WO2008132384A2 - Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant - Google Patents

Kit d'analyse comprenant au moins deux polymeres a empreintes moleculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procede d'analyse l'utilisant Download PDF

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Definitions

  • Krt analysis comprising at least two molecular imprinted polymers and at least one marker, and the method of analysis using it
  • the present invention relates to the field of molecular imprinted polymers (also called “molecularly imprmted polymers” or “MIPs” in English) useful for the recognition of target molecules.
  • molecular imprinted polymers also called “molecularly imprmted polymers” or “MIPs” in English
  • It relates more particularly to a kit for analyzing at least one target molecule, or a family of target molecules, comprising at least two MIPs and at least one marker, as well as an analysis method using such a kit.
  • the methods used up to now for these treatments most often lack specificity.
  • the detection step conventionally involves non-stable compounds chemically or mechanically, which can not be reused, and moreover generally has very long analysis times.
  • MIPs for the implementation of SPE type extractions is already known in particular.
  • MIPs are indeed advantageous because of their high specificity and their excellent chemical, mechanical and thermal stability. They are moreover known to be easily synthesizable and inexpensive if the boss entity is available at low cost.
  • Ohnmacht C.M., Chiel JE, Hage DS Anal Chem 2006, 78, 7547-7556 the use of MIPs in a solid phase extraction process thus makes it possible to advantageously obtain, in a single step , an extract enriched in a given analyte
  • the MIPs can for example be used in radioimmunoassay type assays, in which said MIPs are substituted for the antibodies and in which they can, in the same way as the antibodies, be provided with markers capable of being put into competition. with analytes of interest.
  • MIPs in such methods of analysis has many advantages, such as the use of more stable compounds than antibodies, which can be used in both aqueous and non-aqueous media. , and does not require coupling of the analyte (in the case of small molecules), m the use of laboratory animals for their production. This is why MIPs are progressively replacing antibodies in many areas of analysis.
  • Chianella et al already describe the use of the same MIP to proceed, on the one hand, to the target molecule concentration of the sample to be analyzed by SPE, and on the other hand, to the consecutive analysis of said target molecule
  • the detection of the target molecule is based in this document on the use of a piezoelectric sensor coated on the surface of the same MIP as that used for the SPE concentration step. The detection is then carried out by measuring the frequency, which is proportional to the mass in target molecule (Chianella L, Piletsky SA, Tothill I E., Chen B. Turner APF, Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18, 119-127).
  • US 6 461 873 teaches the implementation of two separate MIPs for the analysis of caffeine contained in a drink.
  • the process described in this document firstly comprises a first step in which the first MIP absorbs the interferents present in the beverage to be analyzed.
  • This first step is intended to improve the implementation of the second step, dedicated for its part to the detection of caffeine itself through the use of a second MIP specifically absorbing it.
  • Fanalyte assuming that it is, for example, present in the trace state in the sample analyzed.
  • the pre-processing step described in this document requires that they have been identified.
  • the method according to this teaching does not allow analysis of analytes implemented in too complex environments.
  • PS Sharma et al finally describe a method consisting of a first step of pre-treatment of a solution comprising creatinine by an SPE column comprising a MIP specific for this molecule, followed by a detection step by voltammetry of differential cathodic redissolution. pulsed by a drop mercury electrode pendant modified by a second MIP identical to that implemented during the first step (PS Sharma, D. Lakshmi, BB Prasad, Chromatographia, 2007, 65, April (No. 7/8)).
  • an analysis kit that does not require bulky and / or expensive imaging equipment, for example chromatography equipment (GC, LC, HPLC), piezoelectric sensors or apparatus. using electrodes (in the case of voltammetric techniques, in particular of the type by anodic or cathodic stripping analysis).
  • imaging equipment for example chromatography equipment (GC, LC, HPLC), piezoelectric sensors or apparatus.
  • electrodes in the case of voltammetric techniques, in particular of the type by anodic or cathodic stripping analysis.
  • test kit that is portable and can be easily transported and used at home, in a clinic, a doctor's office, outside a hospital, in a factory or on the premises. ground.
  • an assay kit useful for detecting analytes devoid of easily detectable moieties, such as for example chromophores or fluorophores.
  • an improved sensitivity analysis kit in particular for detecting and determining the concentration of analytes present in very low concentrations in a sample.
  • an analysis kit comprising at least two MIPs and at least one specific marker makes it possible to meet these needs.
  • the present invention relates, in one aspect, to a kit for analyzing at least one target molecule comprising at least first and second chemically identical or different molecular imprinted polymers capable of interacting with the (or target molecule (s), and at least one marker, said marker being either a competitive marker or capable of interacting with all or part of the recognition sites of the target molecule (s) ( s) of the second molecular-fingerprint polymer and (n) to be moved from the said recognition site (s) by the target molecule (s) during the bringing together said second molecular imprinted polymer with said target molecule (s), either an intrinsic marker or a constituent unit of the second molecular imprinting polymer and capable of interacting with all or part of the target molecule (or molecules) when the one (s) interagi (ssen) t with all or part of its sites of recognition of the (or) said molecule (s) target (s) and (U ') to emit accordingly a detectable signal.
  • the present invention also relates, in one of its aspects, to a kit for analyzing at least one target molecule comprising at least a first and a second chemically different molecular imprinted polymer capable of interacting with the molecule (s) ( s) target (s), and at least one marker, said marker being either a competitive marker or capable of (i) interacting with all or part of the recognition sites of the target molecule (s) of the second molecular-fingerprint polymer and (ii) to be moved from said recognition site (s) by the target molecule (s) when said second polymer is placed in contact with said second polymer molecular imprints with the said target molecule (s), either an intrinsic marker or a constitutive unit of the second molecular-fingerprint polymer and capable of interacting with all or part of the target molecule (s) when interacting (s) with all or part of its recognition sites of the (said) molecule (s) target (s) and (U ') to emit accordingly a detectable signal.
  • the present invention also relates, in another of its aspects, to a kit for analyzing at least one target molecule comprising at least a first and a second chemically different molecular imprinted polymer capable of interacting with the molecule (s).
  • target (s) and at least one marker said marker being able to emit a detectable signal when said second molecular-fingerprint polymer is brought into contact with said target molecule (s) ( s).
  • the object of the present invention is to provide users with an analysis kit offering the means of carrying out targeted analyzes, and which is flexible both from the point of view of its conception and from the point of view of of its use, as is clear from the following.
  • the wide range of synthesizable MIPs in terms of polarity, hydrophobicity, site densities, magnetic and physico-chemical properties, for example), the various possible conditions of use (in terms of pH, salinity, temperature, flow rate, pressure or polarity of solvents, for example), the multiple markers that can be used, and the various supports available are as many parameters that can be selected or adjusted according to the needs of the user, and in particular according to the nature of the target molecule (s), as well as according to the application target (sensitivity of the detection, selectivity limited for example to a particular target molecule or on the contrary widened to a family of target molecules).
  • the kit via the choice of the "competitive" marker, ie capable of (i) interacting with all or part of the recognition sites of the molecule (s) (s) target (s) of the second molecularly imprinted polymer and (n) to be moved from the said recognition site (s) by the target molecule (s) during the bringing said second molecular-fingerprint polymer into contact with said target molecule (s).
  • the "competitive" marker ie capable of (i) interacting with all or part of the recognition sites of the molecule (s) (s) target (s) of the second molecularly imprinted polymer and (n) to be moved from the said recognition site (s) by the target molecule (s) during the bringing said second molecular-fingerprint polymer into contact with said target molecule (s).
  • Such an adaptation may in particular be advantageous for achieving, for example during a pre-processing step, an optimal selectivity, namely such that the interfering entities initially present in the solution to be analyzed are, if necessary, eliminated, while keeping the target molecule (s) in the pre-treated solution, and thus purifying and possibly enriching the target molecule (s)
  • the invention also relates, in another of its aspects, to a method for analyzing at least one target molecule comprising at least one step of using a kit according to the invention. It also relates, according to another of its aspects, the use of a kit according to the invention for the analysis of drugs, pollutants, chemicals, contaminants, and the like
  • target molecule or “analyte” is intended to mean any entity that it is desired to detect.
  • Marker means any chemical entity, and for example any molecule that is similar in structure and / or in affinity to the target molecule (s) or all or part of at least one constituent unit of an MIP , and detectable by visible colorimetry, for example detectable by the naked eye, by radiochemistry, by nuclear medicine, for example by scanning, imaging, resonance (MRI), X-ray, light scattering, mass spectrometry by spectroscopy, for example by fluorescence or UV-visible, by infrared spectroscopy, by surface plasmon resonance spectroscopy, by chemiluminescence, by interference and refraction spectroscopy, by Raman scattering, by ultrasound, by radioactivity, by refractometry, by optical, piezoelectric, acoustic, electrochemical, conductivity, pH metric or biological detection
  • Signal a physical or chemical parameter that can be detected by any technique known to those skilled in the art, in particular by a technique mentioned above.
  • the signal emitted by the marker is detected by visible colorimetry, by fluorescence or by UV, and preferably by the naked eye.
  • a signal according to the invention mention may notably be made of an absorption or emission wavelength detectable by visible colorimetry or by spectroscopy or by fluorescence, a color change detectable by the naked eye, a refractive index detectable by surface plasmon resonance spectroscopy, detectable brightness by light scattering, a mass detectable by a piezoelectric sensor, a beta emission detectable by a scintillation counter, a detectable oxidation potential by electrochemistry.
  • absorption or emission wavelength detectable by visible colorimetry or by spectroscopy or by fluorescence a color change detectable by the naked eye
  • a refractive index detectable by surface plasmon resonance spectroscopy detectable brightness by light scattering
  • a mass detectable by a piezoelectric sensor a beta emission detectable by a scintillation counter
  • a detectable oxidation potential by electrochemistry - "recognition site", the cavity of the MIP matrix that effectively intervenes in the recognition of the target molecule (
  • Complex medium means a medium comprising, in addition to the target molecule (s), one or more additional entities, at least some of which are capable of interfering with the said molecule (s) (s) target (s) in at least one of the steps of the analysis (pre-treatment step and / or detection step), and disrupt the interpretation of the results.
  • complex media As examples of complex media according to the invention, particular mention may be made of body fluids such as blood, plasma, saliva, urine, bile, tears, breast milk, or culture, cell lysates, plant extracts, foods, environmental media (soil, water, air), beverages such as wine, milk, fruit juice, beer, or gaseous media.
  • body fluids such as blood, plasma, saliva, urine, bile, tears, breast milk, or culture, cell lysates, plant extracts, foods, environmental media (soil, water, air), beverages such as wine, milk, fruit juice, beer, or gaseous media.
  • Race state any concentration between 1 ng / L and 10 mg / L, especially between 5 ng / L and 1 ⁇ g / L, preferably between 10 ng / L and 500 ng / L
  • Interaction occurring between the target molecule (s) and a recognition site, between a competitive marker and a recognition site or between an intrinsic marker and the target molecule (s) ( s), the formation of weak bonds (eg Van der Waals bonds, hydrogen bonds, pi-donor-pi bonds acceptor, or hydrophobic interactions) and / or strong bonds (for example of ionic bonds, covalent bonds or ionocovalent bonds, coordination bonds, and dative bonds).
  • weak bonds eg Van der Waals bonds, hydrogen bonds, pi-donor-pi bonds acceptor, or hydrophobic interactions
  • strong bonds for example of ionic bonds, covalent bonds or ionocovalent bonds, coordination bonds, and dative bonds.
  • FIG. 1 represents, in the form of a block diagram, the various steps of the analysis method according to the invention.
  • FIG. 2 illustrates the implementation of the detection step of the method according to the invention, according to the particular embodiment in which the second molecular-fingerprint polymer is packaged in an SPE cartridge and the target molecule is dopamine and the marker is detectable to the naked eye, according to the examples.
  • FIG. 3 is a graph indicating the quantities of
  • FIG. 5 represents a part of a variant of an analysis kit according to FIG. 4.
  • FIG. 6 illustrates an embodiment where the MIPs are integrated in a block system.
  • the MIPs of the kit according to the invention may be intended to recognize several target molecules according to the intended use.
  • the invention is not limited to only those embodiments where the recognition properties target a single target molecule.
  • the kit according to the invention may be intended for the analysis of a family of target molecules, that is to say to the analysis of a set of different molecules that are susceptible to to be detected by the same site of recognition of a PIM and having for example a structure analogy and / or a given and common arrangement of functional groups.
  • the family of target molecules that can be analyzed may comprise a more or less wide set of different molecules.
  • the assay kit according to the invention comprises at least two MIPs, chemically identical or different, having at least recognition sites capable of interacting with the target molecule (s) (also known as recognition of the target molecule (s) ").
  • kit means a packaging unit, in which the said at least two MIPs are packaged separately from one another, for example in two compartments or on two separate supports such as as defined below, for example on SPE cartridges. Said supports, and for example said cartridges, can then be arranged within one and the same block system, as illustrated for example in FIG. 6.
  • At least one molecular imprinted polymer may be intended for a pre-treatment step of the sample, such as, for example, the extraction of the target molecule (s). (s), by molecular recognition of the target molecule (s).
  • extraction of the target molecule (s) by molecular recognition of the target molecule (s) means within the meaning of the invention a step during which the interaction of the target molecule (s) with the recognition sites of a MIP is sufficient to lead to the formation of a complex composed of MIP endowed, in all or some of its sites of recognition of the target molecule (s).
  • the recognition sites of the first MIP may initially be partly, or even preferably entirely, vacant.
  • all the recognition sites of the target molecule (s) of the first MIP of the kit according to the invention is vacant.
  • all the recognition sites of the first MIP of the kit according to the invention is vacant.
  • the first MIP can thus allow, according to one embodiment of the invention and after release of the target molecule (s) extracted (s), obtaining a purified solution or enriched in the target molecule (s).
  • release of the target molecule (s) extracted (s) means in the sense of the invention a step during which the complex formed during the extraction of the (or target molecule (s) by molecular recognition of the target molecule (s) dissociates, for example following a modification of the conditions of pH, salinity, temperature, flow, pressure, or polarity of the solvents, leading to the presence of the target molecule (s) in a free form in solution.
  • At least one other molecular imprinted polymer (hereinafter referred to as the "second MIP") of the same or different chemical nature of the first molecular imprinted polymer may, either when it is provided in all or some of its recognition sites with the (or) target molecule (s) of at least one competitive marker, or when it consists of at least one intrinsic marker, as defined below, to be intended for the detection or even the determination of the concentration, of the target molecule (s), as described in more detail below.
  • the marker, the signal or a signal variation emitted by the marker may in particular be detected, for example after release or as a result of an interaction with the target molecule, by visible colorimetry, for example with the naked eye, by radiochemistry, by nuclear medicine, for example by scintigraphy, by imaging, by resonance (MRI), by X-rays, by light scattering, by mass spectrometry, by spectroscopy, for example by fluorescence or by UV-visible, by infrared spectroscopy, surface plasmon resonance spectroscopy, chemiluminescence, interference and refraction spectroscopy, Raman scattering, ultrasound, radioactivity, refractometry, optical, piezoelectric, acoustic, electrochemical, conductivity detection by pHmetry, or alternatively biologically, and preferably by the naked eye.
  • the marker, the signal or the signal variation emitted by the marker is detected by visible colo ⁇ metry, by fluorescence or by UV, and preferably by the naked eye.
  • the second molecular imprinted polymer may be of a different chemical nature from the first molecular imprinted polymer.
  • first and second MIPs so that they have different affinities for the target molecule (s), and in particular affinities optimized according to their condition. of use.
  • Such an optimization of the recognition of the target molecule (s) for each step of the analysis can thus make it possible, for example, to target the target molecule as efficiently as possible during the pre-treatment and detection.
  • the selection of two different chemical MIPs is also useful in that it makes it possible to use the purified solution obtained at the end of the first step for the implementation of the detection step.
  • the marker may be able (i) to interact with all or part of the recognition sites of the target molecule (s) of the second molecular-fingerprint polymer and (n) to to be moved from said recognition site (s) by the target molecule (or molecules) when said second molecular-fingerprint polymer is brought into contact with said one or more Target molecule (s).
  • Such a marker is referred to as the "first type of marker” or “competitive marker” in the following.
  • first and second MIPs are chemically identical, it is within the scope of the present invention that they must be packaged separately.
  • At least the competitive marker and the second molecular imprinting polymer may be packaged separately, for example in two separate compartments.
  • the user brings the marker into contact with the second MIP, so that said marker interacts with the recognition sites of the target molecule (or molecules) of said second MIP, prior to the setting in contact with the second MIP, the purified solution, and optionally enriched in molecule (s) target (s).
  • at least the competitive marker and the second molecular imprinting polymer may be packaged together so that the second molecular imprinting polymer is provided, in all or part of its recognition sites with the molecule (s) target (s), said marker.
  • said marker must be able to interact with all or part of the recognition sites of the target molecule (s) of the second MIP, and also be able to be moved by the target molecule (s) of all or part of these sites when the second MIP is placed in the presence of the target molecule (s)
  • target molecule (s) only if the conditions for placing the second MIP endowed with said marker with the target molecule (s) are conducive to the interaction of said target molecule (s) with the recognition sites of said second MIP.
  • the second MIP may also have, in addition to the recognition sites of the target molecule (s), other different recognition sites that may also each interact with at least one competitive marker according to the invention. invention. These other recognition sites can thus detect or even determine the concentration of other types of target molecules under the same conditions of use or under different conditions of use.
  • the competitive marker must therefore have a lower affinity for these recognition sites than the target molecule (s), under the conditions of use of the second MIP.
  • the second MIP according to the invention when the second MIP according to the invention is provided in all or part of its recognition sites of the target molecule (s) of at least one competitive marker, and is then put in the presence of a solution comprising the target molecule (s), said marker must be moved from the recognition sites of said second MIP by the target molecule (s) and thus be substituted by the (or the) said molecule (s) target (s): we are talking about a competitive displacement of the marker by the target molecule (s).
  • the present invention comprises the case where the detection is different depending on whether the competitive marker is in free form, for example after release, or still present in the recognition sites of the MIP.
  • each recognition site of the target molecule (s) of the second molecular imprinted polymer can interact with a single competitive marker, in particular a single competitive marker molecule.
  • each recognition site of the target molecule (s) of the second molecular imprinted polymer can interact with several competitive markers, in particular several competitive marker molecules.
  • the first and second molecular imprinting polymers may be identical in terms of their chemical nature.
  • the second molecular imprinting polymer and the first type of marker or competitive marker are packaged together so that the second molecular imprinting polymer is provided, in all or part of its recognition sites of the (or) target molecule (s) of at least one marker, the first and second molecular imprinted polymers can be differentiated solely by the presence of said marker in all or part of the recognition sites of the molecule (s) target (s) of the second molecular imprinted polymer.
  • the first and second molecular imprinting polymers may be of different chemical nature, independently of the presence or absence of at least one competitive marker in all or part of the recognition sites of the or target molecule (s) of said second molecular imprinted polymer.
  • Intrinsic marker may be of different chemical nature, independently of the presence or absence of at least one competitive marker in all or part of the recognition sites of the or target molecule (s) of said second molecular imprinted polymer.
  • the marker may be a constitutive unit of the second molecular imprinting polymer and be able (1 ') to interact with all or part of the target molecule (s) when that ( s) Interagi (ssen) t with all or part of its sites of recognition of the (or) said molecule (s) target (s) and (n ') to emit accordingly a detectable signal.
  • Such a marker is referred to as “second type of marker” or “intrinsic marker” in the sequel
  • the term "constituent of the second molecular imprinted polymer” is understood to mean part of the chemical constitution of said molecular imprinted polymer.
