CN103267745A

CN103267745A - 一种内毒素mip-spr芯片、制备方法及其用途

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Publication number: CN103267745A
Application number: CN2013101504078A
Authority: CN
Inventors: 唐瑛; 吕斌; 张梦; 石云
Original assignee: Navy Medicine Research Institute of PLA
Current assignee: Navy Medicine Research Institute of PLA
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-04-26
Also published as: CN103267745B

Abstract

本发明涉及SPR传感检测和分子印迹技术领域，具体涉及一种内毒素MIP-SPR芯片、制备方法及其用途。本发明公开了一种内毒素MIP-SPR芯片，其特征在于SPR芯片的金膜表面具有一层以多巴胺为功能单体、以内毒素为模板分子的MIP膜。将本发明所制备的MIP-SPR芯片代替传统SPR芯片，应用于SPR仪，可实时监测生物和环境样品中的痕量内毒素。与传统SPR芯片中所用的天然多克隆抗体比较，MIP不仅可特异性结合靶分子，灵敏、准确、稳定地测定样品中的痕量内毒素，而且制备方法简单，化学性质稳定，易保存，并且可将废弃的SPR芯片经过简单的处理后再利用。

Description

一种内毒素MIP-SPR芯片、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及SPR传感检测和分子印迹技术领域，具体涉及一种内毒素MIP-SPR芯片、制备方法及其用途。

背景技术

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。内毒素广泛存在空气、土壤和水等环境介质中。人体对细菌内毒素极为敏感，极微量（1-5ng/kg体重）内毒素就能引起体温上升，产生内毒素休克，播散性血管内凝血等症状，严重威胁人群健康。因此，对生物和环境中的痕量内毒素进行实时监测对保障人类健康意义重大。

传统检测内毒素的标准方法为鲎试剂法。该方法的主要不足是检测结果易受样品本身的颜色及浊度影响，而且鲎为珍稀动物，鲎试剂较难获得。进而人们开始研究各种新的替代技术，如：罗氏蛋白染色法、荧光偏振法、同位素标记法、酶联免疫测定法（ELISA）等。应用较多的有ELISA，该方法检测的灵敏度低于鲎试剂法,而且ELISA中使用的天然抗体易失活，对检测条件要求较高，限制了其在环境样品中内毒素检测上的应用。因此，人们一直积极研究灵敏、快速、稳定的新方法，以提高检测内毒素的准确性和稳定性。

分子印迹技术是制备具有分子识别功能聚合物的一种技术，它将功能单体在模板分子（待测靶分子）存在时交联聚合，然后洗脱除去模板分子，即可得到在立体空间结构和功能基团排布上与模板分子互补的聚合物，又称为MIP，MIP可特异性识别靶分子。

SPR技术是近年快速发展的一种无需标记的直接检测技术。SPR芯片结合目标物后表面质量增加，表面介质的折射率发生改变，导致SPR共振角改变，通过观察共振角的改变量，即可实时、原位和动态测量芯片表面各种分子如小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖，以及病毒、细菌、细胞之间的相互作用过程，而且SPR检测需求样本量小（每次进样25-450μL），能高通量快速定性和定量测定分子间的相互作用。

传感芯片是SPR仪器应用的核心部件,但由于芯片表面修饰了不同的活性基团，需要密闭低温保存，保存期只有6个月，经过多次循环以后,表面偶联的分子容易失去活性或脱落,使芯片废弃。在进行免疫学检测时，传统SPR使用天然抗体，易失活，检测的耐受力也较差。对于一些小分子化合物，由于没有相应的天然抗体，无法运用传统SPR进行检测。而MIP特别适合用于小分子化合物的检测，它不仅具有类似于天然抗体对靶分子的特异性识别能力、高度亲和性及专一性，而且能耐受高温高压和强酸强碱，可置于室温长期保存。因此，将分子印迹技术与SPR有机结合成为当前研究的一个热点问题。

