CN101881768A - 一种采用mit技术与spr技术相结合检测克伦特罗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用MIT技术与SPR技术相结合检测克伦特罗的方法，属于克伦特罗检测领域。本发明的方法首先利用热聚合方法在金膜基底上制备克伦特罗分子印迹聚合物膜，用洗脱液除去模板分子，得到克伦特罗分子印迹传感芯片；然后计算不同浓度的克伦特罗标准溶液与传感芯片反应后与吸附前引起的SPR共振角的位移值Δθ，建立Δθ与克伦特罗标准溶液浓度值的负对数的标准曲线；最后根据待测样品与传感芯片发生吸附反应前后引起SPR共振角的位移值Δθ，在标准曲线上读出对应的克伦特罗含量；本发明的方法具有抗恶劣环境、选择性高、响应快速，操作简便的特点，不仅提高了方法的灵敏度和检测限，也相应地降低了检测成本。且对与克伦特罗具有相似结构的沙丁胺醇几乎没有吸附。

Description

一种采用MIT技术与SPR技术相结合检测克伦特罗的方法

技术领域

本发明涉及一种采用MIT技术与SPR技术相结合检测克伦特罗的方法，属于克伦特罗检测领域。

背景技术

克伦特罗(Clenbuterol，CL)又称克喘素，是一种β-肾上腺素激动剂(简称β-兴奋剂)，医学上常用于治疗哮喘。具有促进动物生长、降低脂肪含量、提高瘦肉率的作用，因而常被用于饲料添加剂，俗称瘦肉精。它会在动物组织中形成残留，人食用了含有克伦特罗的猪肉后会引起中毒，通常会出现肌肉震颤、心悸、精神紧张、恶心、头晕等症状。我国政府于1997年明令禁止盐酸克伦特罗作饲料添加剂。但近年来因食用市售猪、禽肉和内脏而导致盐酸克伦特罗中毒的事件时有发生，因此CL的快速、现场、定量检测有着非常重要的意义。

目前对克伦特罗进行检测的手段或方法较多，但这些方法都需要对样品进行预处理，需要用大量的有机溶剂，存在严重的基体干扰且需要专门技术人员和大规模昂贵仪器，不适合现场快速检测的需要，而且有些方法还存在重现性不好或样品制备周期过长等问题。在此背景下，国内外法庭科学工作者积极开发新的检测技术和样品预处理方法，分子印迹技术从此得到应用。采用分子印迹技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广、成本便宜等特点，近年来在药品检测中的应用逐渐展开，并显示出广阔的前景。

分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology，MIT)是模拟自然界所存在的分子识别作用，如酶与底物、抗体与抗原等，制备对某一特定目标分子具有特异选择性的聚合物，即分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)的过程。它是通过以下方法来实现的：以特定目标分子为模板，将具有结构互补的功能单体通过共价键或非共价键与模板分子相结合，在一定的溶液中利用交联剂使功能单体聚合，从而在模板分子周围形成高度交联的具有一定刚性的高分子聚合物。反应完成后设法将模板分子从聚合物中去除，聚合物的内部就形成了与模板分子在空间位置和结合位点完全匹配的结构。印迹分子去除后留下的孔穴与印迹分子在空间结构、大小、电荷等方面都具有非常好的互补性，因而这种聚合物具有特异性识别印迹分子的功能。该技术是近年来发展起来的一种合成对某一特定分子(印迹分子)具有选择性的聚合物的方法，已成为高分子聚合物中储藏分子信息的有效手段，可以使聚合物在分子水平(层次)上对特定物质进行识别。分子印迹聚合物膜正是研制传感器关键器件的最佳选择。分子印迹聚合物膜具有操作简便，耗能少，反应时间短，干净无污染，识别性能高，稳定性好等特点。同生物膜相比，又具有耐恶劣环境、稳定性高、易于处理和应用的优点。

目前，测定克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和免疫分析法等。但这些技术操作繁琐而且费用高，不易用于样品筛选的快速检测。免疫学分析方法特别是ELISA法，具有选择性好、灵敏性高和操作方便等优点，是目前克伦特罗残留快速检测的主要方法。但是，以ELISA法制作的检测克伦特罗试剂盒价格比较昂贵，贮藏条件苛刻，假阳性比较高，限制了它的进一步使用^[1]。这就要求有更新颖的快速检测技术出现。表面等离子体共振传感技术(SPR)是一种在线、快捷、定量及无需标定的分析技术，它的前处理简单，已成为药品检测中的前沿性技术。