  • a second molecular imprinted polymer according to this second embodiment is formed in part, but not necessarily exclusively, of such a pattern.
  • the intrinsic marker may be partly constitutive of the recognition sites of the target molecule (s) of the second molecular imprinting polymer.
  • the intrinsic marker may not be constitutive of said recognition sites of the target molecule (s) of the second molecular-fingerprint polymer but be located close to them. Modes of preparation of such molecular fingerprint polymers are shown below, for illustrative purposes.
  • Said group can be directly linked to the marker by a covalent bond or be separated from said marker by a spacer ("linker" in English language), as described below.
  • the indirect interactions then occurring between the marker and the target molecule may be due to a modification of the environment, for example electronic, of the marker, induced in particular by said group.
  • the interactions between the intrinsic marker and all or part of the target molecule (s) occur when the latter interact with all or part of the recognition sites of the (or ) said target molecule (s) of the second molecular imprinted polymer.
  • This chain of interactions must also cause according to the invention the emission of a signal by the marker, which is detectable.
  • a variation of the signal emitted by the marker can also be detected, in particular a variation between, on the one hand, the signal emitted by the marker before interaction with all or part of the molecule (s) target (s) and secondly the signal emitted by the marker during said interaction.
  • the second molecular imprinting polymer consisting of at least one intrinsic marker may be derived from the copolymerization of at least one monomer consisting in whole or part of at least said marker.
  • Such monomers may in particular be obtained by chemically modifying a marker so as to incorporate therein a polymerizable unit, optionally separated from said marker by a spacer.
  • each site for recognizing the target molecule (s) of the second molecular-fingerprint polymer may consist of, or present at its proximity, a single intrinsic marker, in particular a single molecule.
  • each site for recognizing the target molecule (s) of the second molecular-fingerprinted polymer may consist of, or present at its proximity, several intrinsic markers, in particular several marker molecules.
  • the first and second MIPs can be implemented on any suitable medium.
  • support is very broadly understood to mean any solid, flexible or rigid substrate on or in which the MIPs are capable of being bound, glued, deposited, synthesized in situ, filled and / or packaged.
  • the supports that can be used according to the invention can be of any kind, for example of a biological, non-biological, organic or inorganic nature, or even of a combination thereof. They can be in any form, including in the form of particles, gels, leaves, tubes, spheres, capillaries, dots, films, wells, any size and any shape.
  • the supports may more particularly be in the form of films.
  • the MIPs may for example be in the form of particles of uniform size, in particular between 10 nm and 10 mm, for example between 100 nm and 1 mm, in particular between 1 ⁇ m and 100 ⁇ m, preferably between 25 and 45 ⁇ m likely to be subsequently packaged in cartridge form.
  • the first and second MIPs may for example be implemented on or in a support selected from an SPE cartridge, a multiwell plate, such as a 96-well plate, a patch, a tea bag ("tea").
  • the analysis method according to the invention may optionally further comprise a step of conditioning the first molecular imprinting polymer prior to the pre-treatment steps (i) and (ii) described below and or a step of conditioning the second molecular imprinted polymer prior to the detection steps (iii) and (iv) described hereinafter.
  • the first molecular imprinting polymer can be implemented on an extraction column, for example an SPE cartridge.
  • the second molecular imprinting polymer may be implemented on an SPE cartridge, optionally graduated.
  • Figure 2 illustrates this aspect of the invention when the marker is detectable to the naked eye.
  • the kit according to the invention may, for example, be in the form of a packaging assembly, comprising at least one SPE cartridge containing the first MIP which will allow loading, washing and then elution to recover the molecule (s) (s) ) target (s) in free form and at least one SPE cartridge containing the second MIP with at least one type of recognition site containing at least one competitive marker as described previously able to be displaced by the molecule (s) ( s) target (s), ie at least one intrinsic marker as described above capable of emitting, as a result of its interaction with all or part of the target molecule (s), a detectable signal.
  • a packaging assembly comprising at least one SPE cartridge containing the first MIP which will allow loading, washing and then elution to recover the molecule (s) (s) ) target (s) in free form and at least one SPE cartridge containing the second MIP with at least one type of recognition site containing at least one competitive marker as described previously able to be displaced by the molecule (
  • the MIPs can in particular be optimized so as to obtain the best recognition and detection properties for each of the analysis steps (pre-processing and detection), according to the affinity of the target molecule (s) and, where appropriate, the competitive marker, against them or according to the interaction between the intrinsic marker and the target molecule (s) ( s).
  • affinity refers to the ability of an entity (for example a target molecule or a marker as defined above) to interact with a recognition site of a MIP.
  • a high affinity thus translates, in the sense of the invention, a strong ability for this entity to interact, with at least one recognition site of a MIP.
  • weak bonds for example of Van der Waals bonds, hydrogen bonds, acceptor pi-donor bonds, or hydrophobic interactions
  • strong bonds for example ionic bonds, covalent bonds, or ionocovalent bonds, coordination bonds and dative bonds.
  • an entity for an MIP recognition site can be evaluated by experimentally measuring the capacity factor of this site vis-à-vis this entity, for example by performing a chromatographic analysis of the entity whose it is desired to determine the affinity through a stationary phase comprising at least the MIP recognition sites to which it is desired to determine the affinity of said entity.
  • the capacity factor "k" of these recognition sites corresponds according to this protocol to the ratio of the time spent by this entity in the stationary phase, compared to the time spent by this same entity in the mobile phase. It can be determined experimentally by the ratio: where t r denotes the retention time, and t m is the dead time.
  • the capacity factor does, however, account for not only specific molecular recognition interactions between the target molecule (s) and the MIP recognition sites, but also non-specific interactions between the so-called target molecule (s) and the material of which the MIP is made.
  • the imprinting factor also called
  • K non-printed polymer (1) thus accounts for the efficiency of a PIM in terms of molecular recognition, regardless of the chemical nature of its polymeric matrix.
  • the affinity depends on both the entity and the MIP, but it also varies depending on the conditions of use. It can thus vary in particular with the solvating medium, and depend in particular on the pH conditions, the medium salinity, temperature, flow, pressure, as well as the polarity of the solvent.
  • the affinity may also be adapted, depending on the use envisaged, during the preparation of the first and second MIPs, by varying in particular the synthesis conditions (nature of the solvent, temperature, concentration of the reagents, nature of the initiator. ..), the pattern entities, the initial monomers or the crosslinking agent used to make the MIP.
  • synthesis conditions nature of the solvent, temperature, concentration of the reagents, nature of the initiator. ..
  • the pattern entities the initial monomers or the crosslinking agent used to make the MIP.
  • the polymerization step of the MIP around a boss entity uses techniques known to those skilled in the art.
  • these MIPs are obtained by copolymerizing monomers and crosslinking agent (s) in the presence of an entity which is precisely to form the imprint.
  • the monomers arrange specifically around this entity, also called “boss entity", by strong or weak interactions, then are polymerized generally in the presence of a high level of crosslinking agent. After polymerization, the entity is extracted from the polymer material and thus leaves its molecular imprint in cavities within the material which constitute real synthetic receptors comparable to the biological receptors of the antibody type.
  • the boss entity may be the same or different from the target molecule.
  • the document WO 07/004197 describes in particular the use of a boss entity of a polymeric nature, different from the target molecule (s), for the synthesis of MIPs.
  • the interactions between the monomers and the boss entity are of the covalent labile bonds type.
  • the recognition of target molecules is also effected by the formation of a covalent bond between the imprint and the target molecule in question.
  • the interactions between the monomers and the boss entity are weak bonds of the hydrogen bonding type, acceptor pi - pi, van der Waals bonds, or hydrophobic interactions.
  • the recognition of target molecules is also carried out by non-covalent interactions between the imprint and the target molecule.
  • the interaction takes place at least in two distinct sites of the recognition site as is for example disclosed in Wulff G. et al. Macromol. Chem. Phys. 1989, 190, 1717 and 1727.
  • the MIP or more precisely the matrix constituting it, can thus be formed by radical copolymerization.
  • Vinyl monomers monomers derived from styrene, methacrylic acid, are monomers particularly suitable for this technique. Any initiator may be used, such as azobisisobutyronitrile (AIBN).
  • the second MIP comprises at least one intrinsic marker as described above, it may in particular be derived from the copolymerization of at least one particular monomer consisting of at least one polymerizable unit, such a marker and, where appropriate, of a spacer.
  • the first and / or second molecular imprinted polymer, and in particular the second molecular imprinted polymer can be used during their course of action.
  • polymerization step at least (E) -1- (2-methacryloxyethyl) -3- [4- (4-nitrophenyl) phenyl] phenylthiourea.
  • MIP can also be formed by radical copolymerization, in order to vary the properties of the polymer.
  • the copolymer of methyl methacrylate / butyl methacrylate may be mentioned.
  • the MIP can be formed of crosslinked polymers or copolymers. Depending on the degree of crosslinking, it is referred to polymer or copolymer connected, macroscopic networks or microgels.
  • acidic monomers methacrylic acid (MAA), p-vinylbenzoic acid, acrylic acid (AA), itaconic acid, 2- (trifluoromethyl) acrylic acid ( TFMAA), acrylamido (2-methyl) -propane sulfonic acid (AMPSA), 2-carboxyethyl acrylate
  • basic monomers 4-vinylpyridine (4-VP), 2-vinylpyridine (2-
  • VP 4- (5) -vinylimidazole, 1-vinylimidazole, allylamine, N, N'-diethylaminoethyl methacrylamide (DEAEM), N- (2-aminethyl) methacrylamide, N, N'-diethyl-4-styrylamidine, N, N, N-trimethyl aminoethyl methacrylate, N-vinylpyrrolidone (NVP), ethyl urocanic ester, neutral monomers: acrylamide, methacrylamide, 2-hydroxyethyl methacrylate (2-HEMA), alpha-3-ethyl acid (3-pyridyl) -acrylic, acrylonitrile (AN), methyl methacrylate (MMA), styrene, ethylstyrene.
  • DEEM N, N'-diethylaminoethyl methacrylamide
  • NDP N-trimethyl aminoethyl methacrylate
  • the first and / or second molecular-fingerprint polymers can be used during their polymerization step at least 5- [2- (N-tert-butoxycarbonyl) ethylamino] -2- (4-vinylphenyl) benzo [3,2] dioxoborole.
  • this embodiment of the invention may in particular be derived from the copolymerization of at least 5- [2- (N-tert-butoxycarbonyl) ethylamino] - 2- [4-vinylphenyl] benzo [1,2,3] dioxoborole and at least 2-carboxyethyl acrylate, with for example at least divinylbenzene or dimethacrylate ethylene glycol.
  • FIG. 1 illustrating the arrangement of the different steps of the method according to the invention.
  • the present invention also relates, in another of its aspects, to a method for analyzing at least one target molecule comprising at least one step of using a kit according to the invention.
  • the target molecule (s) may for example be present in a solution, and in particular be present in a complex medium, or may be present in the trace state in a sample.
  • It may in particular be a method of analysis of at least one molecule likely to be present in a solution comprising at least: (i) a step of bringing said solution into contact with a first molecular imprinting polymer capable of interacting with the target molecule (s) under conditions adapted to the extraction of the target molecule (s),
  • step (ii) forming a purified solution, optionally enriched in target molecule (s), from the target molecule (s) isolated in step (i), (iii) a step of contacting said purified solution, optionally enriched in target molecule (s), with a second molecular imprinting polymer, also able to interact with said molecule (s) (s) target (s), and is provided, in all or part of its sites of recognition of the target molecule (or molecules) of at least one competitive marker or capable of being displaced from (or said site (s) of recognition by the target molecule (s) under the conditions of realization of said step (iii), consists of at least one intrinsic marker or suitable for interact with all or part of the target molecule (s) when they interacted with all or part of its recognition sites (or) so-called target molecule (s) e t to emit a detectable signal accordingly and (iv) a step of qualitative, quantitative and / or semi-quantitative detection of the target molecule (s), via the
  • the competitive marker and the second MIP can be packaged separately in two separate compartments, or be packaged together so that the second MIP is provided, in all or part of its recognition sites of the molecule (s). target (s), of said marker.
  • the method according to the invention may further comprise, prior to step (m), a step of contacting the second MIP with at least one competitive marker according to the invention. The conditions will then be advantageously adapted to the interaction of said marker (s) with the recognition sites of the target molecule (s) of the second MIP.
  • the step (I) may be a pre-treatment step of the solution comprising the target molecule (s), and for example be useful for extraction of the target molecule (s), so as to obtain a purified solution, and optionally enriched in target molecule (s).
  • Step (Ii) of release of the target molecule (s) extracted by the first MIP, so as to lead to the formation of a purified solution, and possibly enriched in target molecule (s), from the target molecule (s) isolated in step (1).
  • Step (Ii) may for example be carried out by bringing into contact with the target molecule (s) solute (s) in step (I) with a medium that is favorable for breaking their interaction with the first molecular imprinted polymer.
  • this step (1) of the pre-treatment makes it possible to eliminate the additional entities, different from the target molecule (s) and which are susceptible to interfere with the implementation of the stage
  • step (i) of the pre-treatment makes it possible to obtain, after liberation of the target molecule (s) extracted by the first MIP, a pre-treated solution enriched in target molecule (s), ie in which the molecule (s) (s) target (s) is (are) present in higher levels in comparison with the initial solution not having undergone step (i)
  • the degree of enrichment obtained at the end of step (i) may for example be between 2 and 1000, in particular between 5 and 100.
  • a solid phase extraction procedure generally has three or four steps.
  • the first is the conditioning of the adsorbent (comprising according to the invention at least a first MIP contained in the extraction cartridge, which allows to wet the support by solvating the functional groups present on its surface.
  • the solution to be treated is percolated on the first MIP, so that the entities having no affinity with the latter are not retained.
  • the target molecule (s), and possibly other entities having a high affinity with the adsorbent remain on the support at the end of this step.
  • An additional washing step may be performed to remove the entities seldom retained by the support, using a solvent of suitable eluting force to elute these entities while keeping the target molecule (s) on the support.
  • the target molecule (s) are eluted by passage of a specifically chosen solvent to enable the recognition interactions between the target molecule (s) to be broken. (s) and the first MIP while avoiding to elute interfering entities strongly retained on the support, so as to release the target molecule (s) extracted (s).
  • this pre-treated solution is obtained, and optionally enriched with the target molecule (s).
  • this pre-treated solution can be used as it is for the third step (iii), or be previously treated before being put in contact with the second
  • said solution purified and optionally enriched in molecule (s) target (s) is used as such for the third step (iii), that is to say without undergoing prior treatment
  • the solvents used during a solid phase extraction can be organic solvents such as acetonitrile, methanol, dichloromethane, aqueous solvents such as water, buffer solutions, solvents that can be used in a mixture and with different conditions of salinity, pH, polarity.
  • the target molecule will be retained more specifically in a MIP that it will develop the same type of interactions as those developed during the synthesis.
  • step (i) can be carried out using a solvent that is identical or similar to the solvent used during the synthesis of the first MIP.
  • a solvent that is identical or similar to the solvent used during the synthesis of the first MIP.
  • Other types of pretreatment steps can be envisaged, for example solid phase microextraction (SPME), solid phase dynamic extraction (SPDE or solid phase). dynamic extraction "in English), extraction on stirring bars (SBSE or
  • steps (iii) and (iv) of detection of the target molecule (s) are carried out after the pre-treatment steps (i) and (ii) described above. .
  • the implementation of a detection step according to the invention advantageously makes it possible to simply detect analytes which are devoid of easily detectable groups.
  • the purified solution optionally enriched in target molecule (s) obtained at the end of step (ii), can be directly contacted with the second MIP endowed, in all or some of its sites, with recognition for the target molecule (s) of at least one marker as described above. It can alternatively be treated before being brought into contact with said second MIP, so for example to modify its pH, the concentration of the target molecule (s), its salinity, or its polarity.
  • condition refers to the conditions of pH, concentration of target molecule (s), salinity, and polarity.
  • the solution obtained at the end of step (ii) can be directly contacted with the second MIP, said second
  • MIP being either provided, in all or part of its recognition sites with at least one competitive marker as described above, consists of at least one intrinsic marker as described above.
  • the first and second MIPs are of different chemical nature, and the competitive marker is chosen in such a way that it is able to be displaced by the target molecule (s), under the conditions set implemented during the step of releasing the target molecule (s) extracted (s) by the first MIP.
  • the intrinsic marker is chosen so that it is able to interact with all or part of the target molecule (s) when it interacts with all or part of the target molecule. sites for recognizing the said target molecule (s) of the second MIP, and consequently to emit a detectable signal under the conditions implemented during the step of releasing the or target molecule (s) extracted by the first MIP.
  • (ii) can be treated before being contacted with either the second MIP endowed, in all or part of its recognition sites for the target molecule (s), with at least one marker competitive as described above, either with the second MIP consisting of at least one intrinsic marker as described above.
  • first and second identical MIPs in terms of their chemical nature, and differing for example solely in the presence of at least one marker, for example a competitive marker in all or some of the sites of the invention.
  • the target molecule (s) of the second MIP recognition of the target molecule (s) of the second MIP, ie first and second MIPs of different chemical nature, such that the marker is or is able to be displaced by the molecule (s) target (s), under the conditions implemented during the step of releasing the target molecule (s) extracted by the first MIP (case of a competitive marker), or able to interact with the target molecule (s) and to emit a detectable signal accordingly (case of an intrinsic marker).
  • the solution enriched in target molecule (s) obtained at the end of step (ii) can in particular, according to this second variant embodiment, be treated so as to obtain conditions of pH, concentration of target molecule (s), salinity and / or polarity approaching those implemented in step (i) for the extraction of the (or target molecule (s).
  • this additional processing step may for example consist of achieving the best conditions of use required for the implementation of step (iii).
  • step (iii) is based on a competition test between the target molecule (s) and the competitive marker with respect to the recognition sites of a second MIP.
  • the competitive marker used in step (iii) must have a lower affinity for the recognition sites of the target molecule (s) of the second MIP that the target molecule (s), under the conditions of use of the second MIP in this step.
  • step (iii) The detection of the molecule (s) target (s) in step (iii) is thus based on a shift of the balance between the second MIPs with the (or) said marker (s) and secondly the second MIP with the target molecule (s), the formation of the latter complex being favored.
  • the second MIP can be adapted according to the knowledge of those skilled in the art, depending on the target molecule (s) and / or the marker and / or the conditions of use and / or or the intended application.
  • the competitive marker when the molecule is dopamine, and when the second MIP is used in methanol, the competitive marker may be in particular 6,7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin, as illustrated in Example 6 below.
  • a competitive marker having, for example, a high affinity for the recognition sites of the second MIP can only be displaced by a particular target molecule having an even stronger affinity for said recognition sites, whereas a competitive marker exhibiting a higher Low affinity for recognition sites of the second MIP may be more easily displaced by a target molecule, or even a family of target molecules.
  • the competitive marker can be displaced by the target molecule (s) in the presence of very low levels of target molecule (s), and for example by presence of concentrations below 1 ⁇ g / L or even below 100 ng / L.
  • the detection step (iv) according to the invention makes it possible to amplify the detection signal of the molecule (s) target (s), and therefore improve the sensitivity of the measurement.
  • step (iii) is based on the manifestation of an interaction between the target molecule (s) and at least one intrinsic marker constituting the second MIP.
  • an intrinsic marker according to the invention can either constitute a part of the recognition sites of the target molecule (s) of the second MIP and thus participate in their recognition, or be close to these sites. In both cases, the intrinsic marker must, however, be able to interact with all or part of the target molecule (s) when the one (s) is (are) extracted by the second MIP and must also be able to emit a detectable signal accordingly.