Wei等利用二苯甲酮光接枝聚合法合成了睾丸激素MIP-SPR芯片，结果表明该芯片对模板分子具有良好的吸附能力（Wei,Q;Wei，T.ChineseChemical Letters.2011,22:721-724.）。Zhou等利用光自由基聚合反应合成了乙酰甲胺磷MIP-SPR芯片，结果表明该芯片对模板分子具有特异性识别能力（Wei,C;Zhou,H;Zhou,J.Talanta.2011,83:1422-1427.）。Diltemiz等合成了鸟嘌呤核苷或鸟嘌呤MIP-SPR芯片，该芯片不仅可以特异性检测鸟嘌呤核苷和鸟嘌，还可以特异性分析目标DNA序列（S.Diltemiz,A.Denizli,R.Say,et.al.Chemical.2008,133:484-488.）。Sugimoto等合成了莠去津MIP-SPR芯片，实验结果表明对于检测莠去津，MIP与SPR传感器结合比MIP与其他传感器结合更为灵敏（N.Sugimoto,J.Matsui,M.Takayose,et.al.Analyst.2009,134:80-86.）。上述研究将MIP的选择性和稳定性与SPR快速，灵敏和高通量的优势进行有机结合，充分拓展了SPR技术在小分子化合物检测中的应用。但是目前尚无内毒素MIP-SPR芯片的报道，且上述研究中的MIP合成过程都比较繁琐，实验条件要求苛刻，需严格控制在无氧条件下进行，操作复杂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种内毒素MIP-SPR芯片，取代传统SPR检测过程中芯片表面活化和标记天然抗体的过程，直接、快速、灵敏、高通量地检测药品、环境样品中的痕量内毒素。

为解决的上述技术问题，本发明公开了一种内毒素MIP-SPR芯片，其特征在于SPR芯片的金膜表面具有一层以多巴胺为功能单体、以内毒素为模板分子的MIP膜；

在一些实施例中，所述内毒素-MIP膜印迹因子为2.27-4.15,其厚度为85nm，对内毒素的最大吸附容量为158.4ng/cm²；

另一方面，本发明还公开了所述内毒素MIP-SPR芯片的制备方法，包括以下步骤：

a)芯片金膜表面清洗；

b)聚合反应：在步骤a所得SPR芯片金膜表面，加入聚合反应液（内毒素与多巴胺按质量比为1:2-6的比例混合溶于pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液），在室温下反应24-72小时；

c)洗脱模板分子，得到内毒素MIP-SPR芯片。

所述步骤a芯片金膜表面清洗可以采用本领域常用的技术手段，在一些实施例中，所述步骤a为洗液除去SPR芯片金膜表面有机成分，然后用去离子水洗净，氮气吹干，其中洗液为98%硫酸和30%双氧水按7:3体积比的洗液。所述步骤b中聚合反应无需引发剂和交联剂，只需多巴胺在有氧条件下自引发聚合。

所述c)洗脱模板分子步骤可以采用本领域常用的技术手段，在一些实施例中，所述步骤c为使用洗脱液（含1-3%乙酸和0.1-1%SDS的水溶液）反复震荡洗涤步骤b所得SPR芯片金膜6次，每次40min，再使用三蒸水震荡洗涤6次，每次40min，

