les) molécule(s) cible(s), et procéder ainsi à une purification et éventuellement à un enrichissement en molécule(s) cible(s).
L'invention a également pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins une étape d'utilisation d'un kit selon l'invention. Elle concerne aussi, selon un autre de ses aspects, l'utilisation d'un kit selon l'invention pour l'analyse de médicaments, de polluants, de produits chimiques, de contaminants, et analogues.
Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par : - molécule cible ou analyte , toute entité que l'on souhaite détecter (c'est-à-dire dont on souhaite mettre en évidence la présence) et/ou dont on souhaite 20 déterminer la concentration dans un échantillon donné, - marqueur , toute entité chimique, et par exemple tout molécule proche en structure et/ou en affinité de la (ou des) molécule(s) cible(s), par colorimétrie visible comme par exemple détectable par l'oeil nu, par radiochimie, par médecine nucléaire comme par exemple par scintigraphie, par imagerie, par résonance (IRM), par rayons X, 25 par diffusion de lumière, par spectrométrie de masse, par spectroscopie, comme par exemple par fluorescence ou par UV-visible, par ultrasons, par radioactivité, par réfractométrie, par détections optique, piézoélectrique, acoustique, par électrochimie, par conductivité, par pH métrie ou encore par voie biologique, - site de reconnaissance , la cavité de la matrice du MIP qui intervient 30 effectivement dans la reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), - milieu complexe , un milieu comprenant, outre la (ou les) molécule(s) cible(s), une ou plusieurs autres entités annexes dont certaines au moins sont susceptibles d'interférer avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) lors d'au moins une des étapes de l'analyse (étape de pré-traitement et/ou étape de détection), et de perturber l'interprétation des résultats. A titre d'exemples de milieux complexes selon l'invention, on peut notamment citer les fluides corporels tels que le sang, le plasma, la salive, l'urine, la bile, les larmes, le lait maternel, ou encore des milieux de culture, des lysats cellulaires, des extraits de plantes, des aliments, des milieux environnementaux (sol, eau, air), des boissons tel que le lait, les jus de fruits, la bière, ou encore des milieux gazeux. - état de trace , toute concentration comprise entre 1 ng/L et 10 mg/L, notamment entre 5 ng/L et 1 g/L, de préférence entre 10 ng/L et 500 ng/L. La figure 1 représente, sous forme d'un schéma bloc, les différentes étapes du procédé d'analyse selon l'invention. La figure 2 illustre la mise en oeuvre de l'étape de détection du procédé selon l'invention, selon le mode de réalisation particulier dans lequel le deuxième polymère à empreintes moléculaire est conditionné dans une cartouche SPE et la molécule cible est la dopamine et le marqueur est détectable à l'oeil nu, conformément aux exemples. La figure 3 est un graphe indiquant les quantités de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine obtenues dans les différentes fractions de 1 ml de MeOH percolées sur les cartouches SPE témoin et révélateur décrites dans l'exemple 6, Essai B. Il est entendu que les MIPs du kit selon l'invention peuvent être destinés à reconnaître plusieurs molécules cibles suivant l'utilisation visée. Ainsi, sauf indications contraires, l'invention n'est pas limitée aux seuls modes de réalisation où les propriétés de reconnaissance visent une seule molécule cible.
En particulier, selon un mode de réalisation, le kit conforme à l'invention peut être destiné à l'analyse d'une famille de molécules cibles, c'est-à-dire à l'analyse d'un ensemble de molécules différentes susceptibles d'être détectées par un même site de reconnaissance d'un MIP et possédant par exemple une analogie de structure et/ou un arrangement donné et commun de groupements fonctionnels.
Bien entendu, selon l'application visée, et notamment selon la sélectivité requise, la famille de molécules cibles susceptibles d'être analysées peut comprendre un ensemble plus ou moins large de molécules différentes.
KIT D'ANALYSE Le kit d'analyse selon l'invention comprend au moins deux MIPs, chimiquement identiques ou différents, présentant au moins des sites de reconnaissance aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) (appelés également sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) ). Au moins un polymère à empreintes moléculaires (appelé premier MIP dans la suite) peut être destiné à une étape de pré-traitement de l'échantillon, comme par exemple à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), par reconnaissance moléculaire de la (ou des) molécule(s) cible(s).
Par extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s) par reconnaissance moléculaire de la (ou des) molécule(s) cible(s) s'entend au sens de l'invention une étape au cours de laquelle l'interaction de la (ou des) molécule(s) cible(s) avec les sites de reconnaissance d'un MIP est suffisante pour conduire à la formation d'un complexe composé du MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance, de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s). En conséquence, les sites de reconnaissances du premier MIP, et notamment ses sites de reconnaissances de la (ou des) molécule(s) cible(s), peuvent être initialement en partie, voire même de préférence en totalité, vacants. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, l'ensemble des sites de 20 reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du premier MIP du kit selon l'invention est vacant. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'ensemble des sites de reconnaissance du premier MIP du kit selon l'invention est vacant. Le premier MIP peut ainsi permettre, selon un mode de réalisation de 25 l'invention et après libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s), l'obtention d'une solution purifiée, voire enrichie en la (ou les) molécule(s) cible(s). Par libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) s'entend au sens de l'invention une étape au cours de laquelle le complexe formé lors de l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s) par reconnaissance moléculaire de la (ou des) 30 molécule(s) cible(s) se dissocie, par exemple suite à une modification des conditions de pH, de salinité, de température, de débit, de pression, ou de polarité des solvants, conduisant à la présence de la (ou des) molécule(s) cible(s) sous une forme libre en solution. Au moins un autre polymère à empreintes moléculaires (appelé deuxième MIP dans la suite) de nature chimique identique ou différente du premier polymère à empreintes moléculaires, peut, lorsqu'il est doté dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur, être destiné à la détection, voire à la détermination de la concentration, de la (ou des) molécules(s) cible(s), comme décrit ci-après. Lorsque le premier et le deuxième MIPs sont chimiquement identiques, il s'entend, dans le cadre de la présente invention, qu'ils doivent être conditionnés séparément. Selon l'invention, au moins le marqueur et le deuxième polymère à empreintes moléculaires peuvent être conditionnés séparément, par exemple dans deux compartiments distincts.
Dans ce cas, l'utilisateur met en contact le marqueur avec le deuxième MIP, de sorte que le marqueur interagisse avec les sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) dudit deuxième MIP, préalablement à la mise en contact avec le deuxième MIP, de la solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s). Alternativement, au moins le marqueur et le deuxième polymère à empreintes moléculaires peuvent être conditionnés ensemble de telle sorte que le deuxième polymère à empreintes moléculaires soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur. Dans ces deux cas, le marqueur doit être apte à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la ou des) molécule(s) cible(s)du deuxième MIP, et être également apte à être déplacé par la (ou les) molécule(s) cible(s) de tout ou partie de ces sites lorsque le deuxième MIP est mis en présence de la (ou des) molécule(s) cible(s). Bien entendu, le marqueur ne pourra être déplacé de ces sites par la (ou les) molécule(s) cible(s) que si les conditions de mises en présence du deuxième MIP doté dudit marqueur avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) sont propices à l'interaction de (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) avec les sites de reconnaissance dudit deuxième MIP.
Le deuxième MIP peut également présenter en plus des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), d'autres sites de reconnaissance différents, susceptibles d'interagir également chacun avec au moins un marqueur selon l'invention. Ces autres sites de reconnaissance peuvent ainsi permettre de détecter, voire de déterminer la concentration, d'autres types de molécules cibles dans les mêmes conditions d'utilisation ou dans des conditions d'utilisation différentes. Le marqueur doit donc présenter une plus faible affinité pour ces sites de reconnaissance que la (ou les) molécule(s) cible(s) polymériques, dans les conditions d'utilisation du deuxième MIP.