  • step (ni) The detection of the target molecule (s) in step (ni) thus rests in this embodiment on an interaction between at least one intrinsic marker and all or part of the molecule (s). target (s)
  • this interaction may be non-covalent, preferably of the weak bond type, and for example of the hydrogen bond type.
  • the method according to the invention may be intended for a qualitative analysis, that is to say to aim only at knowing if a target molecule (s) and (are) present in a particular environment.
  • the method according to the invention may also allow, in addition to this detection of the presence or absence of the target molecule (s), a semi-quantitative or even quantitative analysis of that (s), via either the determination of the quantity of released competitive marker, or the analysis of the signal emitted by the intrinsic marker
  • the step (iii) of detection makes effect a competitive displacement of said marker by the target molecule (s), such as the number of moles of salted label is a function of the number of moles of target molecule detected.
  • the variation of the signal is a function of the number of target molecule
  • an analysis kit according to the invention may furthermore comprise, according to one embodiment, a semi-quantitative analysis device and / or a device for quantitative analysis of the target molecule (s). (s), based either on the determination of the amount of released competitive marker, or on the analysis of the signal emitted by the intrinsic marker
  • These devices may include, where appropriate, calibration means for correlating the amount of salvaged competitive label or the amount of intrinsic marker emitting a detectable signal to the amount of molecule (s) target (s).
  • step (iv) detection it may be necessary to implement an additional processing step, prior to the step (iv) detection itself.
  • additional processing step for example, mention may notably be made of washes, in particular in the case where the second polymeric impression polymer is packaged in the form of an SPE cartridge.
  • step (iv) a semi-quantitative analysis device comprising at least two assay media comprising second molecular imprint polymers of the same or different kind having identical or different competitive markers or identical or different intrinsic markers, detectable for example by the naked eye
  • the markers may be identical, and the two analysis supports may have concentrations in distinct markers corresponding to target concentration ranges of the target molecule (s).
  • the second molecular imprinting polymer can be packaged in the form of a graduated SPE cartridge, and the competitive marker can be detectable by naked eye, for example by its characteristic color.
  • the detection step (iv) is then made possible by the observation of a disappearance of the color of the support, in the part of the support where the competitive displacement has already occurred.
  • the target molecule (s) concentration (s) for example by visualizing the advance of the fading of the second MIP by a graduation present on the support; this discoloration being a function of the concentration of the target molecule.
  • semi-quantitative analysis is also possible by staining by using intrinsic markers.
  • the marker concentration of the different supports by using second MIPs comprising densities at variable recognition sites, or by immobilizing a smaller amount of imprint on the support, or by mixing MIPs with polymers identical to those constituting the matrix of the MIPs, but without imprints, at given ratios.
  • the marker used according to the invention being by definition a detectable entity, it is also possible to precisely determine the target molecule concentration (s) by measuring either the total amount of a competitive marker released during the detection step (iii), ie the signal emitted by the intrinsic marker during the detection step (iii), and referring, if necessary, to the result of a calibration prior.
  • the assay kit according to the present invention can be used for many applications for assay purposes, and more particularly for the analysis of analytes present in complex or trace media in a sample
  • the analysis kit also includes a diagnostic kit, a screening kit, a kit for analyzing pollutants, toxic substances, drugs, contaminants, drugs, chemicals, perfume and dyes. It may especially be a diagnostic kit, a kit for analysis of pollutants, toxic, drugs, contaminants, drugs, chemicals, perfumes, dyes, vitamins, proteins , ammoacids and peptides, oligonucleotides, hormones, enzymes, biomarkers, metabolites, chemical or biochemical agents of war, sugars, polysaccharides, neurotransmitters, mycotoxins, pesticides, fungicides, herbicides, insecticides, fertilizers, antibodies, molecules indicating the safety and / or quality of food products, steroids, drugs or products or by-products of a reaction.
  • the target molecules that can be analyzed, for example, by means of the kit according to the invention are, in particular, dopamine and its derivatives, such as, for example, serotonin, Z-tyrosine, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid or else methoxytyramine, homocysteine, cystem, glucose, cholesterol, testosterone, anabolic steroids, estradiol, citrosine, vitamin K, vitamin D, vitamin B12, atrazine, phenobarbital, chloramphenicol, propranolol, theophylline, diethylstilbene, progesterone, organophosphorus, cocaine, THC, or Pochratoxme A.
  • dopamine and its derivatives such as, for example, serotonin, Z-tyrosine, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid or else methoxytyramine, homocysteine, cystem, glucose, cholesterol, testosterone, anabolic steroids, estradiol, citrosine, vitamin K
  • the analysis kit may be intended for the analysis of dopamine and / or its derivatives, as described above or in the analysis of Pochratoxme A.
  • a kit for analyzing at least one target molecule comprising at least a first and a second molecular imprinted polymer and at least one marker may be proposed for example to the user, in a box 1 containing, as may be see in FIG. 4, two syringes 2 and 3 respectively provided with the first and second MIPs 4 and 5, possibly a tube 6 (hemolysis tube or test tube) intended to receive the elution solution issuing from the MIP 4, a container 7 containing the elution solution 8, a container 9 containing a washing solution 10, a possible use manual 11 and optionally a container 12 containing reagents for adjusting the elution solution from the MIP 4.
  • a tube 6 hemolysis tube or test tube
  • the kit can be used for a single use or on the contrary have sufficient amounts of reagents and elution solution to allow the analysis of several target molecules.
  • Syringes 2 and 3 can be glass or plastic. They may comprise, as shown for the syringe 2, a body 15 and a piston 14.
  • the user introduces the solution to be analyzed into the syringe 2 by means of a preferably graduated pipette, not shown in FIG. 4.
  • the syringe 2 is represented in FIG. solution to be analyzed 13.
  • the target molecule is recovered by elution with the solution 8, optionally after one or more washings performed by the solution 10.
  • the elution solution thus recovered is then either introduced directly into the syringe 3 or recovered in the tube 6 for adjusting the medium with the reagent contained in the container 12 and then introduced into the syringe 3.
  • the same piston 14 or another piston is then used to perform the necessary pressure in the syringe 3 to allow the detection of the target molecule sought, by emiss ion of a signal following the contact with the MIP 5 of the elution solution recovered from the enrichment operation performed by the syringe 2.
  • the detection is visual so that the second syringe is graduated and allows a direct quantitative analysis, without going through additional equipment, since the whole of the elution solution recovered from the enrichment operation performed by the syringe 2 is fully passed through the MIP 5.
  • the presence of the target molecule results in an appearance, a disappearance or a color change proportional to the amount of molecule present .
  • the kit also includes the detection system, when the detection is performed by the naked eye.
  • a detection system can be a portable detector, for example fluorescence or UV.
  • the syringe is advantageously graduated and can be carried as a whole under the appropriate lamp to view the transmitted signal.
  • Syringes 2 and 3 may be rinsed with a suitable solution, not shown in Figure 4, for use for later use.
  • FIG. 4 A particular variant of use of the kit of FIG. 4 is represented in FIG.
  • the MIPs 4 and 5 are packaged in individual cartridges 17 and 18 which can be snapped onto the syringe 16 and the cartridge 17 respectively.
  • the syringe 16 illustrates the first pre-treatment step and the syringe 19, identical or different from the syringe 16, illustrates when it the detection step where the solution filling the syringe 19 is the eluting solution of the target molecule at the both conducive to the release of the MIP 4 target molecules and the interaction of the target molecule with the MIP 5
  • FIG. 6 shows an example of an analysis kit 20 according to the invention in which the MIPs 21 and 22 are integrated in a single system, miniaturized or not, which may be a microfluidic system.
  • a microfluidic system may be more particularly adapted to the treatment of small volumes of solution.
  • Such a microfluidic system can typically be in the form of a substantially flat system, for example a format of a bank card.
  • media including MIPs 21 and 22 may be fixed in the system, or removable.
  • the user can modulate the pair of MIPs which will be more particularly adapted to the targeted analysis.
  • Such a system can be advantageously transparent, and for example be made of glass or plastic
  • the containers containing the elution and washing liquids are not shown, nor the possible instructions for use.
  • the analysis kit 20 can for example comprise 3 inputs 23, 24 and 25 and 3 outputs 26, 27 and 28. Access to these inputs and / or outputs can be opened or closed by valves 29, 30, 31, 32, 33 and 34.
  • the user introduces the solution to be analyzed by the inlet 24, after having closed the valves 29 and 31.
  • This solution may for example be introduced by a pipette, a syringe or a syringe. micropump, not shown in Figure 6.
  • the solution to be analyzed is thus in contact with the MIP 21 under pressure so that the liquid containing the interferents is discharged through the outlet 26 when the valve 30 is open.
  • the user can carry out one or more washes of the MIP 21 by introducing in the same way a washing solution through the inlet 24, the valves 29 and 31 being closed and the valve 30 being open.
  • the resulting solution (s) and, if applicable, the interfering ones are thus directed towards the outlet 26.
  • the user can then proceed to elution of the target molecule by introducing an eluent solution through the inlet 24, the valves 29, 30 and 32 being closed and the valve 31 being open, and one of the valves 33 or 34 La Elution solution thus recovered is then put in direct contact with the MIP 22.
  • the user can proceed to the elution of the target molecule by introducing an eluent solution through the inlet 24, the valves 29 and 31 being closed, and the valve 30 being open.
  • the elution solution is then recovered by the outlet 26. It can then be introduced directly into the system through the inlet 25, the valve 31 being closed and the valve 32 being open and one of the valves 33 or 34, or alternatively treated, before being reintroduced into the system through the inlet 25, the valve 31 being closed and the valve 32 being open, and one of the valves 33 or 34.
  • the MIP 22 comprises a competitive marker
  • the marker thus displaced in the previous step can be driven with said solution to the output 27 or 28.
  • a detection system not shown, when the detection is not performed with the naked eye.
  • a detection system can be a portable detector, for example fluorescence or UV.
  • the MIP 22 When the MIP 22 consists of a marker that is competitive or intrinsic, the user can directly detect the signal emitted by said marker (non-displaced marker in the case of the competitive marker and marker emitting a signal in the case of the marker intrinsic).
  • this MIP may for example be provided with a graduation, not shown, for directly reading the transmitted signal level.
  • the system 20 may be rinsed with a suitable solution, not shown in Figure 6, for use for later use.
  • This solution may for example flow between the inlet 23 and the outlet 27, the valves 29, 31 and 33 being open and the valves 30, 32 and 34 being closed.
  • the signal of the marker can be detected by placing the system as a whole in or under a device adapted to said detection, such as, for example, a fluorescent lamp Encore more particularly, when the system and flat, and is for example in the form of a card, it can be introduced by a slot in a suitable detection device.
  • a device adapted to said detection such as, for example, a fluorescent lamp Encore more particularly, when the system and flat, and is for example in the form of a card, it can be introduced by a slot in a suitable detection device.
  • Example 1 Synthesis of the monomer derived from N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphenylethylamine. Synthesis of an MIP of the dopamine from the monomer derived from N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphenylethylamine, denoted "MIP No. 1” and a matrix denoted "Non-Printed Material No. 1", the two materials being based on divinylbenzene (DVB). Synthesis of a MIP of the dopamine from the monomer derived from N-iron-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphenylethylamine noted “MIP No. 2" and a matrix denoted "Non-Printed Material No. 2", the two materials being based on ethylene glycol dimethyl acrylate (EGDMA).
  • EGDMA ethylene glycol dimethyl acrylate
  • MIP No. 1 is prepared by mixing 725 mg of the monomer
  • the dimethyl acrylate of ethylene glycol is washed several times with a basic solution saturated with NaCl to remove the inhibitor. It is dried on MgS ⁇ 4 .
  • the azobisisobutyronitrile (AIBN) initiator is recrystallized from acetone.
  • MIP No. 2 is prepared by mixing 626 mg of the monomer 5- [2- (N-tert-butoxycarbonyl) ethylamino] -2- (4-vinylphenyl) benzo [1,2,2] dioxoborol, 6.48 g. ethylene glycol dimethylacrylate, 940 mg of 2-carboxyethyl acrylate in 9 mL of anhydrous chloroform. The mixture is degassed by bubbling nitrogen for 10 minutes and then 77 mg of AIB ⁇ are added. The polymerization is carried out at 50 ° C. for 48 hours to form a white monolith.
  • Unprinted material No. 2 is prepared by mixing 1.98 g of styrene,
  • the matrices prepared above are crushed coarsely and suspended in 80 ml of a 9% methanol solution of hydrochloric acid for 24 hours. Once filtered, the powder is resuspended in 80 mL of methanol for 24 hours. The filtered powder is then milled and sieved. The particles, the size of which is between 25 and 45 ⁇ m, are introduced into a 15 ⁇ 4.6 mm HPLC column and then pressed down and washed with a mixture of 5% Acetic Acetate in acetonitrile / H 2 O (97.5 / 2.5). then methanol for the study of dopamine recognition in HPLC. Thus we have 4 HPLC columns. In parallel, SPE cartridges with 25-45 ⁇ m particles are prepared with each matrix.
  • Example 2 Recognition properties vis-à-vis dopamine by HPLC. The recognition proceeds according to the diagram below.
  • a 1 mM solution of dopamine hydrochloride in methanol is injected onto the four filled columns of impression No. 1, non-printed material No. 1, impression No. 2 and non-printed material respectively. printed n ° 2.
  • the dopamine detection is made at 281 nm.
  • Injection volumes are 20 ⁇ L and 5 ⁇ L of a solution of acetone in methanol. Acetone is used to determine the dead volume of the column
  • the detection of the compounds is made at 281 nm. Injection volumes are 20 ⁇ L.
  • k '(capacity factor) and IF (imprint factor) are determined to evaluate the recognition of compounds on all matrices.
  • Fingerprints are selective for dopamine over molecules of similar structure. Impression # 1 is more selective than Impression # 2 in view of the values of the serotonin imprint factor on both prints.
  • Two cartridges of SPE are made by introducing 200 mg of each of the imprint matrices (imprints # 1 and # 2) between two frits. Dopamine extraction is then performed. To do this 5 mL of a phosphate buffer solution 10 mM at pH 7 are percolated on these cartridges followed by 5 mL of MiIIiQ water and 5 mL of MeOH to condition the cartridges before introducing dopamine.
  • the 3,4-dihydroxyphenylacetic acid is not retained on the imprint matrix and leaves as soon as the products are introduced.
  • Two cartridges of SPE containing 70 mg of imprint matrix are prepared. After conditioning, the cartridges are saturated with 500 ⁇ g of 6,7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarin in methanol. On the cartridge called “developer” 4 fractions of ImL containing 100 ⁇ g of dopamine and 10 ⁇ g of 6,7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarin are introduced. On the second cartridge named “control” only lO ⁇ g of 6,7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarin are introduced. Fractions of ImL containing 10 ⁇ g of
  • Two cartridges of SPE containing 25 mg of imprint matrix are prepared. After conditioning, 35 ⁇ g of 6,7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarme contained in 1 ml of methanol are percolated followed by ImL of MeOH. On the cartridge named "developer” ImL MeOH containing either lOO ⁇ g or 50 ⁇ g of dopamine is introduced. On the second cartridge named "control” only ImL of MeOH is introduced. ImL fractions of MeOH are then percolated on both cartridges.
  • the graph of FIG. 3 gives the amounts obtained of 6,7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin in these various fractions during the introduction of 100 ⁇ g of dopamine.
  • the following table gives the amounts obtained of 6,7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarme in these various fractions after percolation of 50 ⁇ g of dopamine.
  • MIP No. 3 is prepared by mixing 505 mg of ochratoxin A, 4.95 g of ethylene glycol dimethylacrylate, 430 mg of methacrylic acid in 6.9 mL of anhydrous acetomt ⁇ le. The mixture is degassed by stirring. 10 minutes of nitrogen bubbling and then 56 mg of AIBN. The polymerization is carried out at 50 ° C. for 48 hours to form a white monolith.
  • the MIP No. 3 prepared above is crushed and sieved.
  • the particles, the size of which is between 25 and 45 ⁇ m, are introduced into a 15 ⁇ 4.6 mm HPLC column and then pressed down and washed with a 5% Acetic Acid mixture in
  • MIP No. 4 is prepared by mixing 125 mg of ochratoxin A, 1.23 g of ethylene glycol dimethyl acrylate, 128 mg of (1H) -1- (2-methacryloxyethyl) -3- [4- (4) - nitrophenyldiazenylphenylthiourea in 1.7 ml of anhydrous acetonitrile The mixture is degassed by bubbling nitrogen for 10 minutes and then 14 mg of AIBN are added The polymerization is carried out at 50 ° C. for 48 hours to form a monolith orange. MIP No. 4 prepared above is crushed and sieved. The particles, the size of which is between 25 and 45 ⁇ m, are introduced into a 15 ⁇ 4.6 mm HPLC column and then pressed down and washed with a 5% Acetic Acid mixture in
  • the 25-45 ⁇ m particles are introduced into SPE cartridges.
  • Two cartridges of SPE are made by introducing 50 and 100 mg of each of the imprint matrices (imprint No. 3 and No. 4) between two frits. An extraction of the OTA is then performed.
  • the fraction containing the OTA is percolated on the 100 mg SPE cartridge of the imprint n ° 4. There is then a brown coloration proportional to the amount of OTA present in the elution fraction.

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Abstract

La présente invention concerne un kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement identiques ou différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s),et au moins un marqueur, ledit marqueur étant soit un marqueur compétitif ou apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (ii) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), soit un marqueur intrinsèque ou un motif constitutif du deuxième polymère à empreintes moléculaires et apte (i') à interagir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s)et (ii') à émettre en conséquence un signal détectable.

Description

Krt d'analyse comprenant au moins deux polymères à empreintes moléculaires et au moins un marqueur, ainsi que le procédé d'analyse l'utilisant
La présente invention se rapporte au domaine des polymères a empreintes moléculaires (encore appelés « molecularly imprmted polymers » ou « MIPs » en langue anglaise) utiles pour la reconnaissance de molécules cibles.
Elle concerne plus particulièrement un kit d'analyse d'au moins une molécule cible, ou d'une famille de molécules cibles, comprenant au moins deux MIPs et au moins un marqueur, ainsi qu'un procédé d'analyse utilisant un tel kit.
La détection et la détermination de la concentration d'un analyte présent dans un milieu complexe et/ou présent à l'état de trace dans un échantillon, nécessitent généralement des procédés requérant encore de nos jours de fastidieuses étapes de purification et/ou d'enrichissement, ainsi que l'utilisation de détecteurs très élaborés, à l'image par exemple des spectromètres de masse.
Qui plus est, les procédés utilisés jusqu'à présent pour ces traitements manquent le plus souvent de spécificité. De plus, l'étape de détection fait classiquement intervenir des composés non stables chimiquement ou mécaniquement, qui ne peuvent pas être réutilisés, et présente de surcroît généralement des temps d'analyse très longs.
De ce fait, ces procédés induisent fréquemment une perte de temps et/ou une augmentation de l'incertitude sur le résultat. L'analyse de tels analytes peut toutefois être facilitée en effectuant, préalablement à la détection a proprement parler, un prétraitement convenable du milieu complexe ou de l'échantillon. Ainsi, lorsque l'analyte est présent dans un milieu complexe tel par exemple l'urine, qui comprend de nombreuses entités annexes susceptibles de perturber la mesure, ou encore lorsque l'analyte n'est présent qu'à l'état de trace dans un échantillon et que sa détection est alors difficile, il peut être nécessaire de procéder, dans une première étape, à une extraction dudit analyte
II est notamment déjà connu de faire appel à des techniques d'extraction de type séparation en phase solide (encore appelées « solid phase extraction » ou « SPE » en langue anglaise) pour concentrer, avant analyse, des analytes d'intérêt présents dans des échantillons liquides.