表面等离子体波共振(surface plasmon resonance，SPR)是存在于金和电介质界面上的电荷密度振动谐振波，能被入射电磁波所激发。当入射光从光密介质向光疏介质传播且入射角度在适当的范围时，在两种物质的界面处将发生全内反射。如果入射光的波矢量沿着平行交界面的分量与表面等离子的波矢量相等，可共振激发表面等离子体波(surface plasmon wave，SPW)。此时一部分入射光的能量被耦合进表面等离子体波内。电场强度随入射深度呈指数衰减形成消逝波，在光疏介质中消逝波的有效穿透深度一般为100～200nm。SPW对界面介质折射率的微小变化极其敏感。当样品与界面接触时，由于存在吸附或化学反应，界面处介质折射率将会发生变化。基于此原理我们可以通过探测表面等离子体波的状态而高灵敏度地了解界面的物理和化学吸附过程。近十几年来基于SPR原理的传感器及其应用研究获得了长足的发展。与常规检测技术相比，SPR传感器具有高灵敏度、响应快、体积小、机械强度大、检测过程快捷、能够获得实时数据、操作方便、无须标记、可保持分子的生物活性、抗电磁干扰能力强和光纤相连可实现数据的远程采集和连续在线监控等突出优点。因此，SPR传感器在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测、环境监测、毒品检测、法医鉴定等领域具有广泛的应用需求。

目前国内对克伦特罗分子印迹方面的报道还很少，并且还没有将MIT与SPR联用来检测克伦特罗的报道。因此研究基于分子印迹和SPR联用技术提高克伦特罗的检测效率和识别性具有较为重要的现实意义。

发明内容

本发明是为了解决现有的技术在检测克伦特罗时存在对检测环境要求苛刻、造价昂贵、选择性较差等问题，提供一种采用MIT技术与SPR技术相结合检测克伦特罗的方法。

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明首先利用热聚合方法在金膜基底上制备克伦特罗分子印迹聚合物膜，对该聚合物膜进行洗脱得到克伦特罗分子印迹芯片；以该芯片作为表面等离子体共振传感器的传感芯片用于光学传感器对克伦特罗分子实现特异性、高灵敏度识别功能。

本发明的一种采用MIT技术与SPR技术相结合检测克伦特罗的方法，其具体步骤如下：

1)首先在光学盖玻片上通过真空蒸镀法或溅射法镀上一层20～100nm的金膜，以此作为金膜基底；

2)将功能单体与克伦特罗分子溶解在溶剂中，超声5～10min，预聚合1-5h；

3)向第2)步得到的反应液中加入交联剂和引发剂，超声5～10min后通氮气除氧5～10min；

4)用乙醇淋洗硅烷化载玻片，并用氮气吹干，再用封口膜紧粘在硅烷化载玻片的表面，然后在封口膜的中间区域加工出空白区域，作为成膜区域，得到附有支撑膜的硅烷化载玻片，载玻片上剩余的封口膜作为支撑膜；

5)取第3)步得到的反应液滴加到附有支撑膜的硅烷化载玻片上，使反应液充满成膜区域，盖上金膜基底并夹紧固定使二者中间没有气泡，放入密闭反应器中，在氮气保护下，55～70℃温度下加热反应3.5～24小时；

6)加热结束后将载玻片与金膜基底分开，分子印迹聚合物膜附着在金膜基底上，晾干后用洗脱液进行洗脱金膜基底的分子印迹聚合物膜，得到克伦特罗分子传感印迹芯片；

7)将第6)步制备的克伦特罗分子印迹传感芯片固定在表面等离子体共振检测仪上，将溶剂流过传感芯片，待仪器显示反射光强达到稳定不变时，对反射光强按角度进行扫描，记录下SPR光谱图；

8)将克伦特罗固体加入溶剂定容，制备不同浓度的克伦特罗标准溶液，按照由低浓度到高浓度的顺序，分别流过传感芯片；每次流入克伦特罗标准液时与传感芯片反应1-15min，待仪器显示反射光强达到稳定不变，然后流过溶剂，待仪器显示反射光强再次达到稳定不变时，对反射光强按角度进行扫描，记录下此浓度的克伦特罗标准液与传感芯片发生吸附反应后的SPR光谱图，直到得到各个浓度的克伦特罗标准溶液与传感芯片反应后的SPR光谱图；

9)分别将第8)步得到的不同浓度的克伦特罗标准溶液与传感芯片反应后的SPR光谱图与第7)步得到吸附克伦特罗标准溶液前的SPR光谱图进行比较，计算各浓度下吸附反应前后引起的SPR共振角的位移值Δθ；

10)以SPR共振角的位移值Δθ为纵坐标，以加入的克伦特罗标准溶液浓度值的负对数作为横坐标绘制标准曲线；

11)根据待测样品与洗脱后的克伦特罗分子传感印迹芯片发生吸附反应前后引起SPR共振角的位移值Δθ，在第10)步得到的标准曲线上读出对应的克伦特罗含量；

其中，克伦特罗分子与功能单体及交联剂之间的摩尔比为1∶2～10∶4～20；引发剂与克伦特罗分子之间的摩尔比为1∶2～8；

所述的功能单体选自如下任意一种化合物：丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、亚甲基丁二酸；