另一方面，本发明还公开了一种快速的内毒素检测方法，包括下列步骤：

a)样品的采集和处理；

b)所述内毒素MIP-SPR芯片装入SPR仪，上述样品溶液上机；

c)检测内毒素含量。

所述样品的处理为样品为固体、粉状或半固体状，加水溶解、过滤除杂；样品为溶液，过滤除杂。所述样品包括但不限于为细菌、水、食用品、药品或保健品等。

另一方面，本发明还公开了所述内毒素MIP-SPR芯片在检测内毒素方面的用途。

a)利用MIP-SPR法检测不同细菌所产内毒素含量；

b)利用MIP-SPR法检测自来水中的内毒素含量；

c)利用MIP-SPR法检测江水中的内毒素含量；

d)利用MIP-SPR法检测医院废水中的内毒素含量

本发明所述内毒素MIP具有稳定性好，对温度、pH、有机溶剂的耐受力强，制备方便的特点，能够克服天然抗体易失活，难于保存等缺陷，利用本发明所制备的内毒素MIP-SPR芯片，与SPR仪相结合，建立一种快速检测内毒素的新方法（MIP-SPR法），可直接、快速、灵敏、高通量地检测自来水、江水等环境样品中的痕量内毒素，特别适合用于大量生物和环境样品中内毒素的快速检测。众所周知，标准方法（鲎试剂法）检测内毒素的灵敏度高（0.01-1ng/mL），而本发明所建立的新方法（MIP-SPR法）可达到鲎试剂法的灵敏度，而且环境样品经简单离心后即可直接检测。MIP-SPR法具有快速、灵敏、高通量等优点，可用于生物和环境中痕量内毒素的实时监测。

附图说明

图1为本发明所制备的MIP的FT-IR图谱。

图2为本发明所建立的MIP-SPR法检测内毒素的响应曲线。

图3为本发明所建立的MIP-SPR法检测内毒素浓度的标准曲线。

图4为本发明所建立的MIP-SPR法检测各种水样品的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

下文中，“MIP-SPR”和“内毒素MIP-SPR”为等同概念。所有试剂均为市售。

实施例1：内毒素MIP-SPR芯片的制备

MIP-SPR芯片的制备是在清洗后的SPR芯片的金膜表面，以多巴胺为功能单体，内毒素为模板分子，通过多巴胺氧化聚合反应及模板分子洗脱过程得到MIP-SPR芯片。具体方法包括以下步骤：

一芯片表面清洗：将98%硫酸和30%双氧水按7:3比例配置洗液，将回收的废弃SPR芯片置于洗液中浸泡4h以除去芯片表面所有有机成分，然后用去离子水洗净，氮气吹干，得到表面为纯金膜的空白SPR芯片。

二聚合反应：在步骤a所得SPR芯片金膜表面，加入聚合反应液（内毒素与多巴胺按质量比为1:2-6的比例混合溶于pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液），在室温下反应24-72小时，得到含模板分子的聚合物。

三洗脱模板分子：先使用洗液（含1-3%乙酸和0.1-1%SDS的水溶液）反复震荡洗涤含模板分子的聚合物6次，每次40min，再使用三蒸水震荡洗涤6次，每次40min，洗脱模板分子得到MIP-SPR芯片。

实施例2：内毒素MIP-SPR芯片的性能分析

通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实了本发明制备的MIP-SPR芯片表面确实是含多巴胺分子的MIP（图1）。从图1可以看出，本发明所制得的产物在3100，1600，1000，880和650厘米^-1处具有5个明显的红外吸收峰，分别代表C-H的伸缩振动，芳烃的骨架振动，N-H的面外弯曲振动，C-H的的面外弯曲振动以及O-H的面外弯曲振动，与多巴胺的特征峰一致，证明本发明在SPR芯片的金膜表面制备了含多巴胺分子的MIP。

将表面含MIP的芯片进行扫描电镜观察。结果显示，所制得的MIP为均一的高分子膜状物，厚度为85nm。

按照上述实施例1中MIP-SPR芯片的制备方法，在步骤二中以Tris-HCl缓冲溶液代替模板分子内毒素，制备NIP-SPR芯片。将内毒素MIP-SPR芯片和NIP-SPR芯片分别装入SPR仪，在饱和结合模式下，使系列浓度梯度的内毒素标准品（0.1-500ng/mL）流过芯片，得到不同浓度内毒素的响应曲线，吸附平衡曲线。通过数据分析得到MIP-SPR芯片和NIP-SPR芯片对内毒素的结合平衡常数K_a（K_aMIP=1.04*10⁵M^-1s^-1～2.36*10⁶M^-1s^-1,K_aNIP=1.25*10²M^-1s^-1～3.18*10³M^-1s^-1）,解离平衡常数K_d（K_dMIP=2.11*10^-4s^-1～4.26*10^-5s^-1,K_dNIP=1.01*10^-2s^-1～5.94*10^-2s^-1）及结合解离常数K_D值（K_D=K_d/K_a,K_DMIP=2.02*10^-9M～1.81*10^-11M,K_DNIP=8.08*10^-3M～1.86*10^-5M）。根据公式RU=RU_max/(1+K_D/[内毒素])（RU值为SPR仪产生的响应值）计算得到内毒素与MIP-SPR芯片表面结合所产生的最大响应值RU_max为1584，确定了本发明制备的MIP-SPR芯片对内毒素的最大吸附容量为158.4ng/cm²（10RU=1ng/cm²）；根据公式I=pK_DMIP/pK_DNIP(pK_D=-lgK_D)确定了本发明制备的MIP-SPR芯片对内毒素的印迹因子为2.27-4.15。