Ainsi, lorsque le deuxième MIP selon l'invention est doté dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur, et est mis alors en présence d'une solution comprenant la (ou les) molécule(s) cible(s), ledit marqueur doit être déplacé des sites de reconnaissance dudit deuxième MIP par la (ou les) molécule(s) cible(s) et être ainsi substitué par la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) : on parle d'un déplacement compétitif du marqueur par la (ou les) molécule(s) cible(s). Ce déplacement compétitif a pour conséquence le relargage (c'est-à-dire la libération dans le milieu d'analyse, sous forme libre) du marqueur, qui peut être détecté par toute méthode convenant à la détection du marqueur. Le marqueur peut notamment être détecté, par exemple après relargage, par colorimétrie visible comme par exemple à l'oeil nu, par radiochimie, par médecine nucléaire comme par exemple par scintigraphie, par imagerie, par résonance (IRM), par rayons X, par diffusion de lumière, par spectrométrie de masse, par spectroscopie, comme par exemple par fluorescence ou par UV-visible, par ultrasons, par radioactivité, par réfractométrie, par détections optique, piézoélectrique, acoustique, par électrochimie, par conductivité, par pH métrie, ou encore par voie biologique, et de préférence par l'oeil nu. La présente invention comprend le cas où la détection est différente suivant que le marqueur est sous forme libre, par exemple après relargage, ou encore présent dans les sites de reconnaissance du MIP. Selon un mode de réalisation, chaque site de reconnaissance de la (ou des) 30 molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires peut interagir avec un seul marqueur, notamment une seule molécule de marqueur.
Selon un autre mode de réalisation, chaque site de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires peut interagir avec plusieurs marqueurs, notamment plusieurs molécules de marqueur.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les premier et deuxième polymères à empreintes moléculaires peuvent être identiques en terme de nature chimique. En particulier, lorsque le deuxième polymère à empreintes moléculaires et le marqueur sont conditionnés ensemble de telle sorte que le deuxième polymère à empreintes moléculaires soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur, les premiers et deuxième polymères à empreintes moléculaires peuvent se différencier uniquement par la présence dudit marqueur dans tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le deuxième polymère à 15 empreintes moléculaires peut être de nature chimique différente du premier polymère à empreintes moléculaires. Il peut être en effet avantageux de sélectionner les premier et deuxième MIPs de sorte à ce qu'ils présentent des affinités différentes pour la (ou les) molécule(s) cible(s), et en particulier des affinités optimisées en fonction de leur condition d'utilisation 20 respective. Une telle optimisation de la reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) pour chaque étape de l'analyse peut ainsi permettre de cibler par exemple le plus efficacement possible la molécule cible lors des étapes de pré-traitement et de détection.
Les premier et deuxième MIPs peuvent être mis en oeuvre sur tout support 25 approprié. Par support , s'entend très largement, au sens de l'invention, tout substrat solide, flexible ou rigide, sur ou dans lequel les MIPs sont susceptibles d'être liés, collés, déposés, synthétisés in-situ, remplis et/ ou conditionnés. Les supports utilisables selon l'invention peuvent être de toute nature, comme 30 par exemple de nature biologique, non biologique, organique, inorganique, ou encore une de leur combinaison. Ils peuvent se présenter sous toute forme, et notamment prendre la forme de particules, de gels, de feuilles, de tubes, de sphères, de capillaires, de points, de films, de puits, de toute taille et de toute forme. Ils peuvent par exemple se présenter sous la forme de particules de taille homogène, notamment comprise entre 10 nm et 10 mm, par exemple entre 100 nm et 1 mm, notamment entre 1 m et 100 m, de préférence entre 25 et 45 m susceptibles d'être par suite conditionnées sous forme de cartouche. De manière générale, les premier et deuxième MIPs peuvent par exemple être mis en oeuvre sur ou dans un support choisi parmi une cartouche SPE, une plaque multipuits, comme par exemple une plaque à 96 puits, un patch, un sachet de thé ( tea bag en langue anglaise), un microtube, une colonne HPLC, une bandelette, des puces, des lames, des plaques de silice, des couches minces, une surface poreuse, une surface non poreuse, un système microfluidique. Selon un mode de réalisation, le procédé d'analyse selon l'invention peut éventuellement comprendre en outre une étape de conditionnement du premier polymère à empreintes moléculaires préalablement aux étapes de pré-traitement (i) et (ii) décrites ci-après et/ou une étape de conditionnement du deuxième polymère à empreintes moléculaires préalablement aux étapes de détection (iii) et (iv) décrites ci-après. Selon un mode de réalisation de l'invention, le premier polymère à empreintes moléculaires peut être mis en oeuvre sur une colonne d'extraction, par exemple une cartouche SPE. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le deuxième polymère à empreintes moléculaires peut être mis en oeuvre sur une cartouche SPE, éventuellement graduée. La figure 2 illustre cet aspect de l'invention lorsque le marqueur est détectable 25 à l'oeil nu. Le kit selon l'invention peut par exemple se présenter sous la forme d'un ensemble de conditionnement, comprenant au moins une cartouche SPE contenant le premier MIP qui permettra le chargement, le lavage puis l'élution pour récupérer la (ou les) molécule(s) cible(s) sous forme libre et au moins une cartouche SPE contenant le 30 deuxième MIP avec au moins un type de sites de reconnaissance contenant au moins un marqueur apte à être déplacé par la (ou les) molécule(s) cible(s).
Grâce à la grande variété de choix sur la nature des deux MIPs, sur la nature du marqueur, ou encore sur les conditions d'utilisation, il est possible de moduler le kit d'analyse selon l'invention dans une très large mesure, et de l'adapter aux applications visées.
Avantageusement, et comme indiqué précédemment, les MIPs peuvent notamment être optimisées de sorte à obtenir les meilleures propriétés de reconnaissance pour chacune des étapes de l'analyse (pré-traitement et détection), selon l'affinité de la (ou des) molécules cibles et, le cas échéant, du marqueur, à leur encontre.
Au sens de l'invention, le terme affinité désigne l'aptitude d'une entité (par exemple une molécule cible ou encore un marqueur) à interagir avec un site de reconnaissance d'un MIP. Une forte affinité traduit ainsi, au sens de l'invention, une forte aptitude pour cette entité à interagir, avec au moins un site de reconnaissance d'un MIP. Par interaction s'entend, au sens de l'invention, la formation de liaisons faibles (par exemple de type liaisons de Van der Waals, liaisons hydrogène, liaisons pi donneur-pi accepteur, ou interactions hydrophobiques) et/ou de liaisons fortes (par exemple de type liaisons ioniques, liaisons covalentes, ou encore liaisons iono-covalentes, liaisons de coordination et liaisons datives). Il est entendu que l'interaction qui se manifeste lors de la préparation du MIP 20 peut être différente de celle qui se manifeste lors de son utilisation. Par exemple, il peut s'agir d'une interaction covalente labile lors de sa fabrication et d'une interaction de type ionique et hydrogène lors de son utilisation. L'affinité d'une entité pour un site de reconnaissance d'un MIP peut être évaluée en mesurant expérimentalement le facteur de capacité de ce site vis-à-vis de cette 25entité, par exemple en effectuant une analyse chromatographique de l'entité dont on souhaite déterminer l'affinité à travers une phase stationnaire comprenant au moins les sites de reconnaissance du MIP envers lesquels on souhaite déterminer l'affinité de ladite entité. Le facteur de capacité k' de ces sites de reconnaissance correspond selon 30 ce protocole au rapport du temps passé par cette entité dans la phase stationnaire, par rapport au temps passé par cette même entité dans la phase mobile. Il peut être déterminé expérimentalement par le rapport : k'=tr ù tm tm dans lequel tr désigne le temps de rétention, et tm le temps mort. Le facteur de capacité rend toutefois compte non seulement des interactions spécifiques de reconnaissance moléculaire entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et les sites de reconnaissance du MIP, mais aussi des interactions non spécifiques entre la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) et le matériau dont est constitué ledit MIP. Aussi, on utilise fréquemment le facteur d'empreinte (encore appelé imprinting factor ou IF en langue anglaise) qui correspond au rapport du facteur de capacité du MIP (i) sur le facteur de capacité du matériau dont est constitué ledit MIP (i) autrement nommé polymère non imprimé IF = k' MIP (i) k' polymère non imprimé (i) Le facteur d'empreinte rend ainsi compte de l'efficacité d'un MIP en terme de reconnaissance moléculaire, indépendamment de la nature chimique de sa matrice polymérique.
Bien évidemment, l'affinité dépend à la fois de l'entité et du MIP, mais elle varie également en fonction des conditions d'utilisation. Elle peut ainsi varier en particulier avec le milieu solvatant, et dépendre notamment des conditions de pH, de la salinité du milieu, de température, de débit, de pression, ainsi que de la polarité du solvant.