所述的溶剂选自如下任意一种或两种化合物：二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、砜类化合物或杂环类化合物；

所述的引发剂选自下列任意一种化合物：偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、2，2-偶氮-双(2，4-二甲基戊腈)或过氧化苯甲酰；

所述的交联剂选自如下任意一种化合物：乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸醋或二乙烯基苯；

所述的洗脱液为乙酸与有机溶剂按1∶1～50的体积比混合，或水、乙酸与有机溶剂的体积比为1∶1～10∶1～500；有机溶剂为甲醇或乙腈。

有益效果：

(1)该方法检测限高，线性范围较宽。检测限为1×10^-17M，线性范围为1.0×10^-17M～1.0×10^-11M。线性相关系数为0.9967。

(2)操作简便，可以直接测定样品中的克伦特罗含量，避免了间接检测的繁琐步骤。

(3)结构稳定，选择性高，专一性强，能有效识别克伦特罗和沙丁胺醇中的克伦特罗，实现快速检测和分析，是一种十分方便快捷的检测方法。

(4)物理化学性质稳定，抗恶劣环境，能够在高温、高压、酸、碱和有机溶剂中实现对克伦特罗的检测，不易被生物降解破坏。

(5)制备方法简单，灵敏度高，检测成本低，耗能少，反应时间短，干净无污染，易于推广。

附图说明

图1是本发明实施例得到的洗脱前后及吸附各浓度克伦特罗溶液后的SPR光谱图；

图2是本发明实施例得到的洗脱前后及吸附各浓度克伦特罗溶液后的SPR光谱共振角处放大图；

图3是本发明实施例中标准曲线图。

图4是克伦特罗分子印迹传感芯片吸附各浓度的克伦特罗溶液及沙丁胺醇溶液的吸附动力学图。

具体实施方式

实施例

(1)首先在光学盖玻片上通过真空蒸镀法镀上一层47nm厚的金膜，以此作为金膜基底。

(2)将提纯后的克伦特罗溶于乙腈中，配成0.05mol/L的溶液，吸取0.36mL该溶液于小瓶中，再加入乙腈，配成0.02mol/L的溶液。再加入5μL甲基丙烯酸，超声10min后，静置3h。

(3)向上述装有混合液的小瓶中加入27.5μL交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.80mg的引发剂偶氮二异丁腈，超声10min，通氮气除氧5min；

(4)用乙醇淋洗硅烷化载玻片，并用氮气吹干，再用封口膜紧粘在硅烷化载玻片的表面，然后在封口膜的中间区域加工出空白区域，作为成膜区域，得到附有支撑膜的硅烷化载玻片，载玻片上剩余的封口膜作为支撑膜；

(5)取第(3)步得到的反应液滴加到附有支撑膜的硅烷化载玻片上，使反应液充满成膜区域，盖上金膜基底，并用夹子将二者夹紧使二者中间没有气泡，放入密闭反应器中，在氮气保护下于60℃水浴中加热反应6h。

(6)加热结束后将载玻片与金膜基底分开，分子印迹聚合物膜附着在金膜基底上，晾干，即可在金膜基底上得到克伦特罗聚合物膜；

(7)将第(6)步制备的金膜基底固定在表面等离子体共振检测仪上，用蠕动泵向池中缓慢注入乙腈溶剂，使之流过芯片表面，待仪器显示反射光强达到稳定不变时，对反射光强按角度进行扫描，记录下SPR光谱图。此时为洗脱前的SPR谱图，并记录下洗脱前的共振角大小。

(8)向流通池中依次注入体积比为9∶1和8∶2的乙腈和乙酸的混合液除去克伦特罗聚合物膜中的克伦特罗分子，得到克伦特罗分子印迹传感芯片。待仪器显示反射光强达到稳定不变时则表示洗脱完毕，对反射光强按角度进行扫描，得到SPR光谱图。此时为洗脱后的SPR谱图，并记录下洗脱后的共振角大小。

(9)将克伦特罗固体加入乙腈溶液定容，配置克伦特罗标准溶液，浓度依次为1.0×10^-17mol/L、1.0×10^-15mol/L、1.0×10^-13mol/L和1.0×10^-11mol/L；按照浓度由小到大依次流过该芯片表面，每次流入克伦特罗标准液时与传感芯片反应10min，待仪器显示反射光强达到稳定不变，再注入乙腈溶液，待仪器显示反射光强再次达到稳定不变时，对反射光强按角度进行扫描，记录下此浓度的克伦特罗标准液与传感芯片发生吸附反应后的SPR光谱图，并记录下该浓度标准液的SPR谱图的共振角大小，直到得到各个浓度的克伦特罗标准溶液与传感芯片反应后的SPR光谱图，如图1所示，并分别记录下各浓度克伦特罗溶液的SPR谱图的共振角大小。