A cet effet, on connaît déjà en particulier l'utilisation de MIPs pour la mise en œuvre d'extractions de type SPE. Les MIPs sont en effet avantageux de par leur forte spécificité et leur excellente stabilité chimique, mécanique et thermique Ils sont en outre connus pour être facilement synthétisables et peu onéreux si l'entité patron est disponible à faible coût. Ainsi que rapporté dans Ohnmacht C M., Chiel J.E., Hage D S Anal Chem 2006, 78, 7547-7556, l'utilisation de MIPs dans un procédé d'extraction en phase solide permet ainsi d'obtenir avantageusement, et en une seule étape, un extrait enrichi en un analyte donné
Par ailleurs, il est également déjà connu de détecter, voire de déterminer la concentration d'un analyte par des méthodes d'analyse mettant en oeuvre des MIPs. Ainsi, les MIPs peuvent par exemple être utilisés dans des tests de type radio- îmmunoanalyse, dans lesquels lesdits MIPs se substituent aux anticorps et dans lesquels ils peuvent, au même titre que les anticorps, être pourvus de marqueurs susceptibles d'être mis en compétition avec des analytes d'intérêt.
De telles méthodes d'analyse sont notamment décrites dans la revue « Molecularly impπnted polymers m pseudoimmunoassay » de Richard J Ansell, Journal ofChromatography B, 804 (2004) 151-155.
L'utilisation de MIPs dans des méthodes d'analyse de ce type présente de nombreux avantages, comme par exemple celui de mettre en œuvre des composés plus stables que les anticorps, pouvant être utilisés à la fois dans des milieux aqueux et des milieux non aqueux, et ne nécessitant pas de couplage de l' analyte (dans le cas de petites molécules), m l'utilisation d'animaux de laboratoire pour leur production. C'est pourquoi les MIPs remplacent progressivement les anticorps dans de nombreux domaines d'analyse.
Il est enfin également déjà connu d'utiliser plusieurs MIPs, identiques ou différents, dans des procédés comprenant une première étape de pré-traitement suivie d'une seconde étape de détection d' analytes d'intérêt
Ainsi, Chianella et al décrivent déjà l'utilisation d'un même MIP pour procéder, d'une part, à la concentration en molécule cible de l'échantillon a analyser par SPE, et d'autre part, à l'analyse consécutive de ladite molécule cible La détection de la molécule cible est basée dans ce document sur l'utilisation d'un capteur piézoélectrique revêtu sur la surface du même MIP que celui utilisé pour l'étape de concentration SPE. La détection s'effectue alors par mesure de la fréquence, qui est proportionnelle à la masse en molécule cible (Chianella L, Piletsky S.A., Tothill I E., Chen B. Turner A.P.F., Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18, 119-127).
Le procédé décrit dans ce document est toutefois difficile à mettre en œuvre pour un usage courant dans la mesure où il requiert l'utilisation de capteurs piézoélectriques uniquement manipulables par du personnel fortement qualifié.
Le document US 6 461 873 enseigne quant à lui la mise en œuvre de deux MIPs distincts pour l'analyse de la caféine contenue dans une boisson. Le procédé décrit dans ce document comprend tout d'abord une première étape au cours de laquelle le premier MIP absorbe les mterférents présents dans la boisson à analyser. Cette première étape a pour objet d'améliorer la mise en œuvre de la seconde étape, dédiée pour sa part à la détection de la caféine à proprement parler via l'utilisation d'un deuxième MIP absorbant spécifiquement celle-ci.
Le procédé décrit dans ce document est toutefois limité de part le format et la nature physique du dispositif, aux tests de chromatographie sur bandes. Ce format ne permet pas par ailleurs un enrichissement conséquent de
Fanalyte, dans l'hypothèse où celui-ci serait, par exemple, présent à l'état de trace dans l'échantillon analysé.
Qui plus est, dans la mesure où le premier MIP utilisé est destiné à reconnaître spécifiquement les mterférents, l'étape de pré-traitement décrite dans ce document requiert que ces derniers aient été identifiés. Ainsi, le procédé selon cet enseignement ne permet donc pas l'analyse d'analytes mis en œuvre dans des milieux trop complexes.
P. S. Sharma et al décrivent enfin un procédé consistant en une première étape de pré-traitement d'une solution comprenant de la créatinine par une colonne SPE comprenant un MIP spécifique de cette molécule, suivie d'une étape de détection par voltamétrie de redissolution cathodique différentielle puisée mise en œuvre par une électrode à goutte de mercure pendante modifiée par un deuxième MIP identique à celui mis en œuvre au cours de la première étape (P. S. Sharma, D. Lakshmi, B.B Prasad, Chromatographia, 2007, 65, April (No.7/8)).
Ce procédé semble toutefois limité à la détection de molécules électrosensitives susceptibles de subir une oxydation ou une réduction. Par conséquent, il demeure un besoin d'un kit d'analyse d'utilisation simple et rapide permettant de détecter, voire de déterminer en outre la concentration, d'un analyte présent dans un milieu complexe ou présent à l'état de trace dans un échantillon.
En particulier, il demeure un besoin d'un kit d'analyse ne nécessitant pas d'appareillage encombrant et/ou coûteux à l'image par exemple des appareils de chromatographie (GC, LC, HPLC), des capteurs piézoélectriques ou encore des appareillages mettant en œuvre des électrodes (cas des techniques voltamé triques, notamment du type analyse par redissolution anodique ou cathodique).
Il est également souhaitable de disposer d'un kit d'analyse qui soit portatif, et qui puissent être facilement transporté et utilisable à domicile, dans une clinique, un cabinet médical, en dehors d'un hôpital, dans une usine ou encore sur le terrain.
Il existe également un besoin d'un kit d'analyse utile pour détecter des analytes dénués de groupements facilement détectables, à l'image par exemple de chromophores ou de fluorophores. II demeure aussi un besoin d'un kit d'analyse de sensibilité améliorée, permettant notamment la détection et la détermination de la concentration d' analytes présents en de très faibles concentrations dans un échantillon
Les inventeurs ont précisément découvert que l'utilisation d'un kit d'analyse comprenant au moins deux MIPs et au moins un marqueur spécifique permettait de répondre à ces besoins.
Ainsi, la présente invention concerne, selon un de ses aspects, un kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement identiques ou différents, aptes à mteragir avec la (ou les) molécule(s) cible(s), et au moins un marqueur, ledit marqueur étant soit un marqueur compétitif ou apte (î) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (n) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), soit un marqueur intrinsèque ou un motif constitutif du deuxième polymère à empreintes moléculaires et apte (i') à mteragir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) et (U') à émettre en conséquence un signal détectable.
La présente invention concerne également, selon un de ses aspects, un kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s), et au moins un marqueur, ledit marqueur étant soit un marqueur compétitif ou apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (ii) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), soit un marqueur intrinsèque ou un motif constitutif du deuxième polymère à empreintes moléculaires et apte (i') à interagir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) et (U') à émettre en conséquence un signal détectable.
Chacune des variantes détaillées dans la suite peut être également appliquée à ce mode de réalisation particulier.
La présente invention concerne également, selon un autre de ses aspects, un kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) et au moins un marqueur, ledit marqueur étant apte à émettre un signal détectable lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s).
En d'autres termes, la présente invention a pour objet de mettre à la disposition des utilisateurs un kit d'analyse offrant les moyens de réaliser des analyses ciblées, et qui soit modulable tant du point de vue de sa conception que du point de vue de son utilisation, comme cela apparaît clairement à la lecture de ce qui suit.
En particulier, la large gamme de MIPs synthétisables (en terme de polarité, d'hydrophobicité, de densités de sites, de propriétés magnétiques et physico-chimiques, par exemple), les différentes conditions d'utilisation envisageables (en terme de pH, de salinité, de température, de débit, de pression ou de polarité des solvants, par exemple), les multiples marqueurs utilisables, et les divers supports disponibles sont autant de paramètres qu'il est possible de sélectionner, voire d'ajuster en fonction des besoins de l'utilisateur, et notamment en fonction de la nature de la (ou des) molécule(s) cible(s), ainsi que selon l'application visée (sensibilité de la détection, sélectivité limitée par exemple à une molécule cible particulière ou au contraire élargie à une famille de molécules cibles).
Selon l'application visée, il est ainsi en particulier possible de moduler le kit via le choix du marqueur « compétitif », à savoir apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (n) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) .
Il est notamment possible d'adapter l'affinité de celui-ci pour les sites de reconnaissance du deuxième MIP en fonction de la sensibilité et/ou de la sélectivité recherchée(s). En effet, un marqueur compétitif présentant une forte affinité avec ces sites de reconnaissance ne pourra être déplacé que par une molécule cible particulière, tandis qu'un marqueur compétitif présentant une affinité plus faible pourra être déplacé plus facilement, par exemple par une famille de molécules cibles, voire par une faible concentration en une molécule cible particulière De même, il est également possible de moduler le kit via le choix du marqueur
« intrinsèque », à savoir du motif constitutif du deuxième polymère à empreintes moléculaires et apte (i') à interagir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) et (n') à émettre en conséquence un signal détectable. II est notamment possible de faire ces modulations en sélectionnant ce marqueur intrinsèque selon la nature de ses interactions avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) et/ou la nature du signal émis, en fonction de la sensibilité et/ou de la sélectivité recherchée(s).
Il est en particulier possible de sélectionner un marqueur intrinsèque ne présentant des interactions qu'avec tout ou partie d'une molécule cible spécifique, ou au contraire un marqueur intrinsèque présentant des interactions avec une famille de molécules cibles. Dans ce deuxième cas, il est également possible de sélectionner un marqueur intrinsèque émettant des signaux différents en fonction de la molécule cible de ladite famille avec laquelle il interagit
Ces différents choix, et notamment l'adaptation de l'affinité relative du deuxième MIP pour la (ou les) molécule(s) cible(s) et pour le marqueur compétitif, permettent de disposer d'un kit modulable, tant dans sa spécificité que dans sa sensibilité
Une telle adaptation peut en particulier être avantageuse pour aboutir, par exemple lors d'une étape de pré-traitement, à une sélectivité optimale, à savoir telle que les entités interférentes présentes initialement dans la solution à analyser soient, le cas échéant, éliminées, tout en conservant dans la solution pré-traitée la (ou les) molécule(s) cible(s), et procéder ainsi à une purification et éventuellement à un enrichissement en molécule(s) cible(s)
L'invention a également pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins une étape d'utilisation d'un kit selon l'invention. Elle concerne aussi, selon un autre de ses aspects, l'utilisation d'un kit selon l'invention pour l'analyse de médicaments, de polluants, de produits chimiques, de contaminants, et analogues
Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par : - « molécule cible » ou « analyte », toute entité que l'on souhaite détecter
(c'est-à-dire dont on souhaite mettre en évidence la présence) et/ou dont on souhaite déterminer la concentration dans un échantillon donné,
« marqueur », toute entité chimique, et par exemple tout molécule proche en structure et/ou en affinité de la (ou des) molecule(s) cible(s) ou tout ou partie d'au moins un motif constitutif d'un MIP, et détectable par colorimétrie visible comme par exemple détectable par l'œil nu, par radiochimie, par médecine nucléaire comme par exemple par scmtigraphie, par imagerie, par résonance (IRM), par rayons X, par diffusion de lumière, par spectrométrie de masse, par spectroscopie, comme par exemple par fluorescence ou par UV-visible, par spectroscopie infrarouge, par spectroscopie de résonance des plasmons de surface, par chimiluminescence, par spectroscopie d'interférence et de réfraction, par diffusion Raman, par ultrasons, par radioactivité, par réfractométrie, par détections optique, piézoélectrique, acoustique, par électrochimie, par conductivité, par pH métrie ou encore par voie biologique
« signal », un paramètre physique ou chimique pouvant être détecté par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par une technique mentionnée ci-dessus.
Selon une variante préférée de l'invention, le signal émis par le marqueur est détecté par colorimétπe visible, par fluorescence ou par UV, et de préférence à l'œil nu.
A titre d'exemple de signal selon l'invention on peut notamment citer une longueur d'onde d'absorption ou d'émission détectable par colorimétπe visible ou par spectroscopie ou par fluorescence, un changement de couleur détectable par l'œil nu, un indice de réfraction détectable par spectroscopie de résonance des plasmons de surface, une luminosité détectable par diffusion de lumière, une masse détectable par un capteur piézoélectrique, une émission Bêta détectable par un compteur à scintillation, un potentiel d'oxydation détectable par électrochimie. - « site de reconnaissance », la cavité de la matrice du MIP qui intervient effectivement dans la reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s),
« milieu complexe », un milieu comprenant, outre la (ou les) molécule(s) cible(s), une ou plusieurs autres entités annexes dont certaines au moins sont susceptibles d'interférer avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) lors d'au moins une des étapes de l'analyse (étape de pré-traitement et/ou étape de détection), et de perturber l'interprétation des résultats.
A titre d'exemples de milieux complexes selon l'invention, on peut notamment citer les fluides corporels tels que le sang, le plasma, la salive, l'urine, la bile, les larmes, le lait maternel, ou encore des milieux de culture, des lysats cellulaires, des extraits de plantes, des aliments, des milieux environnementaux (sol, eau, air), des boissons tel que le vin, le lait, les jus de fruits, la bière, ou encore des milieux gazeux.
« état de trace », toute concentration comprise entre 1 ng/L et 10 mg/L, notamment entre 5 ng/L et 1 μg/L, de préférence entre 10 ng/L et 500 ng/L
« interaction » intervenant entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et un site de reconnaissance, entre un marqueur compétitif et un site de reconnaissance ou entre un marqueur intrinsèque et la (ou les) molécule(s) cible(s), la formation de liaisons faibles (par exemple de type liaisons de Van der Waals, liaisons hydrogène, liaisons pi donneur-pi accepteur, ou interactions hydrophobiques) et/ou de liaisons fortes (par exemple de type liaisons ioniques, liaisons covalentes ou encore liaisons iono-covalentes, liaisons de coordination, et liaisons datives).
Dans le cadre de la présente invention, les interactions entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et un site de reconnaissance, entre un marqueur compétitif et un site de reconnaissance ou entre un marqueur intrinsèque et la (ou les) molécule(s) cible(s) peuvent être identiques ou différentes au sein d'un même MIP. la figure 1 représente, sous forme d'un schéma bloc, les différentes étapes du procédé d'analyse selon l'invention. - la figure 2 illustre la mise en œuvre de l'étape de détection du procédé selon l'invention, selon le mode de réalisation particulier dans lequel le deuxième polymère à empreintes moléculaire est conditionné dans une cartouche SPE et la molécule cible est la dopamine et le marqueur est détectable à l'œil nu, conformément aux exemples. - la figure 3 est un graphe indiquant les quantités de
6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine obtenues dans les différentes fractions de 1 ml de MeOH percolées sur les cartouches SPE « témoin » et « révélateur » décrites dans l'exemple 6, Essai B. la figure 4 représente de manière schématique, en perspective, un kit d'analyse selon l'invention, la figure 5 représente une partie d'une variante d'un kit d'analyse selon la figure 4. la figure 6 illustre un mode de réalisation où les MIPs sont intégrés dans un système bloc.
II est entendu que les MIPs du kit selon l'invention peuvent être destinés à reconnaître plusieurs molécules cibles suivant l'utilisation visée. Ainsi, sauf indications contraires, l'invention n'est pas limitée aux seuls modes de réalisation où les propriétés de reconnaissance visent une seule molécule cible. En particulier, selon un mode de réalisation, le kit conforme à l'invention peut être destiné à l'analyse d'une famille de molécules cibles, c'est-à-dire à l'analyse d'un ensemble de molécules différentes susceptibles d'être détectées par un même site de reconnaissance d'un MIP et possédant par exemple une analogie de structure et/ou un arrangement donné et commun de groupements fonctionnels.
Bien entendu, selon l'application visée, et notamment selon la sélectivité requise, la famille de molécules cibles susceptibles d'être analysées peut comprendre un ensemble plus ou moins large de molécules différentes. KIT D'ANALYSE
Le kit d'analyse selon l'invention comprend au moins deux MIPs, chimiquement identiques ou différents, présentant au moins des sites de reconnaissance aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) (appelés également « sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) »).
Au sens de l'invention, le terme "kit" entend désigner un ensemble de conditionnement, dans lequel lesdits au moins deux MIPs sont conditionnés de façon séparée l'un de l'autre, par exemple dans deux compartiments ou sur deux supports distincts tels que définis ci-après, par exemple sur des cartouches SPE. Lesdits supports, et par exemple lesdites cartouches, peuvent ensuite être agencés au sein d'un même système bloc, comme illustré par exemple à la figure 6.
Au moins un polymère à empreintes moléculaires (appelé « premier MIP » dans la suite) peut être destiné à une étape de pré-traitement de l'échantillon, comme par exemple à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), par reconnaissance moléculaire de la (ou des) molécule(s) cible(s).
Par « extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s) par reconnaissance moléculaire de la (ou des) molécule(s) cible(s) » s'entend au sens de l'invention une étape au cours de laquelle l'interaction de la (ou des) molécule(s) cible(s) avec les sites de reconnaissance d'un MIP est suffisante pour conduire à la formation d'un complexe composé du MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance, de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s).
En conséquence, les sites de reconnaissances du premier MIP, et notamment ses sites de reconnaissances de la (ou des) molécule(s) cible(s), peuvent être initialement en partie, voire même de préférence en totalité, vacants. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, l'ensemble des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du premier MIP du kit selon l'invention est vacant. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'ensemble des sites de reconnaissance du premier MIP du kit selon l'invention est vacant.
Le premier MIP peut ainsi permettre, selon un mode de réalisation de l'invention et après libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s), l'obtention d'une solution purifiée, voire enrichie en la (ou les) molécule(s) cible(s).
Par « libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) » s'entend au sens de l'invention une étape au cours de laquelle le complexe formé lors de l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s) par reconnaissance moléculaire de la (ou des) molécule(s) cible(s) se dissocie, par exemple suite à une modification des conditions de pH, de salinité, de température, de débit, de pression, ou de polarité des solvants, conduisant à la présence de la (ou des) molécule(s) cible(s) sous une forme libre en solution.
Au moins un autre polymère à empreintes moléculaires (appelé « deuxième MIP » dans la suite) de nature chimique identique ou différente du premier polymère à empreintes moléculaires, peut, soit lorsqu'il est doté dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur compétitif, soit lorsqu'il est constitué d'au moins un marqueur intrinsèque, tels que définis ci-après, être destiné à la détection, voire à la détermination de la concentration, de la (ou des) molécules(s) cible(s), comme cela est décrit plus en détail ci-après.
Le marqueur, le signal ou une variation de signal émis(e) par le marqueur peut notamment être détecté, par exemple après relargage ou en conséquence d'une interaction avec la molécule cible, par colorimétrie visible comme par exemple à l'œil nu, par radiochimie, par médecine nucléaire comme par exemple par scintigraphie, par imagerie, par résonance (IRM), par rayons X, par diffusion de lumière, par spectrométrie de masse, par spectroscopie, comme par exemple par fluorescence ou par UV-visible, par spectroscopie infrarouge, par spectroscopie de résonance des plasmons de surface, par chimiluminescence, par spectroscopie d'interférence et de réfraction, par diffusion Raman, par ultrasons, par radioactivité, par réfractométrie, par détections optique, piézoélectrique, acoustique, par électrochimie, par conductivité, par pHmétrie, ou encore par voie biologique, et de préférence par l'œil nu. Selon une variante préférée de l'invention, le marqueur, le signal ou la variation de signal émis(e) par le marqueur est détecté par coloπmétrie visible, par fluorescence ou par UV, et de préférence a l'œil nu.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le deuxième polymère à empreintes moléculaires peut être de nature chimique différente du premier polymère à empreintes moléculaires.