实施例3：MIP-SPR法的灵敏度分析

使系列浓度梯度的内毒素标准品（0.01,0.1，1，10,100ng/mL）流过实施例1所述MIP-SPR芯片，内毒素与MIP-SPR芯片结合引起芯片表面介质的折射率改变，SPR的共振角随之变化，监测SPR仪产生的响应值（RU）。从图2可以看出，随着内毒素的浓度升高，RU值增强，RU的增强水平与所结合的内毒素浓度成正比，ΔRU与内毒素浓度在0.01ng/mL～100ng/mL范围内存在线性关系，检测的灵敏度为0.01ng/mL。同时使用SPR仪标准操作方法，将兔抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体固定在SPR芯片上，以多克隆抗体-SPR芯片作为传统SPR方法所用芯片，检测相同系列浓度梯度的内毒素标准品。利用多克隆抗体的传统SPR检测的灵敏度为0.01ng/mL，检测的线性范围为0.01ng/mL～100ng/mL。MIP-SPR和传统SPR两种方法检测的灵敏度相同，说明MIP-SPR芯片可以取代传统SPR检测过程中芯片表面活化和标记天然抗体的过程，直接用于环境和生物等实际样品中内毒素的实时监测。

实施例4：MIP-SPR法的稳定性分析

将不同浓度的内毒素标准品（10，20，40ng/mL）分别加入到自来水样品中，按实施案例1所建立的MIP-SPR法和传统SPR法检测未加标和加标的自来水样品中的内毒素含量。MIP-SPR法检测内毒素的加标回收率在86.9%～91.6%，日内偏差为2.6～4.7%，日间偏差为3.1～4.8%，日内和日间偏差均小于5%（n=6）。传统SPR法检测内毒素的加标回收率在63.2%～75.1%，日内偏差为6.4～10.2%，日间偏差为7.3～11.4%，日内和日间偏差均大于5%（n=6）。说明MIP-SPR法比利用多克隆抗体的传统SPR法具有更好的稳定性。

实施例5：MIP-SPR法的特异性分析

测定各种细菌所产生的内毒素含量,分析MIP-SPR法检测的特异性。培养3种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、明亮发光杆菌、绿脓杆菌)，以及1种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)。将4种细菌菌液在沸水中煮2.5h灭活，使细菌中的内毒素失活释放出来，并将菌液浓度稀释为10³cfu/mL。按实施案例1所建立的MIP-SPR法、传统SPR法和标准方法（鲎试剂法，定量鲎试剂，厦门市鲎试剂实验厂有限公司）测定各种细菌裂解液中的内毒素含量。MIP-SPR法测定的革兰氏阴性菌——大肠杆菌、明亮发光杆菌和绿脓杆菌中的内毒素浓度分别为0.86±0.18ng/mL，0.73±0.13ng/mL，1.22±0.08ng/mL，金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）的检测结果为阴性。传统SPR法的相应测定浓度分别为0.52±0.11ng/mL，0.46±0.17ng/mL，0.83±0.15ng/mL和阴性结果。标准方法（鲎试剂法）的相应测定浓度分别为0.91±0.21ng/mL，1.09±0.15ng/mL，1.01±0.25ng/mL和阴性结果。MIP-SPR法与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相当（p>0.05），传统SPR法的测定结果则偏低（p<0.05）。以标准方法（鲎试剂法）的测定结果作为参照，MIP-SPR法的测定结果比传统SPR法的测定结果更为准确（图3）。MIP-SPR法可以准确检测革兰氏阴性菌产生的内毒素。