(10)分别将第(9)步得到的不同浓度的克伦特罗标准溶液与传感芯片反应后的SPR光谱图与第(8)步得到的吸附克伦特罗标准溶液前的SPR光谱图进行比较，计算各浓度下吸附反应前后引起的SPR共振角的位移值Δθ；

(11)以SPR共振角的位移值Δθ为纵坐标，以加入的克伦特罗标准溶液浓度值的负对数作为横坐标绘制标准曲线，如图3所示；

(12)根据待测样品与洗脱后的克伦特罗分子印迹芯片发生吸附反应前后引起SPR共振角的位移值Δθ，在第(11)步得到的标准曲线上读出对应克伦特罗的含量。

选择识别性验证：将吸附饱和后的传感芯片，重新进行洗脱，然后注入1.0×10^-6mol/L沙丁胺醇标准液，按时间进行扫描，记录其吸附情况，如图4所示，该传感芯片对1.0×10^-6mol/L沙丁胺醇标准液几乎没有吸附。

Claims (1)

1.一种采用MIT技术与SPR技术相结合检测克伦特罗的方法，其特征在于具体步骤如下：

1)首先在光学盖玻片上通过真空蒸镀法或溅射法镀上一层20～100nm的金膜，以此作为金膜基底；

2)将功能单体与克伦特罗溶解在溶剂中，预聚合1-5h；

3)向第2)步得到的反应液中加入交联剂和引发剂，超声5～10min后通氮气除氧5～10min；

4)用乙醇淋洗硅烷化载玻片，并用氮气吹干，再用封口膜紧粘在硅烷化载玻片的表面，然后在封口膜的中间区域加工出空白区域，作为成膜区域，得到附有支撑膜的硅烷化载玻片，载玻片上剩余的封口膜作为支撑膜；

5)取第3)步得到的反应液滴加到附有支撑膜的硅烷化载玻片上，使反应液充满成膜区域，盖上金膜基底并夹紧固定使二者中间没有气泡，放入密闭反应器中，在氮气保护下，55～70℃温度下加热反应3.5～24小时；

6)加热结束后将载玻片与金膜基底分开，分子印迹聚合物膜附着在金膜基底上，晾干后用洗脱液进行洗脱金膜基底的分子印迹聚合物膜，得到克伦特罗分子传感印迹芯片；

7)将第6)步制备的克伦特罗分子印迹传感芯片固定在表面等离子体共振检测仪上，将溶剂流过传感芯片，待仪器显示反射光强达到稳定不变时，对反射光强按角度进行扫描，记录下SPR光谱图；

8)将克伦特罗固体加入溶剂定容，制备不同浓度的克伦特罗标准溶液，按照由低浓度到高浓度的顺序，分别流过传感芯片；每次流入克伦特罗标准液时与传感芯片反应1-15min，然后流过溶剂，对反射光强按角度进行扫描，记录下此浓度的克伦特罗标准液与传感芯片发生吸附反应后的SPR光谱图，直到得到各个浓度的克伦特罗标准溶液与传感芯片反应后的SPR光谱图；

9)分别将第8)步得到的不同浓度的克伦特罗标准溶液与传感芯片反应后的SPR光谱图与第7)步得到吸附克伦特罗标准溶液前的SPR光谱图进行比较，计算各浓度下吸附反应前后引起的SPR共振角的位移值Δθ；

10)以SPR共振角的位移值Δθ为纵坐标，以加入的克伦特罗标准溶液浓度值的负对数作为横坐标绘制标准曲线；

11)根据待测样品与洗脱后的克伦特罗分子印迹芯片发生吸附反应前后引起SPR共振角的位移值Δθ，在第10)步得到的标准曲线上读出对于克伦特罗的含量；

其中，克伦特罗与功能单体及交联剂之间的摩尔比为1∶2～10∶4～20；引发剂与克伦特罗之间的摩尔比为1∶2～8；

所述的功能单体选自如下任意一种化合物：丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、亚甲基丁二酸；

所述的溶剂选自如下任意一种或两种化合物：二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、砜类化合物或杂环类化合物；

所述的引发剂选自下列任意一种化合物：偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、2，2-偶氮-双(2，4-二甲基戊腈)或过氧化苯甲酰；

所述的交联剂选自如下任意一种化合物：乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸醋或二乙烯基苯；

所述的洗脱液为乙酸与有机溶剂按1∶1～50的体积比混合，或水、乙酸与有机溶剂的体积比为1∶1～10∶1～500；所述的有机溶剂为甲醇或乙腈。

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