Il est néanmoins possible de comparer par exemple les affinités de deux entités différentes pour un même MIP dans des conditions d'utilisation identiques, ou encore les différentes affinités d'une même entité pour un même MIP dans des conditions d'utilisation variées. L'affinité peut également être adaptée, selon l'utilisation envisagée, lors de la préparation des premier et deuxième MIPs, en faisant varier en particulier les conditions de synthèse (nature du solvant, température, concentration des réactifs, nature de l'amorceur ...), les entités patrons, les monomères initiaux ou encore de l'agent de réticulation ayant servis à faire le MIP.
L'étape de polymérisation du MIP autour d'une entité patron fait appel à des techniques en soi connues de l'homme de l'art. On peut ainsi se rapporter à l'article Peter A.G. Cormack et al., Journal of Chromatography B, 804 (2004) 173-182, qui présente une revue des techniques disponibles autour des aspects de la polymérisation de MIPs. Le contenu de cet article est incorporé ici par référence. De façon générale, on obtient ces MIPs en copolymérisant des monomères et agent(s) de réticulation en présence d'une entité dont on cherche précisément à former l'empreinte. Les monomères s'arrangent spécifiquement autour de cette entité, encore dénommée entité patron , par des interactions fortes ou faibles, puis sont polymérisés généralement en présence d'un taux élevé en agent de réticulation. Après polymérisation, l'entité est extraite du matériau polymère et laisse ainsi son empreinte moléculaire dans des cavités au sein du matériau qui constituent de réels récepteurs synthétiques comparables aux récepteurs biologiques de type anticorps. L'entité patron peut être identique ou différente de la molécule cible. Ainsi, le document WO 07/004197 décrit notamment l'utilisation d'une entité patron de nature polymérique, différente de la (ou des) molécule(s) cible(s), pour la synthèse de MIPs.
Plus précisément, il existe deux approches possibles pour faire des MIPs, l'approche covalente développée par Wulff dans le document US 4 127 730 et l'approche non covalente développée par Mosbach dans le document US 5 110 833. Dans l'approche covalente, les interactions entre les monomères et l'entité patron sont de type liaisons covalentes labiles. Dans ce cas, après l'extraction de l'entité patron par rupture de la liaison covalente, la reconnaissance de molécules cibles s'effectue également par la formation d'une liaison covalente entre l'empreinte et la molécule cible considérée. Dans l'approche non covalente de Mosbach, les interactions entre les monomères et l'entité patron sont des liaisons faibles de type liaisons hydrogène, pi donneur - pi accepteur, liaisons de Van Der Waals ou interactions hydrophobiques. Après l'extraction de l'entité patron, la reconnaissance de molécules cibles s'effectue également par des interactions non covalentes entre l'empreinte et la molécule cible. Ces deux approches peuvent être combinées. Il est ainsi possible d'utiliser la première approche de type covalente pour la préparation du MIP et la deuxième approche pour obtenir une reconnaissance par des interactions non covalentes, comme cela est par exemple divulgué dans M.J. Whitcombe et al. "A New Method for the Introduction of Recognition Site Functionality into Polymers prepared by molecular Imprinting : Synthesis and Characterization of Polymeric Receptors for Cholesterol " J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 7105-7111. Il est également possible d'utiliser les première et deuxième approches pour la préparation du MIP, ainsi que pour obtenir la reconnaissance par des interactions covalentes et non covalentes simultanément pour une même molécule cible. Ainsi, l'interaction se déroule au moins en deux sites distincts du site de reconnaissance comme cela est par exemple divulgué dans Wulff G. et al. Macromol. Chem. Phys. 1989, 190, 1717 et 1727. Le MIP ou plus précisément la matrice la constituant peut ainsi être formée par copolymérisation radicalaire. Les monomères vinyliques, les monomères dérivés du styrène, de l'acide méthacrylique, sont des monomères particulièrement adaptés pour cette technique. Tout initiateur peut être utilisé, tel que l'azobisiso-butyronitrile (AIBN). Le MIP peut aussi être formé par copolymérisation radicalaire, dans le but de faire varier les propriétés du polymère. On peut par exemple citer le copolymère de méthacrylate de méthyle/méthacrylate de butyle. Le MIP peut être formé de polymères ou copolymères réticulés. Selon le degré de réticulation, on parle de polymère ou de copolymère branché, de réseaux macroscopiques ou de microgels. A titre de monomères utiles pour la synthèse des MIPs, on peut citer : - des monomères acides : acide méthacrylique (MAA), acide pvinylbenzoïque, acide acrylique (AA), acide itaconique, acide 2-(trifluorométhyl)-acrylique (TFMAA), acide sulfonique d'acrylamido-(2-méthyl)-propane (AMPSA), acrylate de 2-carboxyéthyle, des monomères basiques : 4-vinylpyridine (4-VP), 2-vinylpyridine (2- VP), 4-(5)-vinylimidazo le, 1-vinylimidazole, allylamine, N,N'-diéthyl aminoéthyle méthacrylamide (DEAEM), N-(2-aminéthyl)-méthacrylamide, N,N'-diéthyl-4-styrylamidine, aminoéthylméthacrylate de N,N,N-triméthyle, N-vinylpyrrolidone (NVP), ester d'éthyl urocanique, - des monomères neutres : acrylamide, méthacrylamide, méthacrylate de 30 2-hydroxyéthyle (2-HEMA), acide trans-3-(3-pyridyl)-acrylique, acrylonitrile (AN), méthacrylate de méthyle (MMA), styrène, éthylstyrène.
Il relève des compétences générales de l'homme du métier de préparer les premier et deuxième MIPs présentant les propriétés requises selon l'application visée. Il est ainsi également possible d'utiliser pour la synthèse des premier et/ou deuxième MIPs des monomères spécifiques selon la (ou les) molécule(s) cible(s) visée(s), et en particulier au moins en partie des monomères dérivés d'une molécule cible, jouant ainsi en partie le rôle du polymère de la matrice et en partie le rôle de l'entité patron. Autrement dit, une partie de ces monomères, une fois polymérisée, a vocation à être éliminée de sorte à donner naissance aux sites de reconnaissance. A titre d'exemple de tels monomères, on peut notamment citer le 5-[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl)benzo[1,3,2] dioxoborole, qui est dérivé de la N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine, elle-même dérivée de la dopamine. Selon un mode de réalisation de l'invention, et notamment lorsque la molécule cible est la dopamine, les premier et/ou deuxième polymères à empreintes moléculaires peu(ven)t mettre en oeuvre au cours de leur étape de polymérisation au moins le 5 -[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino] -2-(4-vinylphényl)benzo [ 1,3,2] dioxoborole. Selon ce mode de réalisation de l'invention, il(s) peu(ven)t en particulier être issu(s) de la copolymérisation d'au moins le 5-[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-[4-vinylphényl]benzo[1,3,2] dioxoborole et d'au moins l'acrylate de 2-carboxyéthyle, avec par exemple au moins du divinylbenzène ou du diméthacrylate de l'éthylène glycol.
PROCEDE D'ANALYSE On peut se référer à la figure 1, illustrant l'agencement des différentes étapes 25 du procédé selon l'invention. La présente invention concerne également, selon un autre de ses aspects, un procédé d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins une étape d'utilisation d'un kit selon l'invention. La (ou les) molécule(s) cible(s) peu(ven)t être par exemple présente(s) dans 30 une solution, et en particulier être présente(s) dans un milieu complexe, ou encore être présente(s) à l'état de trace dans un échantillon.
Il peut notamment s'agir d'un procédé d'analyse d'au moins une molécule susceptible d'être présente dans une solution comprenant au moins : (i) une étape de mise en contact de ladite solution avec un premier polymère à empreintes molécualires apte à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) dans des conditions adaptées à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), (ii) la formation d'une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), à partir de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i), (iii) une étape de mise en contact de ladite solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), avec un deuxième polymère à empreintes moléculaires, également apte à interagir avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), et doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur apte à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) dans les conditions de réalisation de ladite étape (iii), et (iv) une étape de détection qualitative, quantitative et/ou semi-quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), via la détection du marqueur ainsi déplacé. Comme indiqué précédemment, le marqueur et le deuxième MIP peuvent être conditionnés séparément dans deux compartiments distincts, ou être conditionnés ensemble de telle sorte que le deuxième MIP soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur.
Ainsi, selon une variante de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, préalablement à l'étape (iii), une étape de mise en contact du deuxième MIP avec au moins un marqueur selon l'invention. Les conditions seront alors avantageusement adaptées à l'interaction du (ou des) marqueur(s) avec les sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP.