Il peut être en effet avantageux de sélectionner les premier et deuxième MIPs de sorte à ce qu'ils présentent des affinités différentes pour la (ou les) molécule(s) cible(s), et en particulier des affinités optimisées en fonction de leur condition d'utilisation respective. Une telle optimisation de la reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) pour chaque étape de l'analyse peut ainsi permettre de cibler par exemple le plus efficacement possible la molécule cible lors des étapes de pré-traitement et de détection.
Comme expliqué plus en détail dans la suite, la sélection de deux MIPs de nature chimique différente est également utile en ce qu'elle permet d'utiliser la solution purifiée obtenue à l'issue de la première étape pour la mise en œuvre de l'étape de détection.
Marqueur compétitif
Selon un premier mode de réalisation, le marqueur peut être apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (n) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s).
Un tel marqueur est dénommé « premier type de marqueur » ou « marqueur compétitif » dans la suite.
Lorsque le premier et le deuxième MIPs sont chimiquement identiques, il s'entend, dans le cadre de la présente invention, qu'ils doivent être conditionnés séparément.
Toutefois, selon un premier mode de réalisation de l'invention, au moins le marqueur compétitif et le deuxième polymère a empreintes moléculaires peuvent être conditionnés séparément, par exemple dans deux compartiments distincts. Dans ce cas, l'utilisateur met en contact le marqueur avec le deuxième MIP, de sorte que ledit marqueur interagisse avec les sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) dudit deuxième MIP, préalablement à la mise en contact avec le deuxième MIP, de la solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s). Alternativement, au moins le marqueur compétitif et le deuxième polymère à empreintes moléculaires peuvent être conditionnés ensemble de telle sorte que le deuxième polymère à empreintes moléculaires soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur.
Dans ces deux cas, ledit marqueur doit être apte à mteragir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la ou des) molécule(s) cible(s)du deuxième MIP, et être également apte à être déplacé par la (ou les) molécule(s) cible(s) de tout ou partie de ces sites lorsque le deuxième MIP est mis en présence de la (ou des) molécule(s) cible(s)
Bien entendu, le marqueur compétitif ne pourra être déplacé de ces sites par la
(ou les) molécule(s) cible(s) que si les conditions de mises en présence du deuxième MIP doté dudit marqueur avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) sont propices à l'interaction de (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) avec les sites de reconnaissance dudit deuxième MIP.
Le deuxième MIP peut également présenter en plus des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), d'autres sites de reconnaissance différents, susceptibles d'mteragir également chacun avec au moins un marqueur compétitif selon l'invention. Ces autres sites de reconnaissance peuvent ainsi permettre de détecter, voire de déterminer la concentration, d'autres types de molécules cibles dans les mêmes conditions d'utilisation ou dans des conditions d'utilisation différentes.
Le marqueur compétitif doit donc présenter une plus faible affinité pour ces sites de reconnaissance que la (ou les) molécule(s) cible(s), dans les conditions d'utilisation du deuxième MIP.
Ainsi, lorsque le deuxième MIP selon l' invention est doté dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur compétitif, et est mis alors en présence d'une solution comprenant la (ou les) molécule(s) cible(s), ledit marqueur doit être déplacé des sites de reconnaissance dudit deuxième MIP par la (ou les) molécule(s) cible(s) et être ainsi substitué par la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) : on parle d'un déplacement compétitif du marqueur par la (ou les) molécule(s) cible(s).
Ce déplacement compétitif a pour conséquence le relargage (c'est-à-dire la libération dans le milieu d'analyse, sous forme libre) dudit marqueur, qui peut être détecté par toute méthode convenant à la détection du marqueur.
La présente invention comprend le cas où la détection est différente suivant que le marqueur compétitif est sous forme libre, par exemple après relargage, ou encore présent dans les sites de reconnaissance du MIP.
Selon un mode de réalisation, chaque site de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires peut interagir avec un seul marqueur compétitif, notamment une seule molécule de marqueur compétitif.
Selon un autre mode de réalisation, chaque site de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires peut interagir avec plusieurs marqueurs compétitifs), notamment plusieurs molécules de marqueur compétitif.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les premier et deuxième polymères à empreintes moléculaires peuvent être identiques en terme de nature chimique. En particulier, lorsque le deuxième polymère à empreintes moléculaires et le premier type de marqueur ou marqueur compétitif sont conditionnés ensemble de telle sorte que le deuxième polymère à empreintes moléculaires soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur, les premiers et deuxième polymères à empreintes moléculaires peuvent se différencier uniquement par la présence dudit marqueur dans tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les premier et deuxième polymères à empreintes moléculaires peuvent être de nature chimique différente, indépendamment de la présence ou non d'au moins un marqueur compétitif dans tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires. Marqueur intrinsèque
Selon un deuxième mode de réalisation, le marqueur peut être un motif constitutif du deuxième polymère a empreintes moléculaires et être apte (1') à interagir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) et (n') à émettre en conséquence un signal détectable.
Un tel marqueur est dénommé « deuxième type de marqueur » ou « marqueur intrinsèque » dans la suite
Par « constitutif du deuxième polymère a empreintes moléculaires » s'entend, au sens de l'invention, comme faisant partie de la constitution chimique dudit polymère à empreintes moléculaires. En d'autres termes, un deuxième polymère à empreintes moléculaires selon ce deuxième mode de réalisation est formé en partie, mais pas nécessairement exclusivement, d'un tel motif.
Selon un mode de réalisation, le marqueur intrinsèque peut être en partie constitutif des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires.
Selon un autre mode de réalisation, le marqueur intrinsèque peut ne pas être constitutif desdits sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires mais être situé à proximité de ceux-ci. Des modes de préparation de tels polymères à empreintes moléculaires sont indiqués dans la suite, a titre dlustratif.
Au sens de l'invention, lorsqu'il est question d'interaction entre un marqueur intrinsèque avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) dans les conditions indiquées précédemment, il doit être entendu non seulement l'interaction directe entre ledit marqueur et tout ou partie de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) provoquant l'émission par ledit marqueur d'un signal détectable, mais aussi toute interaction indirecte sur ledit marqueur pouvant être induite par une interaction entre une autre entité chimique et tout ou partie de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s).
A titre d'exemple de telles interactions indirectes, on peut notamment citer toute interaction entre d'une part un groupement, par exemple fonctionnel, lié de façon covalente audit marqueur et d'autre part tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s), sous réserve que cette interaction ait pour effet l'émission en conséquence par ledit marqueur d'un signal détectable.
Ledit groupement peut être directement lié au marqueur par une liaison covalente ou être séparé dudit marqueur par un espaceur (« linker » en langue anglaise), comme cela est décrit dans la suite.
Les interactions indirectes intervenant alors entre le marqueur et la molécule cible peuvent être dues à une modification de l'environnement, par exemple électronique, du marqueur, induite en particulier par ledit groupement.
Toujours selon ce deuxième mode de réalisation, les interactions entre le marqueur intrinsèque et tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) interviennent lorsque ces dernières interagissent avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires.
Cette chaîne d'interactions doit par ailleurs provoquer selon l'invention l'émission d'un signal par le marqueur, qui soit détectable. Selon un mode de réalisation, une variation du signal émis par le marqueur peut également être détectée, en particulier une variation entre d'une part le signal émis par le marqueur avant interaction avec tout ou partie de la (ou les) molécule(s) cible(s) et d'autre part le signal émis par le marqueur au cours de ladite interaction.
Selon l'invention, le deuxième polymère a empreintes moléculaires constitué d'au moins un marqueur intrinsèque peut être issu de la copolymérisation d'au moins un monomère constitué en tout ou partie d'au moins ledit marqueur.
De tels monomères peuvent être notamment obtenus en modifiant chimiquement un marqueur de sorte à lui incorporer un motif polymérisable, le cas échéant séparé dudit marqueur par un espaceur.
Les techniques pour synthétiser des monomères de ce type sont déjà connues de l'art antérieur, et font partie des connaissances générales de l'homme du métier.
A titre d'exemple, il est notamment déjà connu de A. Grâfe et al. la synthèse de 4-trifluoroacétyl-4'-[N-(méthacryloxyéthyl)-N-(éthyl)amino]-azobenzène à partir de 4- N,N-dioctylamino-4'trifluoroacétyl-azobenzène (A. Grâfe, K. Haupt, G. J. Mohr, Analytica Chimica Acta, 565, 2006, 42-47). Un monomère ainsi modifié peut participer ensuite à la synthèse du deuxième MIP, et la partie non polymérisée de ce monomère peut devenir ainsi un motif constitutif de celui-ci, comme indiqué ci-apres.
Selon un mode réalisation préféré, chaque site de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires peut être constitué de, ou présenter à sa proximité, un seul marqueur intrinsèque, notamment une seule molécule de marqueur intrinsèque
Selon un autre mode réalisation, chaque site de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymères à empreintes moléculaires peut être constitué de, ou présenter à sa proximité, plusieurs marqueurs intrinsèques, notamment plusieurs molécules de marqueur intrinsèque
Mise en œuyre du kit
Les premier et deuxième MIPs peuvent être mis en œuvre sur tout support approprié.
Par « support », s'entend très largement, au sens de l'invention, tout substrat solide, flexible ou rigide, sur ou dans lequel les MIPs sont susceptibles d'être liés, collés, déposés, synthétisés in-situ, remplis et/ ou conditionnés.
Les supports utilisables selon l'invention peuvent être de toute nature, comme par exemple de nature biologique, non biologique, organique, inorganique, ou encore une de leur combinaison. Ils peuvent se présenter sous toute forme, et notamment prendre la forme de particules, de gels, de feuilles, de tubes, de sphères, de capillaires, de points, de films, de puits, de toute taille et de toute forme.
Selon un mode de réalisation, les supports peuvent plus particulièrement se présenter sous forme de films.
Les MIPs peuvent par exemple se présenter sous la forme de particules de taille homogène, notamment comprise entre 10 nm et 10 mm, par exemple entre 100 nm et 1 mm, notamment entre 1 μm et 100 μm, de préférence entre 25 et 45 μm susceptibles d'être par suite conditionnées sous forme de cartouche. De manière générale, les premier et deuxième MIPs peuvent par exemple être mis en œuvre sur ou dans un support choisi parmi une cartouche SPE, une plaque multipuits, comme par exemple une plaque à 96 puits, un patch, un sachet de thé (« tea bag » en langue anglaise), un microtube, une colonne HPLC, une bandelette, par exemple de bandelettes ayant un format analogue à celui de bandelettes de papier pH, des puces, des lames, des plaques de silice, des couches minces, une surface poreuse, une surface non poreuse, un système micro fluidique. Selon un mode de réalisation, le procédé d'analyse selon l'invention peut éventuellement comprendre en outre une étape de conditionnement du premier polymère à empreintes moléculaires préalablement aux étapes de pré-traitement (i) et (ii) décrites ci- après et/ou une étape de conditionnement du deuxième polymère à empreintes moléculaires préalablement aux étapes de détection (iii) et (iv) décrites ci-après. Selon un mode de réalisation de l'invention, le premier polymère à empreintes moléculaires peut être mis en œuvre sur une colonne d'extraction, par exemple une cartouche SPE.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le deuxième polymère à empreintes moléculaires peut être mis en œuvre sur une cartouche SPE, éventuellement graduée. La figure 2 illustre cet aspect de l'invention lorsque le marqueur est détectable à l'oeil nu.
Le kit selon l'invention peut par exemple se présenter sous la forme d'un ensemble de conditionnement, comprenant au moins une cartouche SPE contenant le premier MIP qui permettra le chargement, le lavage puis Pélution pour récupérer la (ou les) molécule(s) cible(s) sous forme libre et au moins une cartouche SPE contenant le deuxième MIP avec soit au moins un type de sites de reconnaissance contenant au moins un marqueur compétitif tel que décrit précédemment apte à être déplacé par la (ou les) molécule(s) cible(s), soit au moins un marqueur intrinsèque tel que décrit précédemment apte à émettre, en conséquence de son interaction avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s), un signal détectable.
Grâce à la grande variété de choix sur la nature des deux MIPs, sur la nature du marqueur, ou encore sur les conditions d'utilisation, il est possible de moduler le kit d'analyse selon l'invention dans une très large mesure, et de l'adapter aux applications visées. Avantageusement, et comme indiqué précédemment, les MIPs peuvent notamment être optimisées de sorte à obtenir les meilleures propriétés de reconnaissance et de détection pour chacune des étapes de l'analyse (pré-traitement et détection), selon l'affinité de la (ou des) molécules cibles et, le cas échéant, du marqueur compétitif, à leur encontre ou encore selon l'interaction entre le marqueur intrinsèque et la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s).
Au sens de l'invention, le terme « affinité » désigne l'aptitude d'une entité (par exemple une molécule cible ou encore un marqueur tel que défini précédemment) à interagir avec un site de reconnaissance d'un MIP. Une forte affinité traduit ainsi, au sens de l'invention, une forte aptitude pour cette entité à interagir, avec au moins un site de reconnaissance d'un MIP. Comme indiqué précédemment par interaction s'entend, au sens de l'invention, la formation de liaisons faibles (par exemple de type liaisons de Van der Waals, liaisons hydrogène, liaisons pi donneur- pi accepteur, ou interactions hydrophobiques) et/ou de liaisons fortes (par exemple de type liaisons ioniques, liaisons covalentes, ou encore liaisons iono-covalentes, liaisons de coordination et liaisons datives).
Il est entendu que l'interaction qui se manifeste lors de la préparation du MIP peut être différente de celle qui se manifeste lors de son utilisation.
Par exemple, il peut s'agir d'une interaction covalente labile lors de sa fabrication et d'une interaction de type ionique et hydrogène lors de son utilisation. L'affinité d'une entité pour un site de reconnaissance d'un MIP peut être évaluée en mesurant expérimentalement le facteur de capacité de ce site vis-à-vis de cette entité, par exemple en effectuant une analyse chromatographique de l'entité dont on souhaite déterminer l'affinité à travers une phase stationnaire comprenant au moins les sites de reconnaissance du MIP envers lesquels on souhaite déterminer l'affinité de ladite entité.
Le facteur de capacité « k' » de ces sites de reconnaissance correspond selon ce protocole au rapport du temps passé par cette entité dans la phase stationnaire, par rapport au temps passé par cette même entité dans la phase mobile. Il peut être déterminé expérimentalement par le rapport :
Figure imgf000020_0001
dans lequel tr désigne le temps de rétention, et tm le temps mort. Le facteur de capacité rend toutefois compte non seulement des interactions spécifiques de reconnaissance moléculaire entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et les sites de reconnaissance du MIP, mais aussi des interactions non spécifiques entre la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s) et le matériau dont est constitué ledit MIP Aussi, on utilise fréquemment le facteur d'empreinte (encore appelé
« împrrntmg factor » ou « IF » en langue anglaise) qui correspond au rapport du facteur de capacité du MIP (î) sur le facteur de capacité du matériau dont est constitué ledit MIP (î) autrement nommé « polymère non imprimé »
Ip _ kW fl)
K polymère non imprime (l) Le facteur d'empreinte rend ainsi compte de l'efficacité d'un MIP en terme de reconnaissance moléculaire, indépendamment de la nature chimique de sa matrice polymérique.
Bien évidemment, l'affinité dépend à la fois de l'entité et du MIP, mais elle varie également en fonction des conditions d'utilisation. Elle peut ainsi varier en particulier avec le milieu solvatant, et dépendre notamment des conditions de pH, de la salinité du milieu, de température, de débit, de pression, ainsi que de la polarité du solvant.
Il est néanmoins possible de comparer par exemple les affinités de deux entités différentes pour un même MIP dans des conditions d'utilisation identiques, ou encore les différentes affinités d'une même entité pour un même MIP dans des conditions d'utilisation variées.
L'affinité peut également être adaptée, selon l'utilisation envisagée, lors de la préparation des premier et deuxième MIPs, en faisant varier en particulier les conditions de synthèse (nature du solvant, température, concentration des réactifs, nature de l'amorceur ...), les entités patrons, les monomères initiaux ou encore de l'agent de réticulation ayant servis à faire le MIP.
L'étape de polymérisation du MIP autour d'une entité patron fait appel à des techniques en soi connues de l'homme de l'art. On peut ainsi se rapporter à l'article Peter A.G. Cormack et al , Journal of Chromatography B, 804 (2004) 173-182, qui présente une revue des techniques disponibles autour des aspects de la polymérisation de MIPs. Le contenu de cet article est incorporé ici par référence.
De façon générale, on obtient ces MIPs en copolymérisant des monomères et agent(s) de réticulation en présence d'une entité dont on cherche précisément à former l'empreinte. Les monomères s'arrangent spécifiquement autour de cette entité, encore dénommée « entité patron », par des interactions fortes ou faibles, puis sont polymérisés généralement en présence d'un taux élevé en agent de réticulation. Après polymérisation, l'entité est extraite du matériau polymère et laisse ainsi son empreinte moléculaire dans des cavités au sein du matériau qui constituent de réels récepteurs synthétiques comparables aux récepteurs biologiques de type anticorps.
L'entité patron peut être identique ou différente de la molécule cible. Ainsi, le document WO 07/004197 décrit notamment l'utilisation d'une entité patron de nature polymérique, différente de la (ou des) molécule(s) cible(s), pour la synthèse de MIPs.
Plus précisément, il existe deux approches possibles pour faire des MIPs, l'approche covalente développée par Wulff dans le document US 4 127 730 et l'approche non covalente développée par Mosbach dans le document US 5 110 833.
Dans l'approche covalente, les interactions entre les monomères et l'entité patron sont de type liaisons covalentes labiles. Dans ce cas, après l'extraction de l'entité patron par rupture de la liaison covalente, la reconnaissance de molécules cibles s'effectue également par la formation d'une liaison covalente entre l'empreinte et la molécule cible considérée.
Dans l'approche non covalente de Mosbach, les interactions entre les monomères et l'entité patron sont des liaisons faibles de type liaisons hydrogène, pi donneur - pi accepteur, liaisons de Van Der Waals ou interactions hydrophobiques. Après l'extraction de l'entité patron, la reconnaissance de molécules cibles s'effectue également par des interactions non covalentes entre l'empreinte et la molécule cible.
Ces deux approches peuvent être combinées.
Il est ainsi possible d'utiliser la première approche de type covalente pour la préparation du MIP et la deuxième approche pour obtenir une reconnaissance par des interactions non covalentes, comme cela est par exemple divulgué dans MJ. Whitcombe et al. "A New Method for the Introduction of Récognition Site Functionality into Polymers préparée by molecular Imprinting : Synthesis and Characterization of Polymeric Receptors for Cholestérol " J. Am. Chem. Soc, 1995, 117, 7105-7111.
Il est également possible d'utiliser les première et deuxième approches pour la préparation du MIP, ainsi que pour obtenir la reconnaissance par des interactions covalentes et non covalentes simultanément pour une même molécule cible. Ainsi, l'interaction se déroule au moins en deux sites distincts du site de reconnaissance comme cela est par exemple divulgué dans Wulff G. et al. Macromol. Chem. Phys. 1989, 190, 1717 et 1727.