实施例6：利用MIP-SPR法检测自来水中的内毒素含量

按实施案例1所建立的MIP-SPR法测定自来水中的内毒素含量，并与传统SPR法和标准方法（鲎试剂法）进行比较。MIP-SPR法的检测结果为14.8±1.9ng/mL，标准方法（鲎试剂法）的检测结果为16.5±2.7ng/mL，传统SPR法的检测结果为10.6±3.5ng/mL。MIP-SPR法与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相当（p>0.05），传统SPR法与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相差较大（p<0.05），MIP-SPR法可准确测定自来水中的内毒素含量（图4）。

实施例7：利用MIP-SPR法检测江水中的内毒素含量

将所采集的江水（武汉长江）静置于容器内，使其自然沉降24h以去除大颗粒及悬浮物，按实施案例1所建立的MIP-SPR法测定江水中的内毒素含量，并与传统SPR法和标准方法（鲎试剂法）进行比较。MIP-SPR法的检测结果为50.1±2.2ng/mL，标准方法（鲎试剂法）的检测结果为48.3±3.6ng/mL，传统SPR法的检测结果为44.9±5.4ng/mL。MIP-SPR法与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相当（p>0.05），传统SPR法与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相差较大（p<0.05），MIP-SPR法可准确测定江水中的内毒素含量（图4）。

实施例8：利用MIP-SPR法检测医院废水中的内毒素含量

将在医院污水排放口采集的水样静置于敞口的容器内，使其暴露于空气中24h以除去氯气，按实施案例1所建立的MIP-SPR法测定医院污水中的内毒素含量，并与传统SPR法和标准方法（鲎试剂法）进行比较。MIP-SPR法的检测结果为96.6±2.8ng/mL，标准方法（鲎试剂法）的检测结果为102.6±3.5ng/mL，传统SPR法的检测结果为79.6±6.2ng/mL。MIP-SPR法与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相当（p>0.05），传统SPR法与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相差较大（p<0.05），MIP-SPR法可准确测定医院废水中的内毒素含量（图4）。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.一种内毒素MIP-SPR芯片，其特征在于SPR芯片的金膜表面具有一层以多巴胺为功能单体、以内毒素为模板分子的MIP膜。

2.如权利要求1所述内毒素MIP-SPR芯片，其特征在于所述MIP膜印迹因子为2.27-4.15。

3.如权利要求1所述内毒素MIP-SPR芯片，其特征在于所述MIP膜厚度为85nm，对内毒素的最大吸附容量为158.4ng/cm²。

4.权利要求1所述内毒素MIP-SPR芯片的制备方法，包括以下步骤：

a)芯片金膜表面清洗；

b)聚合反应：在步骤a所得SPR芯片金膜表面，加入内毒素与多巴胺按质量比为1:2-6的比例混合溶于pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液，在室温下反应24-72小时；

c)洗脱模板分子，得到内毒素MIP-SPR芯片。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤a为洗液除去SPR芯片金膜表面有机成分，然后用去离子水洗净，氮气吹干。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤a中洗液为98%硫酸和30%双氧水按7:3体积比所配制的洗液。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤c为使用含1-3%乙酸和0.1-1%SDS的水溶液反复震荡洗涤步骤b所得SPR芯片金膜6次，每次40min，再使用三蒸水震荡洗涤6次，每次40min。

8.一种快速的内毒素检测方法，包括下列步骤：

a)样品的采集和处理；

b)权利要求1所述内毒素MIP-SPR芯片装入SPR仪，上述样品溶液上机；

c)检测内毒素含量。

9.如权利要求8所述的内毒素检测方法，其特征在于所述样品为细菌、水、食用品、药品或保健品。

10.权利要求1所述内毒素MIP-SPR芯片在检测内毒素方面的用途。