Etape de pré-traitement Selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape (i) peut être une étape du pré-traitement de la solution comprenant la (ou les) molécule(s) cible(s), et être par exemple utile à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), de sorte à obtenir par suite une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s). Elle est suivie d'une étape (ii) de libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP, de sorte à conduire à la formation d'une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), à partir de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i). L'étape (ii) peut par exemple être réalisée par mise en présence de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i) avec un milieu propice à la rupture de leur 5 interaction avec le premier polymère à empreintes moléculaires. Ainsi, lorsque la solution à analyser est par exemple un milieu complexe, cette étape (i) du pré-traitement permet d'éliminer les entités annexes, différentes de la (ou des) molécule(s) cible(s) et qui sont susceptibles d'interférer avec la mise en oeuvre de l'étape (iii). 10 En variante, lorsque la solution à analyser est un échantillon comprenant la (ou les) molécule(s) cible(s) à l'état de trace, l'étape (i) du pré-traitement permet d'obtenir, après libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP, une solution pré-traitée enrichie en molécule(s) cible(s), à savoir dans laquelle la (ou les) molécule(s) cible(s) est (sont) présente(s) en de plus fortes teneurs en comparaison avec la 15 solution initiale n'ayant pas subi l'étape (i). Le taux d'enrichissement obtenu à l'issue de l'étape (i) peut par exemple être compris entre 2 et 1000, notamment entre 5 et 100.
Selon un mode de réalisation de l'invention, il peut notamment s'agir d'une 20 étape d'extraction en phase solide (SPE). Une procédure d'extraction en phase solide comporte généralement trois ou quatre étapes. La première est le conditionnement de l'adsorbant (comprenant selon l'invention au moins un premier MIP contenu dans la cartouche d'extraction, qui permet de mouiller le support en solvatant les groupements fonctionnels présents à sa surface. 25 Lors de la seconde étape, on procède à la percolation de la solution à traiter sur le premier MIP, de sorte à ce que les entités n'ayant aucune affinité avec ce dernier ne soient pas retenues. En revanche, la (ou les) molécule(s) cible(s), et éventuellement d'autres entités présentant une forte affinité avec l'adsorbant, restent sur le support à l'issue de cette étape. 30 Une étape supplémentaire de lavage peut être effectuée afin d'éliminer les entités faiblement retenues par le support, au moyen d'un solvant de force éluante convenable pour éluer ces entités tout en gardant la (ou les) molécule(s) cible(s) sur le support. On procède enfin à l'élution de la (ou des) molécule(s) cible(s) par passage d'un solvant spécifiquement choisi pour permettre de rompre les interactions de reconnaissance mises en jeu entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et le premier MIP tout en évitant d'éluer des entités interférentes fortement retenues sur le support, de telle sorte à libérer la (ou les) molécule(s) cible(s) extraite(s).
A la fin de ce processus d'extraction et de libération, on obtient donc une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s). Comme indiqué précédemment, cette solution pré-traitée peut être utilisée telle quelle pour la deuxième étape (iii), ou être préalablement traitée avant d'être mise en contact avec le deuxième MIP. Typiquement, les solvants utilisés lors d'une extraction en phase solide peuvent être des solvants organiques comme par exemple l'acétonitrile, le méthanol, le dichlorométhane, des solvants aqueux comme par exemple l'eau, des solutions tampons, les solvants pouvant être utilisés en mélange et avec différentes conditions de salinité, de pH, de polarité. Il est connu que la molécule cible sera retenue d'autant plus spécifiquement 20 dans un MIP qu'il s'y développera le même type d'interactions que celles développées lors de la synthèse. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape (i) peut être réalisée en utilisant un solvant identique ou similaire au solvant utilisé lors de la synthèse du premier MIP. D'autres types d'étapes de prétraitement peuvent être envisagées comme par 25 exemple la micro-extraction en phase solide (SPME ou solid phase micro-extraction en langue anglaise), l'extraction dynamique sur phase solide (SPDE ou solid phase dynamic extraction en langue anglaise), l'extraction sur barreaux d'agitation (SBSE ou Stir Bar Sorption Extraction en langue anglaise), des capillaires, des bandes, des puces.
30 Le choix et la synthèse du MIP, ainsi que l'adaptation des conditions d'utilisation relèvent des connaissances générales de l'homme du métier.
Etape de détection Selon l'invention, les étapes (iii) et (iv) de détection de la (ou des) molécule(s) cible(s) sont réalisées après les étapes (i) et (ii) de pré-traitement décrites ci-dessus. L'étape (iii) repose sur un test de compétition entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et le marqueur vis-à-vis des sites de reconnaissance d'un deuxième MIP. Des tests de compétition entre un analyte et un marqueur adsorbé sur des MIPs ont déjà été décrits dans la littérature. On peut ainsi se reporter par exemple à la revue de Richard J. Ansell, Journal of Chromatography B, 804 (2004) 151-155, déjà citée dans le préambule, qui répertorie les différents modes d'utilisation de MIPs dans de tels tests, notamment en radioimmunoanalyse. Comme indiqué dans la description du kit selon l'invention, le marqueur utilisé dans l'étape (iii) doit présenter une plus faible affinité pour les sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP que la (ou les) molécule(s) cible(s), dans les conditions d'utilisation du deuxième MIP dans cette étape.
Compte tenu de cette différence d'affinité, la mise en présence du deuxième MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur avec la solution pré-traitée purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s) va entraîner le déplacement du marqueur par la (ou les) molécule(s) cible(s), qui sera ainsi substitué dans le deuxième MIP par la (ou les) molécule(s) cible(s).
La détection de la (ou des) molécule(s) cible(s) dans l'étape (iii) repose ainsi sur un déplacement de l'équilibre entre d'une part le deuxième MIPs doté du (ou des) marqueur(s) et d'autre part le deuxième MIP doté de la (ou des) molécule(s) cible(s), la formation de ce dernier complexe étant favorisée. Ici encore, le deuxième MIP peut être adapté selon les connaissances de 25 l'homme du métier, en fonction de la (ou des) molécule(s) cible(s) et/ou du marqueur et/ou des conditions d'utilisation et/ou de l'application visée. Le choix du marqueur peut également être adapté selon la connaissance générale de l'homme du métier. Par exemple, lorsque la molécule est la dopamine, et lorsque le deuxième MIP 30 est utilisée dans du méthanol, le marqueur peut être notamment la 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine, comme illustré dans l'exemple 6 ci-après.
Ainsi, un marqueur présentant par exemple une forte affinité pour les sites de reconnaissance du deuxième MIP ne pourra être déplacé que par une molécule cible particulière présentant une affinité encore plus forte pour lesdits sites de reconnaissance, tandis qu'un marqueur présentant une plus faible affinité pour les sites de reconnaissance du deuxième MIP pourra être déplacé plus facilement par une molécule cible, voire même par une famille de molécules cibles. Selon un mode de réalisation de l'invention, le marqueur peut être déplacé par la (ou les) molécule(s) cible(s) en présence de très faibles teneurs en molécule(s) cible(s), et par exemple en présence de teneurs inférieures à 1 g/L voire inférieures à 100 ng/L.
Par ailleurs, lorsque le marqueur utilisé est détectable à de très faibles teneurs, comme par exemple à des teneurs inférieures à 500 ng/L, voire à 100 ng/L, et en particulier lorsque le marqueur utilisé est détectable à des teneurs inférieures aux teneurs auxquelles peut être détectée la (ou les) molécule(s) cible(s), l'étape (iv) de détection selon l'invention permet d'amplifier le signal de détection de la (ou des) molécule(s) cible(s), et donc d'améliorer la sensibilité de la mesure.
La solution purifiée et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s) obtenue(s) à l'issue de l'étape (ii) peut être directement mise en contact avec le deuxième MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance pour la (ou les) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur tel que décrit précédemment. Elle peut alternativement être traitée avant d'être mise en contact avec ledit deuxième MIP, de sorte par exemple à modifier son pH, la concentration en molécule(s) cible(s), sa salinité, ou sa polarité. Lorsqu'il est question dans les paragraphes qui suivent des conditions , il faut entendre les conditions de pH, de concentration en molécule(s) cible(s), de salinité, de polarité. Ainsi, selon une variante de l'invention, la solution obtenue à l'issue de l'étape (ii) peut être directement mise en contact avec le deuxième MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance d'au moins un marqueur tel que décrit précédemment. Dans ce cas, les premier et deuxième MIPs sont de nature chimique différente, et on choisit le marqueur de telle façon à ce qu'il soit apte à être déplacé par la (ou les) molécules cible(s), dans les conditions mises en oeuvre lors de l'étape de libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP.