Le MIP ou plus précisément la matrice la constituant peut ainsi être formée par copolymérisation radicalaire. Les monomères vinyliques, les monomères dérivés du styrène, de l'acide méthacrylique, sont des monomères particulièrement adaptés pour cette technique. Tout initiateur peut être utilisé, tel que l'azobisiso-butyronitrile (AIBN).
Lorsque le deuxième MIP comprend au moins un marqueur intrinsèque tel que décrit précédemment, il peut être notamment issu de la copolymérisation d'au moins un monomère particulier constitué d'au moins un motif polymérisable, d'un tel marqueur et, le cas échéant, d'un espaceur.
Les techniques de modification d'un marqueur pour lui greffer par exemple un motif polymérisable, le cas échéant via un espaceur, sont bien connues de l'homme du métier. A titre de monomères de ce type, on peut notamment citer la (E)- 1 -(2- méthacryloxyéthyl)-3-[4-(4-nitrophényldiazenylphenyl]thiourée.
Selon un mode de réalisation, notamment lorsque la molécule cible est l'ochratoxine, le premier et/ou le deuxième polymère à empreintes moléculaires, et en particulier le deuxième polymère à empreintes moléculaires, peu(ven)t mettre en œuvre au cours de leur étape de polymérisation au moins la (£)-l-(2-méthacryloxyéthyl)-3-[4-(4- nitrophényldiazenylphenyljthiourée.
Le MIP peut aussi être formé par copolymérisation radicalaire, dans le but de faire varier les propriétés du polymère. On peut par exemple citer le copolymère de méthacrylate de méthyle/méthacrylate de butyle. Le MIP peut être formé de polymères ou copolymères réticulés. Selon le degré de réticulation, on parle de polymère ou de copolymère branché, de réseaux macroscopiques ou de microgels. A titre d'autres monomères utiles pour la synthèse des MIPs, on peut citer : des monomères acides : acide méthacrylique (MAA), acide p- vinylbenzoïque, acide acrylique (AA), acide itaconique, acide 2-(trifluorométhyl)- acrylique (TFMAA), acide sulfonique d'acrylamido-(2-méthyl)-propane (AMPSA), acrylate de 2-carboxyéthyle, des monomères basiques : 4-vinylpyridine (4-VP), 2-vinylpyridine (2-
VP), 4-(5)-vinylimidazole, 1-vinylimidazole, allylamine, N,N'-diéthyl aminoéthyle méthacrylamide (DEAEM), N-(2-aminéthyl)-méthacrylamide, N,N'-diéthyl-4- styrylamidine, aminoéthylméthacrylate de N,N,N-triméthyle, N-vinylpyrrolidone (NVP), ester d'éthyl urocanique, des monomères neutres : acrylamide, méthacrylamide, méthacrylate de 2- hydroxyéthyle (2-HEMA), acide £rα«s-3-(3-pyridyl)-acrylique, acrylonitrile (AN), méthacrylate de méthyle (MMA), styrène, éthylstyrène.
Il relève des compétences générales de l'homme du métier de préparer les premier et deuxième MIPs présentant les propriétés requises selon l'application visée.
Il est ainsi également possible d'utiliser pour la synthèse des premier et/ou deuxième MIPs des monomères spécifiques selon la (ou les) molécule(s) cible(s) visée(s), et en particulier au moins en partie des monomères dérivés d'une molécule cible, jouant ainsi en partie le rôle du polymère de la matrice et en partie le rôle de l'entité patron. Autrement dit, une partie de ces monomères, une fois polymérisée, a vocation à être éliminée de sorte à donner naissance aux sites de reconnaissance.
A titre d'exemple de tels monomères, on peut notamment citer le 5-[2-(N-terf-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl)benzo[l,3,2]dioxoborole, qui est dérivé de la N-tert-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine, elle-même dérivée de la dopamine.
Selon un mode de réalisation de l'invention, et notamment lorsque la molécule cible est la dopamine, les premier et/ou deuxième polymères à empreintes moléculaires peu(ven)t mettre en œuvre au cours de leur étape de polymérisation au moins le 5-[2-(N-terf-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl)benzo[l,3,2]dioxoborole. Selon ce mode de réalisation de l'invention, il(s) peu(ven)t en particulier être issu(s) de la copolymérisation d'au moins le 5-[2-(N-ter£-butoxycarbonyl)éthylamino]-2- [4-vinylphényl]benzo[l,3,2]dioxoborole et d'au moins Pacrylate de 2-carboxyéthyle, avec par exemple au moins du divinylbenzène ou du diméthacrylate de l'éthylène glycol.
PROCEDE D'ANALYSE On peut se référer à la figure 1, illustrant l'agencement des différentes étapes du procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également, selon un autre de ses aspects, un procédé d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins une étape d'utilisation d'un kit selon l'invention. La (ou les) molécule(s) cible(s) peu(ven)t être par exemple présente(s) dans une solution, et en particulier être présente(s) dans un milieu complexe, ou encore être présente(s) à l'état de trace dans un échantillon.
Il peut notamment s'agir d'un procédé d'analyse d'au moins une molécule susceptible d'être présente dans une solution comprenant au moins : (i) une étape de mise en contact de ladite solution avec un premier polymère à empreintes moléculaires apte à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) dans des conditions adaptées à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s),
(ii) la formation d'une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), à partir de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i), (iii) une étape de mise en contact de ladite solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), avec un deuxième polymère à empreintes moléculaires, également apte à interagir avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), et soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur compétitif ou apte à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) dans les conditions de réalisation de ladite étape (iii), soit constitué d'au moins un marqueur intrinsèque ou apte à interagir avec tout ou partie de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) et à émettre en conséquence un signal détectable et (iv) une étape de détection qualitative, quantitative et/ou semi-quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), via la détection soit du marqueur compétitif ainsi déplacé, soit du signal ainsi émis par le marqueur intrinsèque. Comme indiqué précédemment, le marqueur compétitif et le deuxième MIP peuvent être conditionnés séparément dans deux compartiments distincts, ou être conditionnes ensemble de telle sorte que le deuxième MIP soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur. Ainsi, selon une variante de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, préalablement à l'étape (m), une étape de mise en contact du deuxième MIP avec au moins un marqueur compétitif selon l'invention. Les conditions seront alors avantageusement adaptées à l'interaction du (ou des)dit(s) marqueur(s) avec les sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP.
Etape de pré-traitement
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape (î) peut être une étape du pré-traitement de la solution comprenant la (ou les) molécule(s) cible(s), et être par exemple utile à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), de sorte à obtenir par suite une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s).
Elle est suivie d'une étape (îi) de libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP, de sorte à conduire à la formation d'une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), à partir de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (î). L'étape (îi) peut par exemple être réalisée par mise en présence de la (ou des) molécule(s) cible(s) ιsolée(s) en étape (î) avec un milieu propice à la rupture de leur interaction avec le premier polymère à empreintes moléculaires.
Ainsi, lorsque la solution à analyser est par exemple un milieu complexe, cette étape (î) du pré-traitement permet d'éliminer les entités annexes, différentes de la (ou des) molécule(s) cible(s) et qui sont susceptibles d'interférer avec la mise en œuvre de l'étape
(lii).
En variante, lorsque la solution a analyser est un échantillon comprenant la (ou les) molécule(s) cible(s) à l'état de trace, l'étape (i) du pré-traitement permet d'obtenir, après libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP, une solution pré-traitée enrichie en molécule(s) cible(s), à savoir dans laquelle la (ou les) molécule(s) cible(s) est (sont) présente(s) en de plus fortes teneurs en comparaison avec la solution initiale n'ayant pas subi l'étape (i) Le taux d'enrichissement obtenu à l'issue de l'étape (i) peut par exemple être compris entre 2 et 1000, notamment entre 5 et 100.
Selon un mode de réalisation de l'invention, il peut notamment s'agir d'une étape d'extraction en phase solide (SPE). Une procédure d'extraction en phase solide comporte généralement trois ou quatre étapes. La première est le conditionnement de l'adsorbant (comprenant selon l'invention au moins un premier MIP contenu dans la cartouche d'extraction, qui permet de mouiller le support en solvatant les groupements fonctionnels présents à sa surface.
Lors de la seconde étape, on procède à la percolation de la solution a traiter sur le premier MIP, de sorte à ce que les entités n'ayant aucune affinité avec ce dernier ne soient pas retenues.
En revanche, la (ou les) molécule(s) cible(s), et éventuellement d'autres entités présentant une forte affinité avec l'adsorbant, restent sur le support à l'issue de cette étape.
Une étape supplémentaire de lavage peut être effectuée afin d'éliminer les entités faiblement retenues par le support, au moyen d'un solvant de force éluante convenable pour éluer ces entités tout en gardant la (ou les) molécule(s) cible(s) sur le support.
On procède enfin a l'élution de la (ou des) molecule(s) cible(s) par passage d'un solvant spécifiquement choisi pour permettre de rompre les interactions de reconnaissance mises enjeu entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et le premier MIP tout en évitant d'eluer des entités mterférentes fortement retenues sur le support, de telle sorte à libérer la (ou les) molécule(s) cible(s) extraite(s).
A la fin de ce processus d'extraction et de libération, on obtient donc une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molecule(s) cible(s). Comme indiqué précédemment, cette solution pré-traitée peut être utilisée telle quelle pour la troisième étape (iii), ou être préalablement traitée avant d'être mise en contact avec le deuxième
MIP.
Selon une variante préférée de l'invention, ladite solution purifiée et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s) est utilisée telle quelle pour la troisième étape (iii), c'est-à-dire sans subir de traitement préalable
Typiquement, les solvants utilisés lors d'une extraction en phase solide peuvent être des solvants organiques comme par exemple l'acétonitrile, le méthanol, le dichlorométhane, des solvants aqueux comme par exemple l'eau, des solutions tampons, les solvants pouvant être utilisés en mélange et avec différentes conditions de salinité, de pH, de polarité.
Il est connu que la molécule cible sera retenue d'autant plus spécifiquement dans un MIP qu'il s'y développera le même type d'interactions que celles développées lors de la synthèse.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape (i) peut être réalisée en utilisant un solvant identique ou similaire au solvant utilisé lors de la synthèse du premier MIP. D'autres types d'étapes de prétraitement peuvent être envisagées comme par exemple la micro-extraction en phase solide (SPME ou « solid phase micro-extraction » en langue anglaise), l'extraction dynamique sur phase solide (SPDE ou « solid phase dynamic extraction » en langue anglaise), l'extraction sur barreaux d'agitation (SBSE ou
« Stir Bar Sorption Extraction » en langue anglaise), des capillaires, des bandes, des puces.
Le choix et la synthèse du MIP, ainsi que l'adaptation des conditions d'utilisation relèvent des connaissances générales de l'homme du métier.
Etape de détection
Selon l'invention, les étapes (iii) et (iv) de détection de la (ou des) molécule(s) cible(s) sont réalisées après les étapes (i) et (ii) de pré-traitement décrites ci-dessus. Comme indiqué précédemment, la mise en œuvre d'une étape de détection selon l'invention permet avantageusement de détecter simplement des analytes qui sont dépourvus de groupements facilement détectables.
La solution purifiée et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s) obtenue(s) à l'issue de l'étape (ii) peut être directement mise en contact avec le deuxième MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance pour la (ou les) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur tel que décrit précédemment. Elle peut alternativement être traitée avant d'être mise en contact avec ledit deuxième MIP, de sorte par exemple à modifier son pH, la concentration en molécule(s) cible(s), sa salinité, ou sa polarité.
Lorsqu'il est question dans les paragraphes qui suivent des « conditions », il faut entendre les conditions de pH, de concentration en molécule(s) cible(s), de salinité, de polarité. Ainsi, selon une variante préférée de l'invention, la solution obtenue à l'issue de l'étape (ii) peut être directement mise en contact avec le deuxième MIP, ledit deuxième
MIP étant soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance d'au moins un marqueur compétitif tel que décrit précédemment, soit constitué d'au moins un marqueur intrinsèque tel que décrit précédemment.
Dans ce cas, les premier et deuxième MIPs sont de nature chimique différente, et on choisit le marqueur compétitif de telle façon à ce qu'il soit apte à être déplacé par la (ou les) molécules cible(s), dans les conditions mises en œuvre lors de l'étape de libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP. Alternativement, on choisit le marqueur intrinsèque de telle façon à ce qu'il soit apte à interagir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP, et à émettre en conséquence un signal détectable dans les conditions mises en œuvre lors de l'étape de libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP.
Cette première variante de réalisation permet notamment de limiter le nombre d'étapes requises pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention, et donc de limiter le nombre de manipulations et de faciliter ainsi de façon générale la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Selon une autre variante de réalisation, la solution obtenue à l'issue de l'étape
(ii) peut être traitée avant d'être mise en contact soit avec le deuxième MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance pour la (ou les) molécule(s) cible(s), d'au moins un marqueur compétitif tel que décrit précédemment, soit avec le deuxième MIP constitué d'au moins un marqueur intrinsèque tel que décrit précédemment. Dans ce cas, on peut utiliser soit des premier et deuxième MIPs identiques en terme de nature chimique, et se différenciant par exemple uniquement par la présence d'au moins un marqueur, par exemple d'un marqueur compétitif dans tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP, soit des premier et deuxième MIPs de nature chimique différente, de telle façon que le marqueur soit ou bien apte à être déplacé par la (ou les) molécules cible(s), dans les conditions mises en œuvre lors de l'étape de libération de la (ou des) molécule(s) cible(s) extraite(s) par le premier MIP (cas d'un marqueur compétitif), ou bien apte à interagir avec la (ou les ) molécule(s) cible(s) et à émettre en conséquence un signal détectable (cas d'un marqueur intrinsèque).
Lorsque les premier et deuxième MIPs sont identiques en terme de nature chimique, la solution enrichie en molécule(s) cible(s) obtenue à l'issue de l'étape (ii) peut notamment, selon cette deuxième variante de réalisation, être traitée de telle sorte à obtenir des conditions de pH, de concentration en molécule(s) cible(s), de salinité et/ou de polarité approchant celles mises en œuvre lors de l'étape (i) pour l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s).
En revanche, lorsque le premier et deuxième MIPs sont de nature chimique différente, cette étape additionnelle de traitement peut par exemple consister à atteindre les meilleures conditions d'utilisation requises pour la mise en œuvre de l'étape (iii).
Marqueur compétitif
Selon un premier mode de réalisation, l'étape (iii) repose sur un test de compétition entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et le marqueur compétitif vis-à-vis des sites de reconnaissance d'un deuxième MIP.
Des tests de compétition entre un analyte et un marqueur adsorbé sur des MIPs ont déjà été décrits dans la littérature. On peut ainsi se reporter par exemple à la revue de
Richard J. Ansell, Journal of Chromatography B, 804 (2004) 151-155, déjà citée dans le préambule, qui répertorie les différents modes d'utilisation de MIPs dans de tels tests, notamment en radio immunoanalyse.
Comme indiqué dans la description du kit selon l'invention, le marqueur compétitif utilisé dans l'étape (iii) doit présenter une plus faible affinité pour les sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP que la (ou les) molécule(s) cible(s), dans les conditions d'utilisation du deuxième MIP dans cette étape.
Compte tenu de cette différence d'affinité, la mise en présence du deuxième
MIP doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur avec la solution pré-traitée purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s) va entraîner le déplacement du marqueur par la (ou les) molécule(s) cible(s), qui sera ainsi substitué dans le deuxième MIP par la (ou les) molécule(s) cible(s).
La détection de la (ou des) molécule(s) cible(s) dans l'étape (iii) repose ainsi sur un déplacement de l'équilibre entre d'une part le deuxième MIPs doté du (ou des) dit(s) marqueur(s) et d'autre part le deuxième MIP doté de la (ou des) molécule(s) cible(s), la formation de ce dernier complexe étant favorisée.
Ici encore, le deuxième MIP peut être adapté selon les connaissances de l'homme du métier, en fonction de la (ou des) molécule(s) cible(s) et/ou du marqueur et/ou des conditions d'utilisation et/ou de l'application visée.
Le choix du marqueur compétitif peut également être adapté selon la connaissance générale de l'homme du métier.
Par exemple, lorsque la molécule est la dopamine, et lorsque le deuxième MIP est utilisée dans du méthanol, le marqueur compétitif peut être notamment la 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarine, comme illustré dans l'exemple 6 ci-après.
Ainsi, un marqueur compétitif présentant par exemple une forte affinité pour les sites de reconnaissance du deuxième MIP ne pourra être déplacé que par une molécule cible particulière présentant une affinité encore plus forte pour lesdits sites de reconnaissance, tandis qu'un marqueur compétitif présentant une plus faible affinité pour les sites de reconnaissance du deuxième MIP pourra être déplacé plus facilement par une molécule cible, voire même par une famille de molécules cibles.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le marqueur compétitif peut être déplacé par la (ou les) molécule(s) cible(s) en présence de très faibles teneurs en molécule(s) cible(s), et par exemple en présence de teneurs inférieures à 1 μg/L voire inférieures à 100 ng/L.
Par ailleurs, lorsque le marqueur compétitif utilisé est détectable à de très faibles teneurs, comme par exemple à des teneurs inférieures à 500 ng/L, voire à 100 ng/L, et en particulier lorsque le marqueur compétitif utilisé est détectable à des teneurs inférieures aux teneurs auxquelles peut être détectée la (ou les) molécule(s) cible(s), l'étape (iv) de détection selon l'invention permet d'amplifier le signal de détection de la (ou des) molécule(s) cible(s), et donc d'améliorer la sensibilité de la mesure.
Marqueur intrinsèque
Selon un deuxième mode de réalisation, l'étape (iii) repose sur la manifestation d'une interaction entre la (ou les) molécule(s) cible(s) et au moins un marqueur intrinsèque constitutif du deuxième MIP. Comme indiqué précédemment, un marqueur intrinsèque selon l'invention peut soit constituer une partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième MIP et participer ainsi a leur reconnaissance, soit se situer à proximité de ces sites. Dans ces deux cas, le marqueur intrinsèque doit être toutefois apte à interagir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci est (sont) extraite(s) par le deuxième MIP et doit être également apte à émettre en conséquence un signal détectable.
La détection de la (ou des) molécule(s) cible(s) dans l'étape (ni) repose ainsi dans ce mode de réalisation sur une interaction entre au moins un marqueur intrinsèque et tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s)
Selon un mode de réalisation, cette interaction peut être non covalente, de préférence de type liaison faible, et par exemple de type liaison hydrogène.
Il peut notamment s'agir d'une interaction de type liaison hydrogène pouvant par exemple se traduire par un déplacement bathochromique (î.e. vers les plus grandes longueurs d'onde) ou hypsochromique (i.e. vers les plus petites longueurs d'onde) de la longueur d'onde détectée
Analyse Le procédé selon l'invention peut être destiné à une analyse qualitative, c'est- à-dire viser uniquement a savoir si une (ou des) molécule(s) cible(s) et (sont) présente(s) dans un milieu particulier.
Le procédé selon l'invention peut également permettre, outre cette détection de la présence ou non de la (ou des) molécule(s) cible(s), une analyse semi-quantitative, voire quantitative de celle(s)-ci, via soit la détermination de la quantité de marqueur compétitif relargué, soit l'analyse du signal émis par le marqueur intrinsèque
Comme indiqué précédemment, selon la variante de réalisation mettant en œuvre un marqueur compétitif, l'étape (iii) de détection fait en effet intervenir un déplacement compétitif dudit marqueur par la (ou les) molécule(s) cible(s), tel que le nombre de moles de marqueur relargué soit fonction du nombre de moles de molécule cible détectées. Selon la variante mettant en œuvre un marqueur intrinsèque, la variation du signal est fonction du nombre de molécule cible
Ainsi, un kit d'analyse selon l' invention peut comprendre en outre, selon un mode de réalisation, un dispositif d'analyse semi-quantitative et/ou un dispositif d'analyse quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), basé(s) soit sur la détermination de la quantité de marqueur compétitif relargué, soit sur l'analyse du signal émis par le marqueur intrinsèque
Ces dispositifs peuvent comprendre, le cas échéant, des moyens d'étalonnage permettant de corréler la quantité de marqueur compétitif relargué ou la quantité de marqueur intrinsèque émettant un signal détectable à la quantité de molécule(s) cible(s).
Selon un mode de réalisation, il peut être nécessaire de mettre en œuvre une étape additionnelle de traitement, préalablement à l'étape (îv) de détection à proprement parler. A titre d'exemple de tels traitements, on peut notamment citer des lavages, en particulier dans le cas où le deuxième polymère à empreintes polyméπque est conditionné sous la forme d'une cartouche SPE.
Il est ainsi possible selon l'invention de déterminer de façon semi-quantitative la concentration en molécule(s) cible(s), en utilisant par exemple dans l'étape (iv) un dispositif d'analyse semi-quantitative comprenant au moins deux supports d'analyse comprenant des deuxièmes polymères à empreintes moléculaires de même nature ou différents dotés de marqueurs compétitifs identiques ou différents ou constitués de marqueurs intrinsèques identiques ou différents, détectables par exemple par l'œil nu
Selon une variante de l'invention, les marqueurs peuvent être identiques, et les deux supports d'analyse peuvent présenter des concentrations en marqueurs distinctes correspondant a des gammes de concentrations en molécule(s) cible(s) déterminées. Selon un mode de réalisation de l'invention mettant en œuvre un marqueur compétitif, illustré notamment en figure 2, le deuxième polymère à empreintes moléculaires peut être conditionné sous la forme d'une cartouche SPE graduée, et le marqueur compétitif peut être détectable par l'œil nu, par exemple par sa couleur caractéristique. L'étape (iv) de détection est alors rendue possible par l'observation d'une disparition de la couleur du support, dans la partie du support où le déplacement compétitif s'est déjà manifesté. II est aussi possible selon l'invention de déterminer de façon semi-quantitative la concentration en molécule(s) cible(s), en visualisant par exemple l'avancée de la décoloration du deuxième MIP par une graduation présente sur le support ; cette décoloration étant fonction de la concentration en molécule cible. De façon analogue, une telle analyse semi quantitative est également possible par coloration en mettant en œuvre des marqueurs intrinsèques.
La comparaison des signaux détectés suite au relargage du marqueur compétitif ou à l'émission du signal du marqueur intrinsèque, sur chaque support, permet ainsi d'évaluer la teneur en molécule(s) cible(s) en la situant dans des gammes de concentration.
Il est évidemment possible de prévoir des quantités de supports variables de sorte à ménager des gammes de teneurs plus ou moins fines.
Par exemple, on peut prévoir de 1 à 20 supports distincts, voire un nombre virtuellement illimité de supports, dans le cas particulier de l'utilisation de puces. Selon cette variante de réalisation, il est possible de faire varier la concentration en marqueur des différents supports en utilisant des deuxièmes MIPs comportant des densités en sites de reconnaissances variables, ou encore en immobilisant une moins grande quantité d'empreinte sur le support, ou encore en mélangeant des MIPs avec des polymères identiques à ceux constituant la matrice des MIPs, mais dépourvus d'empreintes, à des ratios donnés.
Pour la mise en œuvre du procédé d'analyse quantitative, le marqueur utilisé selon l'invention étant par définition une entité détectable, il est également possible de déterminer précisément la concentration en molécule(s) cible(s) en mesurant soit la quantité totale de marqueur compétitif relargué lors de l'étape (iii) de détection, soit le signal émis par le marqueur intrinsèque au cours de l'étape (iii) de détection, et en se référant, le cas échéant, au résultat d'un étalonnage préalable.
Toutes les méthodes de détection utiles à cet effet sont connues de l'homme de l'art.
Comme indiqué précédemment les méthodes de détection par colorimétrie visible, par fluorescence et par UV visible sont préférées dans le cadre de la présente invention. APPLICATIONS
Le kit d'analyse selon la présente invention peut être utilisé pour de nombreuses applications à des fins d'analyse, et plus particulièrement pour l'analyse d'analytes présents dans des milieux complexes ou présents à l'état de trace dans un échantillon
Dans le cadre de la présente invention, le kit d'analyse s'entend également d'un kit de diagnostique, d'un kit de dépistage, d'un kit d'analyse de polluants, de toxiques, de médicaments, de contaminants, de drogues, de produits chimiques, de parfum et de colorants. II peut notamment s'agir d'un kit de diagnostique, d'un kit d'analyse de polluants, de toxiques, de médicaments, de contaminants, de drogues, de produits chimiques, de parfums, de colorants, de vitamines, de protéines, d'ammoacides et de peptides, d'oligonucléotides, d'hormones, d'enzymes, de biomarqueurs, de métabohtes, d'agents chimiques ou biochimiques de guerre, de sucres, de polysaccharides, de neurotransmetteurs, de mycotoxmes, de pesticides, de fongicides, d'herbicides, d'insecticides, de fertilisants, d'anticorps, de molécules indiquant la sécurité et/ou la qualité des produits alimentaires, de stéroïdes, de drogues ou de produits ou sous-produits d'une réaction.
Les molécules cibles qu'il est par exemple possible d'analyser au moyen du kit selon l'invention sont notamment la dopamme et ses dérivés tels par exemple la sérotonme, la Z-tyrosme, l'acide 3,4 dihydroxy-phénylacétique ou encore la méthoxytyramine, l'homocystéine, la cystéme, le glucose, le cholestérol, la testostérone, les stéroïdes anabolisants, l'estradiol, la citrosine, la vitamine K, la vitamine D, la vitamine B12, l'atrazine, le phénobarbital, le chloramphénicol, le propranolol, la théophylline, le diéthylstilbène, la progestérone, les organophosphorés, la cocaïne, le THC, ou encore Pochratoxme A.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le kit d'analyse peut être destiné à l'analyse de la dopamine et/ou ses dérivés, tels que décrits ci-dessus ou à l'analyse de Pochratoxme A. L'invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, d'exemples de mise en œuvre non limitatifs, et à l'examen des dessins annexés, qui font partie intégrante de la description.
Un kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires et au moins un marqueur, peut être proposé par exemple à l'utilisateur, dans une boite 1 contenant, comme on peut le voir sur la figure 4, deux seringues 2 et 3 prémunies respectivement des premier et deuxième MIP 4 et 5, éventuellement un tube 6 (tube à hémolyse ou tube à essai) destiné à recevoir la solution d'élution issue du MIP 4, un récipient 7 contenant la solution d'élution 8, un récipient 9 contenant une solution de lavage 10, une notice d'utilisation éventuelle 11 ainsi qu'éventuellement un récipient 12 contenant des réactifs destinés à ajuster la solution d'élution issue du MIP 4.
Le kit peut servir à un usage unique ou au contraire comporter des quantités suffisantes de réactifs et de solution pour élution pour permettre l'analyse de plusieurs molécules cibles.
Les seringues 2 et 3 peuvent être en verre ou en plastique. Elles peuvent comporter, comme représenté pour la seringue 2, un corps 15 et un piston 14.
Pour utiliser le kit représenté à la figure 4, l'utilisateur introduit la solution à analyser 13 dans la seringue 2 grâce à une pipette avantageusement graduée, non représentée dans la figure 4. La seringue 2 est représentée dans la figure 4 en présence de ladite solution à analyser 13. Une fois la pression exercée par l'utilisateur sur le piston 14 pour évacuer le liquide contenant les interférents, la molécule cible est récupérée par élution avec la solution 8, éventuellement après un ou plusieurs lavages réalisés par la solution 10. La solution d'élution ainsi récupérée est alors soit introduite directement dans la seringue 3 soit récupérée dans le tube 6 pour l'ajustement du milieu à l'aide du réactif contenu dans le récipient 12 puis alors introduite dans la seringue 3. Le même piston 14 ou un autre piston sert alors à effectuer la pression nécessaire dans la seringue 3 pour permettre la détection de la molécule cible recherchée, par émission d'un signal suite à la mise en contact avec le MIP 5 de la solution d'élution récupérée de l'opération d'enrichissement effectuée grâce à la seringue 2. Selon la variante illustrée dans la figure 4, la détection est visuelle de sorte que la deuxième seringue est graduée et permet une analyse quantitative directe, sans passer par un appareillage supplémentaire, dès lors que l'ensemble de la solution d'élution récupérée de l'opération d'enrichissement effectuée grâce à la seringue 2 est entièrement passée à travers le MIP 5. Selon cette variante, la présence de la molécule cible se traduit par une apparition, une disparition ou un changement de couleur proportionnel à la quantité de molécule présente.
Dans une variante non illustrée, le kit comprend également le système de détection, lorsque la détection ne s'effectue par à l'œil nu. Un tel système de détection peut être un détecteur portatif, par exemple de la fluorescence ou des UV Selon cette variante, la seringue est avantageusement graduée et peut être portée dans son ensemble sous la lampe adéquate pour visualiser le signal émis.
Les seringues 2 et 3 peuvent être rincées par une solution appropriée, non représentée dans la figure 4, afin de servir pour une utilisation ultérieure.
Une variante particulière d'utilisation du kit de la figure 4 est représentée dans la Figure 5
Dans cette variante, les MIP 4 et 5 sont conditionnés dans des cartouches individuelles 17 et 18 encliquetables respectivement sur la seringue 16 et sur la cartouche 17.
La seringue 16 illustre la première étape de pré-traitement et la seringue 19, identique ou différente de la seringue 16, illustre quand à elle l'étape de détection où la solution remplissant la seringue 19 est la solution éluante de la molécule cible à la fois propice à la libération des molécules cibles du MIP 4 et à l'interaction de la molécule cible avec le MIP 5
On a représente à la figure 6 un exemple de kit d'analyse 20 selon l'invention dans lequel les MIPs 21 et 22 sont intégrés dans un seul et même système, miniaturise ou non, qui peut être un système microfluidique. Un système microfluidique peut être plus particulièrement adapté au traitement de faibles volumes de solution. Un tel système microfluidique peut typiquement se présenter sous la forme d'un système essentiellement plat, du format par exemple d'une carte bancaire. Dans ce système, les supports comprenant les MIPs 21 et 22 peuvent être fixes dans le système, ou amovibles. Dans ce deuxième cas, l'utilisateur peut moduler le couple de MIPs qui sera plus particulièrement adapte à l'analyse visée
Un tel système peut être avantageusement transparent, et par exemple être en verre ou en matière plastique
Les récipients contenant les liquides d'élution et de lavage ne sont pas représentés, ni l'éventuelle notice d'utilisation.
Le kit d'analyse 20 peut par exemple comporter 3 entrées 23, 24 et 25 et 3 sorties 26, 27 et 28. L'accès a ces entrées et/ou sorties peut être ouvert ou ferme par des clapets 29, 30, 31, 32, 33 et 34.
Pour utiliser le kit représenté à la figure 6, l'utilisateur introduit par l'entrée 24 la solution à analyser, après avoir fermé les clapets 29 et 31. Cette solution peut par exemple être introduite par une pipette, par une seringue ou par une micropompe, non représentées dans la figure 6. La solution à analyser est mise ainsi en contact avec le MIP 21 sous pression de sorte que le liquide contenant les mterférents soit évacué par la sortie 26 lorsque le clapet 30 est ouvert.
L'utilisateur peut procéder à un ou plusieurs lavages du MIP 21 en introduisant de la même façon une solution de lavage par l'entrée 24, les clapets 29 et 31 étant fermés et le clapet 30 étant ouvert. La ou les solutions résultantes et, le cas échéant les mterférents, sont ainsi dirigées vers la sortie 26.
L'utilisateur peut procéder ensuite à Pélution de la molécule cible en introduisant une solution éluante par l'entrée 24, les clapets 29, 30 et 32 étant fermés et le clapet 31 étant ouvert, ainsi que l'un des clapets 33 ou 34 La solution d'élution ainsi récupérée est alors mise en contact directement avec le MIP 22.
En variante, l'utilisateur peut procéder à l'élution de la molécule cible en introduisant une solution éluante par l'entrée 24, les clapets 29 et 31 étant fermés, et le clapet 30 étant ouvert La solution d'élution est alors récupérée par la sortie 26. Elle peut être ensuite introduite directement dans le système par l'entrée 25, le clapet 31 étant fermé et le clapet 32 étant ouvert ainsi que l'un des clapets 33 ou 34, ou être alternativement traitée, avant d'être réintroduite dans le système par l'entrée 25, le clapet 31 étant fermé et le clapet 32 étant ouvert, ainsi que l'un des clapets 33 ou 34. Lorsque le MIP 22 comprend un marqueur compétitif, le marqueur ainsi déplacé à l'étape précédente peut être entraîné avec ladite solution vers la sortie 27 ou 28.
Il est possible de rajouter au niveau de la sortie 27 ou 28 un système de détection, non représenté, lorsque la détection ne s'effectue pas à l'œil nu. Un tel système peut être un détecteur portatif, par exemple de la fluorescence ou des UV.
Lorsque le MIP 22 est constitué d'un marqueur qu'il soit compétitif ou intrinsèque, l'utilisateur peut détecter directement le signal émis par ledit marqueur (marqueur non déplacé dans le cas du marqueur compétitif et marqueur émettant un signal dans le cas du marqueur intrinsèque). Dans cette variante, ce MIP peut par exemple être doté d'une graduation, non représentée, permettant de lire directement le niveau de signal émis.
Le système 20 peut être rincé par une solution appropriée, non représentée sur la figure 6, afin de servir pour une utilisation ultérieure. Cette solution peut par exemple circuler entre l'entrée 23 et la sortie 27, les clapets 29, 31 et 33 étant ouverts et les clapets 30, 32 et 34 étant fermés.
Dans le cas où la détection n'est pas visuelle, le signal du marqueur peut être détecté par placement du système dans son ensemble dans ou sous un dispositif adapté à ladite détection, comme par exemple une lampe à fluorescence Encore plus particulièrement, lorsque le système et plat, et se trouve par exemple sous la forme d'une carte, il peut être introduit par une fente dans un dispositif de détection convenable.
Bien entendu, d'autres kits peuvent encore être utilisés et d'autres mises en œuvres de l'invention peuvent être envisagées.
Dans l'ensemble du texte, y compris les revendications, l'expression « comportant un » doit se comprendre comme étant synonyme de « comportant au moins un », sauf si le contraire est spécifié.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse du monomère dérivé de la N-ter£-butoxycarbonyl-3,4- dihydroxyphényléthylamine. Synthèse d'un MIP de la dopamme à partir du monomère dérivé de la N-ter£-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamme noté « MIP n°l » et d'une matrice notée "Matériau Non Imprimé n°l", les deux matériaux étant à base de divinylbenzène (DVB). Synthèse d'un MIP de la dopamme à partir du monomère dérivé de la N-fer^-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine noté « MIP n°2 » et d'une matrice notée "Matériau Non Imprimé n°2", les deux matériaux étant à base du diméthylacrylate de Péthylène glycol (EGDMA).
Monomère dérivé de la N-tert-butoxycarbonyl-3, 4-dihydroxyphényléthylamine
Figure imgf000040_0001
La N-ter^-butoxycarbonyl-3,4-dihydroxyphényléthylamine telle que décrite dans Xu C, Xu K., Gu H., Zheng R., Liu H., Zhang X., Guo Z., Xu B. J. Am. Chem. Soc.
2004, 126, 9938 (0,609 g ; 2,41 mmol) et l'anhydride de l'acide 4-vinylphényl boronique
(0,312 g ; 0,80 mmol) sont mis en solution dans 60 mL de toluène anhydre, puis le mélange est porté à reflux pendant 3 heures sous atmosphère inerte. Les particules insolubles à chaud sont filtrées, puis le toluène est évaporé. L'huile obtenue est diluée dans le minimum d'acétate d'éthyle, puis du cyclohexane (20 mL) est ajouté au mélange.
On obtient alors 0,812 g d'une poudre blanche (rendement : 93 %) correspondant au
5-[2-(N-ter?-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl) benzo[l,3,2]dioxoborole.
Matrices à base de DVB Le divinylbenzène est lavé plusieurs fois par une solution basique saturée au
NaCl pour éliminer l'inhibiteur. Il est séché sur MgSU4. L'amorceur azobisisobutyronitrile
(AIBΝ) est recristallisé dans l'acétone.
Le MIP n° 1 est préparé en mélangeant 725 mg du monomère
5-[2-(N-ter?-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl)benzo[l,3,2]dioxoborole, 6,2 g de divinylbenzène à 80 %, 1,1 g d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans 7,2 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 89 mg d'AIBΝ. La polymérisation s'effectue à 50 0C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc. Le matériau non imprimé n° 1 est préparé en mélangeant 1,98 g de styrène,
6,2 g de divinylbenzène à 80 %, 1,1 g d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans 7,2 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 89 mg d'AIBN. La polymérisation s'effectue à 50 0C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc.
Matrices à base d 'EGDMA
Le diméthylacrylate de l'éthylène glycol est lavé plusieurs fois par une solution basique saturée au NaCl pour éliminer l'inhibiteur. Il est séché sur MgSθ4. L'amorceur azobisisobutyronitrile (AIBN) est recristallisé dans l'acétone.
Le MIP n° 2 est préparé en mélangeant 626 mg du monomère 5-[2-(N-tert-butoxycarbonyl)éthylamino]-2-(4-vinylphényl)benzo[l,3,2]dioxoborole, 6,48 g de diméthylacrylate de l'éthylène glycol, 940 mg d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans 9 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 77 mg d'AIBΝ. La polymérisation s'effectue à 50 0C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc.
Le matériau non imprimé n° 2 est préparé en mélangeant 1,98 g de styrène,
7,55 g de diméthylacrylate de l'éthylène glycol, 1,1 g d'acrylate de 2-carboxyéthyle dans
7,2 mL de chloroforme anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 89 mg d'AIBΝ. La polymérisation s'effectue à 50 0C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc.
Les matrices préparées ci-dessus sont broyées grossièrement et mises en suspension dans 80 mL d'une solution de méthanol à 9 % en acide chlorhydrique pendant 24 heures. Une fois filtrée, la poudre est de nouveau mise en suspension dans 80 mL de méthanol pendant 24 heures. La poudre filtrée est alors broyée puis tamisée. Les particules dont la taille est située entre 25 et 45 μm sont introduites dans une colonne HPLC 15O x 4.6 mm puis tassées par pression et lavées avec un mélange 5 % Acide Acétique dans Acétonitrile/H2θ (97,5/2,5) puis du méthanol pour l'étude de la reconnaissance de la dopamine en HPLC. Ainsi on dispose de 4 colonnes HPLC. En parallèle on prépare des cartouches SPE avec des particules 25-45 μm avec chaque matrice. Exemple 2 : Propriétés de reconnaissance vis-à-vis de la dopamine par HPLC. La reconnaissance se déroule selon le schéma ci-dessous.
Figure imgf000042_0001
Une solution à 1 mM de l' hydrochlorure de la dopamine dans le méthanol est injectée sur les quatre colonnes remplies respectivement de l'empreinte n° 1, du matériau non imprimé n° 1, de l'empreinte n° 2 et du matériau non imprimé n° 2.