Cette première variante de réalisation permet notamment de limiter le nombre d'étapes requises pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, et donc de limiter le nombre de manipulations. Selon une autre variante de réalisation, la solution obtenue à l'issue de l'étape (ii) peut être traitée avant d'être mise en contact avec le deuxième MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance pour la (ou les) molécule(s) cible(s), d'au moins un marqueur tel que décrit précédemment. Dans ce cas, on peut utiliser soit des premier et deuxième MIPs identiques en terme de nature chimique, et se différenciant uniquement par la présence d'au moins un marqueur dans tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP, soit des premier et deuxième MIPs de nature chimique différente, de telle façon que le marqueur soit apte à être déplacé par la (ou les) molécules cible(s), dans les conditions mises en oeuvre lors de l'étape de libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP.
Lorsque les premier et deuxième MIPs sont identiques en terme de nature chimique, la solution enrichie en molécule(s) cible(s) obtenue à l'issue de l'étape (ii) peut notamment, selon cette deuxième variante de réalisation, être traitée de telle sorte à obtenir des conditions de pH, de concentration en molécule(s) cible(s), de salinité et/ou de polarité approchant celles mises en oeuvre lors de l'étape (i) pour l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s). En revanche, lorsque le premier et deuxième MIPs sont de nature chimique différente, cette étape additionnelle de traitement peut par exemple consister à atteindre les meilleures conditions d'utilisation requises pour la mise en oeuvre de l'étape (iii).
Le procédé selon l'invention peut être destiné à une analyse qualitative, c'est-à-dire viser uniquement à savoir si une (ou des) molécule(s) cible(s) et (sont) présente(s) dans un milieu particulier. Le procédé selon l'invention peut également permettre, outre cette détection de la présence ou non de la (ou des) molécule(s) cible(s), une analyse semi-quantitative, voire quantitative de celle(s)-ci, via la détermination de la quantité de marqueur relargué.
Comme indiqué précédemment, l'étape (iii) de détection fait en effet intervenir un déplacement compétitif du marqueur par la (ou les) molécule(s) cible(s), tel que le nombre de moles de marqueur relargué soit fonction du nombre de moles de molécule cible détectées.
Ainsi, un kit d'analyse selon l'invention peut comprendre en outre, selon un mode de réalisation, un dispositif d'analyse semi-quantitative et/ou un dispositif d'analyse quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), basé(s) sur la détermination de la quantité de marqueur relargué.
Ces dispositifs peuvent comprendre, le cas échéant, des moyens d'étalonnage permettant de corréler la quantité de marqueur relargué à la quantité de molécule(s) cible(s). Selon un mode de réalisation, il peut être nécessaire de mettre en oeuvre une étape additionnelle de traitement, préalablement à l'étape (iv) de détection à proprement parler. A titre d'exemple de tels traitements, on peut notamment citer des lavages, en particulier dans le cas où le deuxième polymère à empreintes polymérique est conditionné sous la forme d'une cartouche SPE. Il est ainsi possible selon l'invention de déterminer de façon semi-quantitative la concentration en molécule(s) cible(s), en utilisant par exemple dans l'étape (iv) un dispositif d'analyse semi-quantitative comprenant au moins deux supports d'analyse comprenant des deuxièmes polymères à empreintes moléculaires de même nature ou différents dotés de marqueurs identiques ou différents, détectables par exemple par l'oeil nu. Selon une variante de l'invention, les marqueurs peuvent être identiques, et les deux supports d'analyse peuvent présenter des concentrations en marqueurs distinctes correspondant à des gammes de concentrations en molécule(s) cible(s) déterminées. Selon un mode de réalisation de l'invention, illustré notamment en figure 2, le deuxième polymère à empreintes moléculaires peut être conditionné sous la forme d'une cartouche SPE graduée, et le marqueur peut être détectable par l'oeil nu, par exemple par sa couleur caractéristique. L'étape (iv) de détection est alors rendue possible par l'observation d'une disparition de la couleur du support, dans la partie du support où le déplacement compétitif s'est déjà manifesté.
Il est aussi possible selon l'invention de déterminer de façon semi-quantitative la concentration en molécule(s) cible(s), en visualisant par exemple l'avancée de la décoloration du deuxième MIP par une graduation présente sur le support ; cette décoloration étant fonction de la concentration en molécule cible.
La comparaison des signaux détectés suite au relargage du marqueur, sur chaque support, permet ainsi d'évaluer la teneur en molécule(s) cible(s) en la situant dans des gammes de concentration. Il est évidemment possible de prévoir des quantités de supports variables de sorte à ménager des gammes de teneurs plus ou moins fines.
Par exemple, on peut prévoir de 1 à 20 supports distincts, voire un nombre virtuellement illimité de supports, dans le cas particulier de l'utilisation de puces. Selon cette variante de réalisation, il est possible de faire varier la concentration en marqueur des différents supports en utilisant des deuxièmes MIPs comportant des densités en sites de reconnaissances variables, ou encore en immobilisant une moins grande quantité d'empreinte sur le support, ou encore en mélangeant des MIPs avec des polymères identiques à ceux constituant la matrice des MIPs, mais dépourvus d'empreintes, à des ratios donnés. Pour la mise en oeuvre du procédé d'analyse quantitative, le marqueur utilisé selon l'invention étant par définition une entité détectable, il est également possible de déterminer précisément la concentration en molécule(s) cible(s) en mesurant la quantité totale de marqueur relargué lors de l'étape (iii) de détection, et en se référant, le cas échéant, au résultat d'un étalonnage préalable. Toutes les méthodes de détection utiles à cet effet sont connues de l'homme de l'art.
APPLICATIONS Le kit d'analyse selon la présente invention peut êtreutilisé pour de nombreuses applications à des fins d'analyse, et plus particulièrement pour l'analyse d'analytes présents dans des milieux complexes ou présents à l'état de trace dans un échantillon. Dans le cadre de la présente invention, le kit d'analyse s'entend également d'un kit de diagnostique, d'un kit de dépistage, d'un kit d'analyse de polluants, de toxiques, de médicaments, de contaminants, de drogues, de produits chimiques, de parfum et de colorants. Les molécules cibles qu'il est par exemple possible d'analyser au moyen du kit selon l'invention sont notamment la dopamine et ses dérivés tels par exemple la sérotonine 5 et la méthoxytyramine. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le kit d'analyse peut être destiné à l'analyse de la dopamine et/ou ses dérivés, tels que décrits ci-dessus.
EXEMPLES 10 Exemple 1 : Synthèse du monomère dérivé de la N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine. Synthèse d'un MIP de la dopamine à partir du monomère dérivé de la N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine noté MIP n l et d'une matrice notée "Matériau Non Imprimé n 1 ", les deux matériaux étant à base de divinylbenzène (DVB). Synthèse d'un MIP de la dopamine à partir du monomère dérivé de 15 la N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine noté MIP n 2 et d'une matrice notée "Matériau Non Imprimé n 2", les deux matériaux étant à base du diméthylacrylate de l'éthylène glycol (EGDMA). Monomère dérivé de la N-tert-butoxycarbonyl-3, 4-dihydroxyphényléthylamine 20 La N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine telle que décrite dans Xu C., Xu K., Gu H., Zheng R., Liu H., Zhang X., Guo Z., Xu B. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 9938 (0,609 g ; 2,41 mmol) et l'anhydride de l'acide 4-vinylphényl boronique 25 (0,312 g ; 0,80 mmol) sont mis en solution dans 60 mL de toluène anhydre, puis le mélange est porté à reflux pendant 3 heures sous atmosphère inerte. Les particules insolubles à chaud sont filtrées, puis le toluène est évaporé. L'huile obtenue est diluée dans le minimum d'acétate d'éthyle, puis du cyclohexane (20 mL) est ajouté au mélange.
On obtient alors 0,812 g d'une poudre blanche (rendement : 93 %) correspondant au 5-[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl) benzo[1,3,2]dioxoborole.
Matrices à base de DVB Le divinylbenzène est lavé plusieurs fois par une solution basique saturée au NaCl pour éliminer l'inhibiteur. Il est séché sur MgSO4. L'amorceur azobisisobutyronitrile (AIBN) est recristallisé dans l'acétone. Le MIP n 1 est préparé en mélangeant 725 mg du monomère 5-[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl)benzo[1,3,2] dioxoborole, 6,2 g de divinylbenzène à 80 %, 1,1 g d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans 7,2 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 89 mg d'AIBN. La polymérisation s'effectue à 50 C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc. Le matériau non imprimé n 1 est préparé en mélangeant 1,98 g de styrène, 6,2 g de divinylbenzène à 80 %, 1,1 g d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans 7,2 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 89 mg d'AIBN. La polymérisation s'effectue à 50 C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc.
Matrices à base d'EGDMA Le diméthylacrylate de l'éthylène glycol est lavé plusieurs fois par une solution basique saturée au NaCl pour éliminer l'inhibiteur. Il est séché sur MgSO4. L'amorceur azobisisobutyronitrile (AIBN) est recristallisé dans l'acétone. Le MIP n 2 est préparé en mélangeant 626 mg du monomère 5-[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl)benzo[1,3,2] dioxoborole, 6,48 g de diméthylacrylate de l'éthylène glycol, 940 mg d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans 9 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 77 mg d'AIBN. La polymérisation s'effectue à 50 C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc.
Le matériau non imprimé n 2 est préparé en mélangeant 1,98 g de styrène, 7,55 g de diméthylacrylate de l'éthylène glycol, 1,1 g d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans 7,2 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 89 mg d'AIBN. La polymérisation s'effectue à 50 C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc.
Les matrices préparées ci-dessus sont broyées grossièrement et mises en suspension dans 80 mL d'une solution de méthanol à 9 % en acide chlorhydrique pendant 24 heures. Une fois filtrée, la poudre est de nouveau mise en suspension dans 80 mL de méthanol pendant 24 heures. La poudre filtrée est alors broyée puis tamisée. Les particules dont la taille est située entre 25 et 45 m sont introduites dans une colonne HPLC 150 x 4.6 mm puis tassées par pression et lavées avec un mélange 5 % Acide Acétique dans Acétonitrile/H20 (97,5/2,5) puis du méthanol pour l'étude de la reconnaissance de la dopamine en HPLC. Ainsi on dispose de 4 colonnes HPLC. En parallèle on prépare des cartouches SPE avec des particules 2545 m avec chaque matrice.
Exemple 2 : Propriétés de reconnaissance vis-à-vis de la dopamine par HPLC. 15 La reconnaissance se déroule selon le schéma ci-dessous. HCl/MeOH Une solution à 1 mm de l'hydrochlorure de la dopamine dans le méthanol est injectée sur les quatre colonnes remplies respectivement de l'empreinte n 1, du matériau non imprimé n 1, de l'empreinte n 2 et du matériau non imprimé n 2. 20 L'éluant utilisé est un mélange à 95/5 de MeOH/tampon acétate 10 mM à pH=5 avec un débit de 1 mL/min. La détection de dopamine est faite à 281 nm. Les volumes d'injection sont de 20 L et de 5 L d'une solution d'acétone dans le méthanol. L'acétone est utilisée pour déterminer le volume mort de la colonne.
On détermine les valeurs de k' (facteur de capacité) et d'IF (facteur d'empreinte) pour évaluer la reconnaissance de la dopamine sur toutes les matrices.
Matrices à base de DVB Analyte Dopamine 0,82 mM tanalyte ù tacétone 11,06 k' = MIP n 1 tacétone tanalyte ù tacétone 4,63 = matériau non imprimé n 1 tacétone k'MIPn 1 2,39 IF = matériau non imprimé n 1 Matrices à base d'EGDMA Analyte Dopamine 0,91 mM tanalyte ù tacétone 29,83 k' = MIP n 2 tacétone tanalyte ù tacétone 12,48 matériau non imprimé n 2 = tacétone k'MIPn 2 2,39 IF = matériau non imprimé n 2 On observe que la dopamine est reconnue par les deux MIPs. La dopamine est 15 cependant plus retenue sur le MIP n 2 que sur le MIP n 1 (k' plus important).10 Exemple 3 : Sélectivité des différentes matrices vis-à-vis de plusieurs composés par HPLC. Différentes solutions à 1 mM de plusieurs composés dans le méthanol sont 5 injectées sur les quatre colonnes remplies respectivement du MIP n l, du matériau non imprimé n 1, du MIP n 2 et du matériau non imprimé n 2. L'éluant utilisé est un mélange à 95/5 de MeOH/tampon acétate 10 mM à pH=5 avec un débit de 1 mL/min. La détection des composés est faite à 281 nm. Les volumes d'injection sont de 20 L. 10 On détermine les valeurs de k' (facteur de capacité) et d'IF (facteur d'empreinte) pour évaluer la reconnaissance des composés sur toutes les matrices. Matrices à base de DVB Analyte k'MIP n 1 k'matériau non imprimé n 1 IF Dopamine 0,82 mM 11, 06 4,63 2,39 Catéchol 0,9 mM 2,20 0,43 1,25 Acide 3,4dihydroxyphénylacétique 0,97 mM 0 0 - L-Tyrosine 0,94 mM 0,151 0,136 1,1 Sérotonine 0,80 mM 6,315 6,44 0,98 15 Matrices à base d'EGDMA Analyte k'MIP n 2 k'matériau non imprimé n 2 IF Dopamine 0,82 mM 29,83 12,48 2,39 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine 0,97 24,61 1,85 13,3 mM Catéchol 1,21 mM 0,76 1,28 0,59 Acide 3,4-dihydroxy-phénylacétique 0,71 mM 0 0 -L-Tyrosine 1,16 mM 0,18 3,02 0,06 Sérotonine 1,07 mM 15,70 13,21 1,19 Par HPLC on constate que les molécules contenant une fonction acide ne sont pas du tout retenues sur les empreintes à la différence de la dopamine. Les empreintes sont sélectives de la dopamine par rapport à des molécules de structure semblable. L'empreinte n 1 est plus sélective que l'empreinte n 2 au vu des 5 valeurs du facteur d'empreinte de la sérotonine sur les deux empreintes. La 6,7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarine est moins bien retenue sur l'empreinte n 2 que la dopamine mais on observe une certaine rétention sur cette empreinte. Cette molécule pourra être utilisée comme marqueur pour les études de déplacement. 10 Exemple 4 : Reconnaissance de la dopamine par SPE Deux cartouches de SPE sont réalisées en introduisant 200 mg de chacune des matrices empreintes (empreintes n 1 et n 2) entre deux frittés. Une extraction de la dopamine est alors réalisée. Pour ce faire 5 mL d'une solution de tampon phosphate 15 10 mM à pH 7 sont percolés sur ces cartouches suivis par 5mL d'eau MilliQ et 5mL de MeOH pour conditionner les cartouches avant d'introduire la dopamine. Puis 500 L d'une solution MeOH-Tampon acétate pH=5 10mM (80/20, v/v) dopée à 10 g/mL de dopamine sont percolés sur les cartouches de SPE. Plusieurs fractions de 3mL de solution MeOHTampon acétate pH=5 (80/20, v/v) sont utilisées comme solution de lavage. Par la suite 20 2 x 2mL de MeOH contenant 0, 025% d'acide acétique sont percolés. Les diverses fractions sont ensuite analysées par HPLC-UV. 25 30 Le tableau donne les taux de récupération (%) de dopamine obtenus lors de cette extraction. Fraction Taux de récupération % en dopamine Empreinte n 1 Empreinte n 2 Percolation 0 0 Lavage 1 0 0 Lavage 2 0 0 Lavage 3 69 0 Lavage 4 0 0 Lavage 5 0 0 2 mL MeOH-AA 0,025% 0 49 2 mL MeOH-AA 0,025% 0 0 On observe dans ces conditions d'utilisation une différence de comportement des deux matrices vis-à-vis de la rétention de la dopamine.
Exemple 5 : Sélectivité de l'empreinte par SPE. La sélectivité de la matrice empreinte a été testée en ajoutant une molécule similaire à la dopamine pendant la phase de percolation. L'acide 3,4-dihydroxy-phénylacétique a été choisi comme molécule test. Après conditionnement des cartouches, 500 L de MeOH contenant 5 g de l'acide et 5 g de dopamine sont introduits. Plusieurs fractions de lavage (2 mL de MeOH-Tampon acétate pH=5 10mM (95/5, v/v)) sont ensuite utilisées, suivies par une élution avec du MeOH-0,05% d'acide acétique.