L'éluant utilisé est un mélange à 95/5 de MeOH/tampon acétate 10 mM à pH=5 avec un débit de 1 mL/min La détection de dopamme est faite à 281 nm. Les volumes d'injection sont de 20 μL et de 5 μL d'une solution d'acétone dans le méthanol. L'acétone est utilisée pour déterminer le volume mort de la colonne
On détermine les valeurs de k' (facteur de capacité) et d'IF (facteur d'empreinte) pour évaluer la reconnaissance de la dopamine sur toutes les matrices
Matrices à base de DVB
Analyte Dopamine 0,82 mM
/analyte — /acétone 11,06 k' MIP n°l = /acétone
^analyte — ^acétone 4,63 matériau non imprime n°l — /acétone
MIF n° 2,39
IF = - matériau non imprime n°l Matrices à base d 'EGDMA
Analyte Dopamine 0,91 mM fanalyte — /acétone 29,83
MIP n°2 = /acétone
fanalyte — /acétone 12,48 matériau non imprime n°2 — /acétone
&' l\lIP n° 2,39
IF = -
K matériau non imprimé n°2
On observe que la dopamine est reconnue par les deux MIPs. La dopamine est cependant plus retenue sur le MIP n° 2 que sur le MIP n° 1 (k' plus important).
Exemple 3 : Sélectivité des différentes matrices vis-à-vis de plusieurs composés par HPLC.
Différentes solutions à 1 mM de plusieurs composés dans le méthanol sont injectées sur les quatre colonnes remplies respectivement du MIP n°l, du matériau non imprimé n° 1, du MIP n° 2 et du matériau non imprimé n° 2.
L'éluant utilisé est un mélange à 95/5 de MeOH/tampon acétate 10 mM à pH=5 avec un débit de 1 mL/min. La détection des composés est faite à 281 nm. Les volumes d'injection sont de 20 μL.
On détermine les valeurs de k' (facteur de capacité) et d'IF (facteur d'empreinte) pour évaluer la reconnaissance des composés sur toutes les matrices.
Matrices à base de DVB
Analyte MIP n°l k' matériau non imprimé n°l IF
Dopamine 0,82 mM 11,06 4,63 2,39
Catéchol 0,9 mM 2,20 0,43 1,25
Acide 3,4-dihydroxyphénylacétique 0,97 mM 0
L-Tyrosine 0,94 mM 0,151 0,136 1,1
Sérotonine 0,80 mM 6,315 6,44 0,98
Matrices à base d' EGDMA
Figure imgf000044_0001
Par HPLC on constate que les molécules contenant une fonction acide ne sont pas du tout retenues sur les empreintes à la différence de la dopamine.
Les empreintes sont sélectives de la dopamine par rapport à des molécules de structure semblable. L'empreinte n° 1 est plus sélective que l'empreinte n° 2 au vu des valeurs du facteur d'empreinte de la sérotonine sur les deux empreintes.
La 6,7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarine est moins bien retenue sur l'empreinte n° 2 que la dopamine mais on observe une certaine rétention sur cette empreinte. Cette molécule pourra être utilisée comme marqueur pour les études de déplacement.
Exemple 4 : Reconnaissance de la dopamine par SPE
Deux cartouches de SPE sont réalisées en introduisant 200 mg de chacune des matrices empreintes (empreintes n° 1 et n° 2) entre deux frittes. Une extraction de la dopamine est alors réalisée. Pour ce faire 5 mL d'une solution de tampon phosphate 10 mM à pH 7 sont percolés sur ces cartouches suivis par 5mL d'eau MiIIiQ et 5mL de MeOH pour conditionner les cartouches avant d'introduire la dopamine. Puis 500μL d'une solution MeOH-Tampon acétate pH=5 1OmM (80/20, v/v) dopée à lOμg/mL de dopamme sont percolés sur les cartouches de SPE Plusieurs fractions de 3mL de solution MeOH- Tampon acétate pH=5 (80/20, v/v) sont utilisées comme solution de lavage. Par la suite 2 x 2mL de MeOH contenant 0,025% d'acide acétique sont percolés Les diverses fractions sont ensuite analysées par HPLC-UV.
Le tableau donne les taux de récupération (%) de dopamme obtenus lors de cette extraction
Figure imgf000045_0001
On observe dans ces conditions d'utilisation une différence de comportement des deux matrices vis-à-vis de la rétention de la dopamme
Exemple 5 : Sélectivité de l'empreinte par SPE La sélectivité de la matrice empreinte a été testée en ajoutant une molécule similaire à la dopamme pendant la phase de percolation. L'acide 3,4-dihydroxy-phénylacétique a été choisi comme molécule test. Après conditionnement des cartouches, 500μL de MeOH contenant 5μg de l'acide et 5μg de dopamine sont introduits. Plusieurs fractions de lavage (2 mL de MeOH-Tampon acétate pH=5 1OmM (95/5, v/v)) sont ensuite utilisées, suivies par une élution avec du MeOH-0,05% d'acide acétique. Le tableau donne les taux de récupération (%) de dopamine et d'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique obtenus lors de cette extraction.
Figure imgf000046_0001
L'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique n'est pas retenu sur la matrice empreinte et sort dès l'introduction des produits.
Comme en HPLC on constate que la molécule contenant une fonction acide n'est pas du tout retenue sur les empreintes à la différence de la dopamine. Les empreintes sont sélectives de la dopamine par rapport à des molécules de structure semblable.
Exemple 6 : Déplacement de la 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine par SPE.
Essai A :
Deux cartouches de SPE contenant 70 mg de matrice empreinte sont préparées. Après conditionnement, les cartouches sont saturées avec 500μg de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine dans le méthanol. Sur la cartouche nommée « révélateur » 4 fractions de ImL contenant lOOμg de dopamine et lOμg de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine sont introduits. Sur la deuxième cartouche nommée « témoin » seulement lOμg de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine sont introduits. Des fractions de ImL contenant lOμg de
6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine dans du MeOH sont ensuite percolés sur les deux cartouches et chaque fraction est analysée. Le tableau suivant donne les quantités obtenues de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhylcoumarine dans ces diverses fractions.
Figure imgf000047_0001
On observe que l'introduction de la dopamme entraîne un taux de récupération en 6,7-hydroxy-4-tπfluorométhyl)coumarme plus élevé sur le révélateur que sur le témoin.
Essai B :
Deux cartouches de SPE contenant 25 mg de matrice empreinte sont préparées. Après conditionnement, 35μg de 6,7-hydroxy-4-trifluorométhyl coumarme contenu dans ImL de méthanol sont percolés suivi par ImL de MeOH. Sur la cartouche nommée « révélateur » ImL de MeOH contenant soit lOOμg soit 50μg de dopamme est introduit. Sur la deuxième cartouche nommée « témoin » seulement ImL de MeOH est introduit. Des fractions de ImL de MeOH sont ensuite percolées sur les deux cartouches. Le graphe de la figure 3, donne les quantités obtenues de 6,7-hydroxy-4-tπfluorométhyl coumarine dans ces diverses fractions lors de l'introduction de lOOμg de dopamine. Le tableau suivant donne les quantités obtenues de 6,7-hydroxy-4-tπfluorométhyl coumarme dans ces diverses fractions après percolation de 50μg de dopamine.
Figure imgf000048_0001
Après introduction de la dopamine sur le révélateur, on observe une variation de la quantité de 6,7-hydroxy-4-tπfluorométhyl coumarine due à un déplacement de celle- ci par la dopamine pour les deux concentrations testées ainsi qu'une décoloration de la cartouche fonction de la quantité de dopamine.
Exemple 7 : Synthèse d'un MIP de l'ochratoxine A « MIP n°3 » à base de diméthylacrylate de Péthylène glycol (EGDMA). MIP n°3
Le MIP n°3 est préparé en mélangeant 505 mg de l'ochratoxine A, 4,95 g de diméthylacrylate de l'éthylène glycol, 430 mg d'acide méthacrylique dans 6,9 mL d'acétomtπle anhydre Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 56 mg d'AIBN. La polymérisation s'effectue à 50 0C pendant 48 heures pour former un monolithe blanc.
Le MIP n°3 préparé ci-dessus est broyé puis tamisé. Les particules dont la taille est située entre 25 et 45 μm sont introduites dans une colonne HPLC 15O x 4,6 mm puis tassées par pression et lavées avec un mélange 5 % Acide Acétique dans
Acétomtnle/H2O (97,5/2,5) puis de Pacétomtπle. Les particules de 25-45 μm sont introduites dans des cartouches SPE. Exemple 8 : Synthèse du monomère (2s)-l-(2-méthacryloxyéthyl)-3-[4-(4- nitrophényldiazenylphenyljthiourée. Synthèse d'un MIP de l'ochratoxine A (OTA) à partir du (£)-l-(2-méthacryloxyéthyl)-3-[4-(4-nitrophényldiazenylphenyl]thiourée « MIP n°4 » à base de diméthylacrylate de Péthylène glycol (EGDMA).
Monomère dérivé du Disperse Orange 3 (/(£')-l-(2-méthacryloxyéthyl)-3-[4- (4-nitrophényldiazenylphenyl]thiourée)
Figure imgf000049_0001
Dans un bicol sous azote, on introduit 2,21 g de disperse Orange (95 %) puis
22 mL de THF sec. On ajoute 600 μL de chlorothionocarbonate de phényle. On agite à température ambiante pendant 2 heures. Par CCM (éluant : DCM), on n'observe plus de produit de départ. On filtre sur célite. On obtient une solution rouge limpide. On évapore. On ajoute sous azote 24 mL de toluène, 605 μL de triéthylamine et 439 μL de HSiCb. On agite à température ambiante pendant 4h45 puis on filtre sur Célite.
Le filtrat est évaporé. On réalise une purification sur colonne de silice et on obtient le thioisocyanate du disperse orange 3 produit attendu avec un rendement de 37 % (460 mg). Ce dernier est mis en solution dans 40 mL de DCM. On ajoute 323 μL de triéthylamine (1,1 eq) et sous azote on additionne le chlororhydrate du 2- aminoéthylméthacrylate (90%, 428 mg, 1,1 eq.). On agite à température ambiante pendant une nuit. On évapore et on purifie sur une colonne de silice en prenant comme éluant le dichlorométhane (DCM) puis un mélange 80/20 DCM/AcOEt. On obtient 326 mg de monomère du Disperse Orange 3 soit 37 % de rendement.
MIP n°4
Le MIP n°4 est préparé en mélangeant 125 mg de l'ochratoxine A, 1,23 g de diméthylacrylate de Péthylène glycol, 128 mg du (i?)-l-(2-méthacryloxyéthyl)-3-[4-(4- nitrophényldiazenylphenyljthiourée dans 1,7 mL d'acétonitrile anhydre. Le mélange est dégazé en faisant buller 10 minutes de l'azote puis on ajoute 14 mg d'AIBN. La polymérisation s'effectue à 50 0C pendant 48 heures pour former un monolithe orange. Le MIP n°4 préparé ci-dessus est broyé puis tamisé. Les particules dont la taille est située entre 25 et 45 μm sont introduites dans une colonne HPLC 15O x 4,6 mm puis tassées par pression et lavées avec un mélange 5 % Acide Acétique dans
Acétonitrile/H2θ (97,5/2,5) puis de Pacétonitrile. Les particules de 25-45 μm sont introduites dans des cartouches SPE.
Exemple 9 : Reconnaissance de l'OTA par SPE
Deux cartouches de SPE sont réalisées en introduisant 50 et 100 mg de chacune des matrices empreintes (empreinte n°3 et n°4) entre deux frittes. Une extraction de l'OTA est alors réalisée.
Protocole A
5 mL de vin blanc dopé à l'OTA sont percolés sur la cartouche SPE de 50 mg de l'empreinte n°3. Par différents lavages, on obtient à la fin du protocole une fraction d' élution contenant l'OTA à 99% .
La fraction contenant l'OTA est percolée sur la cartouche SPE de 100 mg de l'empreinte n°4. On observe alors une coloration brune proportionnelle à la quantité d'OTA présente dans la fraction d' élution.
Protocole B
5 mL de vin blanc dopé à l'OTA sont percolés sur la cartouche SPE de 100 mg de l'empreinte n°4. Aucune coloration n'est observée : la coloration orange propre au disperse Orange 3 est inchangée.
Ainsi il apparaît que le prétraitement de l'échantillon est donc essentiel.

Claims

REVENDICATIONS
1. Kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement identiques ou différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s), et au moins un marqueur, ledit marqueur étant soit un marqueur compétitif ou apte (i) à interagir avec tout ou partie des sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) du deuxième polymère à empreintes moléculaires et (ii) à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), soit un marqueur intrinsèque ou un motif constitutif du deuxième polymère à empreintes moléculaires et apte (i') à interagir avec tout ou partie de la (ou des) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) et (ii') à émettre en conséquence un signal détectable.
2. Kit selon la revendication précédente, dans lequel au moins le marqueur compétitif et le deuxième polymère à empreintes moléculaires sont conditionnés séparément.
3. Kit selon la revendication 1 , dans lequel au moins le marqueur compétitif et le deuxième polymère à empreintes moléculaires sont conditionnés ensemble de telle sorte que le deuxième polymère à empreintes moléculaires soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s), dudit marqueur.
4. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le deuxième polymère à empreintes moléculaires est de nature chimique différente du premier polymère à empreintes moléculaires.
5. Kit d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins un premier et un deuxième polymères à empreintes moléculaires chimiquement différents, aptes à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) et au moins un marqueur, ledit marqueur étant apte à émettre un signal détectable lors de la mise en présence dudit deuxième polymère à empreintes moléculaires avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s).
6. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier polymère à empreintes moléculaires est destiné à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s), par reconnaissance moléculaire de la (ou des) molécule(s) cible(s).
7. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le deuxième polymère à empreintes moléculaires est destinée à la détection, voire à la détermination de la concentration, de la (ou des) molécule(s) cible(s).
8. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le marqueur, le signal ou une variation de signal émis(s) par le marqueur est détectable par colorimétrie visible par exemple par l'œil nu, par radiochimie, par médecine nucléaire comme par exemple par scintigraphie, par imagerie, par résonance (IRM), par rayons X, par diffusion de lumière, par spectrométrie de masse, par spectroscopie, comme par exemple par fluorescence ou par UV-visible, par spectroscopie infrarouge, par spectroscopie de résonance des plasmons de surface, par chimiluminescence, par spectroscopie d'interférence et de réfraction, par diffusion Raman, par ultrasons, par radioactivité, par réfractométrie, par détections optique, piézoélectrique, magnétique, acoustique, par électrochimie, par conductivité, par pH métrie, ou encore par voie biologique, et de préférence par l'œil nu.
9. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'analyse d'une famille de molécules cibles.
10. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'analyse de la dopamine, et de ses dérivés tels par exemple la sérotonine, la L-tyrosine, l'acide 3,4 dihydroxy-phénylacétique ou encore la méthoxytyramine, l'homocystéine, la cystéine, le glucose, le cholestérol, la testostérone, les stéroïdes anabolisants, l'estradiol, la citrosine, la vitamine K, la vitamine D, la vitamine B12, l'atrazine, le phénobarbital, le chloramphénicol, le propranolol, la théophylline, le diéthylstilbène, la progestérone, les organophosphorés, la cocaïne, le THC, ou encore l'ochratoxine A.
11. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les premier et/ou deuxième polymères à empreintes moléculaires mettent en œuvre au cours de leur étape de polymérisation au moins le 5-[2-(N-tert- butoxycarbonyl)éthylammo] -2- [4-vinylphényl]benzo [ 1 ,3 ,2]dioxoborole.
12. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier polymère à empreintes moléculaires est mis en œuvre sur une colonne d'extraction.
13. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le deuxième polymère à empreintes moléculaires est mis en œuvre sur une cartouche
SPE, éventuellement graduée.
14. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un dispositif d'analyse semi-quantitative et/ou un dispositif d'analyse quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), basé(s) soit sur la détermination de la quantité de marqueur compétitif relargué, soit sur l'analyse du signal émis par le marqueur intrinsèque.
15. Kit d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel le dispositif d'analyse semi-quantitative comprend au moins deux supports d'analyse comprenant des deuxièmes polymères à empreintes polymériques, de même nature ou différents, dotés de marqueurs compétitifs, identiques ou différents, ou constitués de marqueurs intrinsèques identiques ou différents, détectables par exemple par l'oeil nu.
16. Kit d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel les marqueurs sont identiques et les au moins deux supports d'analyse présentent des concentrations en marqueurs distinctes correspondant à des gammes de concentrations en molécule(s) cible(s) déterminées.
17. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un kit de diagnostique, d'un kit d'analyse de polluants, de toxiques, de médicaments, de contaminants, de drogues, de produits chimiques, de parfums, de colorants, de vitamines, de protéines, d'aminoacides et de peptides, d'oligonucléotides, d'hormones, d'enzymes, de biomarqueurs, de métabolites, d'agents chimiques ou biochimiques de guerre, de sucres, de polysaccharides, de neurotransmetteurs, de mycotoxines, de pesticides, de fongicides, d'herbicides, d'insecticides, de fertilisants, d'anticorps, de molécules indiquant la sécurité et/ou la qualité des produits alimentaires, de stéroïdes, de drogues ou de produits ou sous-produits d'une réaction.
18. Procédé d'analyse d'au moins une molécule cible comprenant au moins une étape d'utilisation d'un kit tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 17.
19. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la (ou les) molécule(s) cible(s) est (sont) présente(s) dans une solution, et en particulier dans un milieu complexe ou à l'état de trace dans un échantillon.
20. Procédé d'analyse d'au moins une molécule cible susceptible d'être présente dans une solution selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : (i) une étape de mise en contact de ladite solution avec un premier polymère à empreintes moléculaires apte à interagir avec la (ou les) molécule(s) cible(s) dans des conditions adaptées à l'extraction de la (ou des) molécule(s) cible(s),
(ii) la formation d'une solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), à partir de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i), (iii) une étape de mise en contact de ladite solution purifiée et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s) avec un deuxième polymère à empreintes moléculaires, également apte à interagir avec la (ou les)dite(s) molécule(s) cible(s), et soit doté, dans tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des) molécule(s) cible(s) d'au moins un marqueur compétitif ou apte à être déplacé du (ou des)dit(s) site(s) de reconnaissance par la (ou les) molécule(s) cible(s) dans les conditions de réalisation de ladite étape (iii), soit constitué d'au moins un marqueur intrinsèque ou apte à interagir avec tout ou partie de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) lorsque celle(s)-ci interagi(ssen)t avec tout ou partie de ses sites de reconnaissance de la (ou des)dite(s) molécule(s) cible(s) et à émettre en conséquence un signal détectable et (iv) une étape de détection qualitative, quantitative et/ou semi-quantitative de la (ou des) molécule(s) cible(s), via la détection soit du marqueur compétitif ainsi déplacé, soit du signal ainsi émis par le marqueur intrinsèque.
21. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'étape (ii) est réalisée par mise en présence de la (ou des) molécule(s) cible(s) isolée(s) en étape (i) avec un milieu propice à la rupture de leur interaction avec le premier polymère à empreintes moléculaires.
22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel ladite solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), est directement mise en contact avec ledit deuxième polymère à empreintes moléculaires.
23. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel ladite solution purifiée, et éventuellement enrichie en molécule(s) cible(s), est traitée avant d'être mise en contact avec ledit deuxième polymère à empreintes moléculaires.
24. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel le premier et deuxième polymères à empreintes moléculaires et le marqueur sont tels que définis en revendications 2 à 8.
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