Le tableau donne les taux de récupération (%) de dopamine et d'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique obtenus lors de cette extraction.20 Fraction Taux de récupération % Dopamine Acide 3,4- dihydroxyphénylacétique Percolation 0 6 Lavage 1 0 82 Lavage 2 0 0 Lavage 3 0 0 Lavage 4 0 0 Lavage 5 0 0 Elution 100 0 L'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique n'est pas retenu sur la matrice empreinte et sort dès l'introduction des produits. Comme en HPLC on constate que la molécule contenant une fonction acide 15 n'est pas du tout retenue sur les empreintes à la différence de la dopamine. Les empreintes sont sélectives de la dopamine par rapport à des molécules de structure semblable.
Exemple 6 : Déplacement de la 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine par SPE. 20 - Essai A : Deux cartouches de SPE contenant 70 mg de matrice empreinte sont préparées. Après conditionnement, les cartouches sont saturées avec 500 g de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine dans le méthanol. Sur la cartouche nommée révélateur 4 fractions de lmL contenant 100 g de dopamine et 10 g de 25 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine sont introduits. Sur la deuxième cartouche nommée témoin seulement 10 g de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine sont introduits. Des fractions de lmL contenant 10 g de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine dans du MeOH sont ensuite percolés sur les deux cartouches et chaque fraction est analysée. Le tableau suivant donne les quantités obtenues 30 de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine dans ces diverses fractions.
10 Taux de récupération % de 6,7- Fraction hydroxy-4trifluorométhylcoumarine Révélateur Témoin Dernière introduction en dopamine 53 27 Fraction 1 49 23 Fraction 2 43 20 Fraction 3 44 19 Fraction 4 27 18 On observe que l'introduction de la dopamine entraîne un taux de récupération en 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl)coumarine plus élevé sur le révélateur que sur le témoin. - Essai B : Deux cartouches de SPE contenant 25 mg de matrice empreinte sont préparées. Après conditionnement, 35 g de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine contenu dans lmL de méthanol sont percolés suivi par lmL de MeOH. Sur la cartouche 10 nommée révélateur lmL de MeOH contenant soit 100 g soit 50 g de dopamine est introduit. Sur la deuxième cartouche nommée témoin seulement lmL de MeOH est introduit. Des fractions de lmL de MeOH sont ensuite percolées sur les deux cartouches. Le graphe de la figure 3, donne les quantités obtenues de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine dans ces diverses fractions lors de l'introduction de 100 g de dopamine. Le 15 tableau suivant donne les quantités obtenus de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine dans ces diverses fractions après percolation de 50 g de dopamine.
20 Taux de récupération % de 6,7- Fraction hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine Révélateur Témoin Introduction de 50 g de dopamine 5 5 Fraction 1 6 4 Fraction 2 6 3 Fraction 3 4 2 Fraction 4 3 2 Après introduction de la dopamine sur le révélateur, on observe une variation de la quantité de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine due à un déplacement de celle- ci par la dopamine pour les deux concentrations testées ainsi qu'une décoloration de la cartouche fonction de la quantité de dopamine.

Claims (24)

REVENDICATIONS
1. Kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement identiques ou différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s), et au moins un marqueur, ledit marqueur étant apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (ii) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s).
2. Kit selon la revendication précédente, dans lequel au moins le marqueur et le deuxième polymère à empreintes moléculaires sont conditionnés séparément.
3. Kit selon la revendication 1, dans lequel au moins le marqueur et le deuxième polymère à empreintes moléculaires sont conditionnés ensemble de telle sorte que le deuxième polymère à empreintes moléculaires soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur.
4. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le premier et deuxième polymères à empreintes moléculaires sont identiques en terme de nature chimique.
5. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel 20 le deuxième polymère à empreintes moléculaires est de nature chimique différente du premier polymère à empreintes moléculaires.
6. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier polymère à empreintes moléculaires est destiné à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), par reconnaissance moléculaire de la (ou des) molécule(s) 25 cible(s).
7. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le deuxième polymère à empreintes moléculaires, lorsqu'il est doté dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance d'au moins un marqueur, est destinée à la détection, voire à la détermination de la concentration, de la (ou des) molécule(s) cible(s). 30
8. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le marqueur est détectable par colorimétrie visible par exemple par l'oeil nu, parradiochimie, par médecine nucléaire comme par exemple par scintigraphie, par imagerie, par résonance (IRM), par rayons X, par diffusion de lumière, par spectrométrie de masse, par spectroscopie, comme par exemple par fluorescence ou par UV-visible, par ultrasons, par radioactivité, par réfractométrie, par détections optique, piézoélectrique, magnétique, acoustique, par électrochimie, par conductivité, par pH métrie, ou encore par voie biologique, et de préférence par l'oeil nu.
9. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'analyse d'une famille de molécules cibles.
10. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'analyse de la dopamine, et de ses dérivés tels par exemple la sérotonine, et la méthoxytyramine.
11. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les premier et/ou deuxième polymères à empreintes moléculaires mettent en oeuvre au cours de leur étape de polymérisation au moins le 5-[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-[4-vinylphényl]benzo[1,3,2] dioxoborole.
12. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier polymère à empreintes moléculaires est mis en oeuvre sur une colonne d'extraction.
13. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 20 lequel le deuxième polymère à empreintes moléculaires est mis en oeuvre sur une cartouche SPE, éventuellement graduée.
14. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un dispositif d'analyse semi-quantitative et/ou un dispositif d'analyse quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), basé(s) sur la 25 détermination de la quantité de marqueur relargué.
15. Kit d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel le dispositif d'analyse semi-quantitative comprend au moins deux supports d'analyse comprenant des deuxièmes polymères à empreintes polymériques, de même nature ou différents, dotés de marqueurs, identiques ou différents, détectables par exemple par l'oeil nu. 30
16. Kit d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel les marqueurs sont identiques et les au moins deux supports d'analyse présentent des concentrations enmarqueurs distinctes correspondant à des gammes de concentrations en molécule(s) cible(s) déterminées.
17. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un kit de diagnostique.
18. Procédé d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins une étape d'utilisation d'un kit tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 17.
19. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la (ou les) molécule(s) cible(s) est (sont) présente(s) dans une solution, et en particulier dans un 10 milieu complexe ou à l'état de trace dans un échantillon.
20. Procédé d'analyse d'au moins une molécule cible susceptible d'être présente dans une solution selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : (i) une étape de mise en contact de ladite solution avec un premier polymère à 15 empreintes moléculaires apte à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) dans des conditions adaptées à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), (ii) la formation d'une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), à partir de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i), (iii) une étape de mise en contact de ladite solution purifiée et éventuellement 20 enrichie en molécule(s) cible(s) avec un deuxième polymère à empreintes moléculaires, également apte à interagir avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), et doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur apte à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) dans les conditions de réalisation de ladite étape (iii), et 25 (iv) une étape de détection qualitative, quantitative et/ou semi-quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), via la détection du marqueur ainsi déplacé.
21. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'étape (ii) est réalisée par mise en présence de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i) avec un milieu propice à la rupture de leur interaction avec le premier polymère à empreintes 30 moléculaires.
22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel ladite solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), est directement mise en contact avec ledit deuxième polymère à empreintes moléculaires.
23. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel ladite solution 5 purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), est traitée avant d'être mise en contact avec ledit deuxième polymère à empreintes moléculaires.
24. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel le premier et deuxième polymères à empreintes moléculaires et le marqueur sont tels que définis en revendications 2 à 8. 10
FR0753941A 2007-03-20 2007-03-20 Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant Expired - Fee Related FR2914066B1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0753941A FR2914066B1 (fr) 2007-03-20 2007-03-20 Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant
EP08775729A EP2125195A2 (fr) 2007-03-20 2008-03-20 Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant
US12/532,288 US20100105076A1 (en) 2007-03-20 2008-03-20 Analysis kit comprising at least two molecularly imprinted polymers and at least one marker, and method of analysis using same
PCT/FR2008/050487 WO2008132384A2 (fr) 2007-03-20 2008-03-20 Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0753941A FR2914066B1 (fr) 2007-03-20 2007-03-20 Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR2914066A1 true FR2914066A1 (fr) 2008-09-26
FR2914066B1 FR2914066B1 (fr) 2009-05-22

Family

ID=38521033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR0753941A Expired - Fee Related FR2914066B1 (fr) 2007-03-20 2007-03-20 Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100105076A1 (fr)
EP (1) EP2125195A2 (fr)
FR (1) FR2914066B1 (fr)
WO (1) WO2008132384A2 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112661964A (zh) * 2020-12-22 2021-04-16 西安交通大学 一种双功能单体双印迹层睾酮分子印迹磁性纳米球及其制备方法和应用

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2671085A1 (fr) 2011-02-04 2013-12-11 Council of Scientific & Industrial Research Capteurs d'acide aminé aqueux à base de films de polymères conducteurs à empreinte moléculaire
US20120311744A1 (en) * 2011-06-06 2012-12-06 Erich E. Sirkowski Marked Cannabis For Indicating Medical Marijuana
US9260683B2 (en) * 2011-10-13 2016-02-16 The Trustees Of Dartmouth College Molecularly imprinted polymer for wine, method of preparing, and use of same
WO2014062632A1 (fr) * 2012-10-15 2014-04-24 The Trustees Of Dartmouth College Procédés pour la préparation de polymères à empreinte moléculaire pour l'extraction de vin
CN103424381B (zh) * 2013-07-27 2015-11-25 南昌大学 基于磁性分子印迹聚合物放大效应构建的spr传感器在农药检测中的应用
TWI500915B (zh) * 2014-07-18 2015-09-21 Agricultural Chemicals And Toxic Substances Res Inst Council Of Agriculture 用於農產品農藥殘留檢測程序的快速萃取套件及使用該快速萃取套件從農產樣品取得檢液原液的方法
CN106215892B (zh) * 2016-08-01 2019-01-11 中国科学技术大学 一种分子印迹微球及其制备方法以及一种过氧化氢酶抑制剂
BR112019005167A2 (pt) 2016-09-16 2019-07-02 Dyax Corp método e kit para analisar uma amostra
CN106622165B (zh) * 2016-10-19 2019-01-11 中国科学技术大学 一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球及其制备方法以及一种过氧化氢酶抑制剂
CN109342626A (zh) * 2018-11-28 2019-02-15 福州大学 特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱及其制备方法
CN110585758B (zh) * 2019-09-18 2021-10-19 昆明理工大学 基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的可选择阵列式分析平台的构建方法
CN111678911B (zh) * 2020-07-10 2023-12-29 中国科学院烟台海岸带研究所 一种基于毛细管印迹sers传感器及其制备方法和应用
CN111825814B (zh) * 2020-07-29 2023-03-21 重庆医科大学 一种儿茶酚胺类物质磁性分子印迹聚合物及其制备方法与应用
CN115254047B (zh) * 2021-04-30 2024-01-02 南京大学 一种分子印迹及包覆聚合物、其制备方法及用途
CN113686832B (zh) * 2021-08-20 2022-08-23 江南大学 一种磺胺类抗生素的超灵敏类识别点阵阵列检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU670108B2 (en) * 1992-09-11 1996-07-04 Becton Dickinson & Company Improved antibodies to plasmodium falciparum

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIANELLA I ET AL: "MIP-based solid phase extraction cartridges combined with MIP-based sensors for the detection of microcystin-LR.", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 18, no. 2-3, March 2003 (2003-03-01), pages 119 - 127, XP009090174, ISSN: 0956-5663 *
HAUPT K ET AL: "Herbicide assay using an imprinted polymer-based system analogous to competitive fluoroimmunoassays", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 70, no. 18, 15 September 1998 (1998-09-15), UNITED STATES, pages 3936 - 3939, XP009091411, ISSN: 0003-2700 *
IVES J T ET AL: "Fiber optic immunosensors to monitor small-molecule analytes in groundwater", PROCEEDINGS OF THE SPIE - THE INTERNATIONAL SOCIETY FOR OPTICAL ENGINEERING, vol. 3540, 1999, USA, pages 36 - 44, XP009091397, ISSN: 0277-786X *
SHARMA P S ET AL: "Highly sensitive and selective detection of creatinine by combined use of MISPE and a complementary MIP-sensor", CHROMATOGRAPHIA, vol. 65, no. 7-8, 6 February 2007 (2007-02-06), pages 419 - 427, XP019496249, ISSN: 0009-5893 1612-1112 *
SUEDEE ROONGNAPA ET AL: "Temperature sensitive dopamine-imprinted (N,N-methylene-bis-acrylamide cross-linked) polymer and its potential application to the selective extraction of adrenergic drugs from urine", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 1114, no. 2, May 2006 (2006-05-01), pages 239 - 249, XP005407691, ISSN: 0021-9673 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112661964A (zh) * 2020-12-22 2021-04-16 西安交通大学 一种双功能单体双印迹层睾酮分子印迹磁性纳米球及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008132384A3 (fr) 2008-12-24
FR2914066B1 (fr) 2009-05-22
WO2008132384A2 (fr) 2008-11-06
EP2125195A2 (fr) 2009-12-02
US20100105076A1 (en) 2010-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FR2914066A1 (fr) Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant
Chen et al. Molecular imprinting: perspectives and applications
Jiang et al. Molecularly imprinted solid-phase extraction for the selective determination of 17β-estradiol in fishery samples with high performance liquid chromatography
Zhao et al. Development of water-compatible molecularly imprinted solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the detection of six sulfonamides in animal-derived foods
Li et al. Recent applications of molecularly imprinted polymers (MIPs) on micro-extraction techniques
Turiel et al. Molecularly imprinted polymers for sample preparation: A review
Peng et al. Molecularly imprinted polymer layer-coated silica nanoparticles toward dispersive solid-phase extraction of trace sulfonylurea herbicides from soil and crop samples
Wu et al. Synthesis of bilirubin imprinted polymer thin film for the continuous detection of bilirubin in an MIP/QCM/FIA system
Dias et al. Molecularly imprinted polymer as a solid phase extractor in flow analysis
Du et al. An in situ immobilized pipette tip solid phase microextraction method based on molecularly imprinted polymer monolith for the selective determination of difenoconazole in tap water and grape juice
Ebrahimzadeh et al. Determination of haloperidol in biological samples using molecular imprinted polymer nanoparticles followed by HPLC-DAD detection
CN109406474A (zh) 一种检测罗丹明b的聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器的制备方法及应用
Qin et al. Selective extraction and detection of norfloxacin from marine sediment and seawater samples using molecularly imprinted silica sorbents coupled with HPLC
Khorrami et al. Design of a new cartridge for selective solid phase extraction using molecularly imprinted polymers: Selective extraction of theophylline from human serum samples
Mabrouk et al. Tipps and tricks for successful preparation of molecularly imprinted polymers for analytical applications: A critical review
Yang et al. Development of a selective molecularly imprinted polymer-based solid-phase extraction for indomethacin from water samples
Liu et al. A novel multi-purpose MIP for SPE-HPLC and QCM detection of carbaryl residues in foods
Zougagh et al. Automatic selective determination of caffeine in coffee and tea samples by using a supported liquid membrane-modified piezoelectric flow sensor with molecularly imprinted polymer
Ansari Application of hollow porous molecularly imprinted polymers using K 2 Ti 4 O 9 coupled with SPE-HPLC for the determination of celecoxib in human urine samples: optimization by central composite design (CCD)
Rezaei et al. Application of molecularly imprinted polymer for solid phase extraction and preconcentration of hydrochlorothiazide in pharmaceutical and serum sample analysis
Yuan et al. Sensitive determination of rose bengal in brown sugar by a molecularly imprinted solid-phase extraction monolithic capillary column coupled with capillary electrophoresis
FR2935806A1 (fr) Kit utile pour la detection, la separation et/ou la caracterisation d'une molecule d'interet.
Lay et al. Molecularly imprinted polymers as the extracted sorbents of clenbuterol ahead of liquid chromatographic determination
Guo et al. Development of a molecularly imprinted polymer for prometryne clean‐up in the environment
Syu et al. Binding specificity of α-bilirubin-imprinted poly (methacrylic acid-co-ethylene glycol dimethylacrylate) toward α-bilirubin

Legal Events

Date Code Title Description
ST Notification of lapse

Effective date: 20151130