CN103688172A - 分子模板及其制造方法 - Google Patents

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赤松直俊
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Abstract

本发明的化学物质检测方法以及检测装置，通过利用分子模板制作的捕捉体将化学物质捕捉，从而进行检测。本发明提供良好的化学传感器，其对于医疗相关人员(医生、临床检查技术人员、护士)当然是使用方便的，即使对于家庭的一般消费者而言也是使用方便的。本发明的目的在于，特别是，通过高灵敏度地检测与应激疾病紧密相关的皮质醇等甾类激素，从而在早期诊断应激疾病的预兆，对预防和早期治疗作出贡献。本发明提供一种分子模板，其为甾类激素的分子模板，由与前述甾类激素相互作用的聚合物形成。聚合物优选包含：在聚合单元中具有2个以上的与甾类激素相互作用的官能团。

Description

分子模板及其制造方法
技术领域
本发明涉及分子模板及其制造方法、以及使用了该分子模板的化学物质检测装置以及化学物质检测方法。
背景技术
在临床检查、环境、卫生、防灾等领域中要进行管理的化学物质涉及非常多的方面，其种类也极其多。例如列举出：作为应激疾病标志的激素分子、环境激素问题中的内分泌干扰物、工厂旧址的土壤污染物质、由建筑资材产生的石棉、由食品、容器或者它们的制造装置产生的导致异臭、异味的化学物质等。这样的化学物质大多数是低分子，通常在测定物中仅包含极其微量。但是，迅速地并且高灵敏度地检测这些化学物质，这在确保各领域中的安全性等方面是极其重要的作业。
关于目前的测定技术，通过将高度地精炼了的分离技术、浓缩技术、分析方法进行选择与组合等，从而即使是ppt(1万亿分之一)水平以下也可进行各种各样的化学物质的分析。在这样微量的水平的分析的情况下，通常必须经过满足于检测对象物的最适合的分离、浓缩、定性分析、以及定量分析等各工序。这就必然需要投入很大的劳力、很多的时间以及高的分析成本。因此，这样的需要复杂多个的工序的分析技术是特殊化作为研究室内的测定方法的分析技术，不适合作为测定现场的方法。
测定现场所要求的是可将化学物质在其场所进行检测的测定方法。关于传感器技术，基于这样的需求而发展了与分析技术不同的技术。在传感器技术中，可简易且迅速地将化学物质进行检测、监测，此外也容易使测定装置小型化。
另一方面，目前的传感器技术没有如分析技术那样达到可以以高灵敏度进行分子的组成解析的水平。然而，关于在前述的各领域中成为检测对象的化学物质，一般是从甚至连是否存在于测定物中也不清楚的状态出发。另外，纵使存在，则其量通常也是极其微量的。因此，在测定上必需组合浓缩、分离，但是经由这样的工序的测定方法恰恰是研究室内的分析方法，如前述那样不适应作为测定现场的方法。另外，如前述那样在目前的传感器技术的分析能力中，存在有无法在技术上应对这样的问题。
本发明人等为了解决前述问题而着眼于分子模板技术。即，本发明人开发一种通过选择性捕捉化学物质从而不需要浓缩、分离的工序来对目标的化学物质进行检测的传感器技术。
作为本技术领域的背景技术，列举出专利文献1。在该文献中记载了，“用于对液体样品中的包含小分子、多肽、蛋白质、细胞以及感染症作用物质在内的靶向分子进行高速且简易的定量的设备、方法以及试剂盒(kit)可对流体样品中的这些实体进行实时计量，可实现高的选择性、高的灵敏度、简单的操作性、低成本以及可携带性。设备、方法以及试剂盒又在至少几个实施例中，在贯流或侧流设备中提供MIP的应用”(参照摘要)。该文献中记述的MIP是指分子模板聚合物(molecularly imprinted polymer)，根据想要捕捉的化学物质而合成的方法为人们所广泛知晓。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2009/083975
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供：用于将检测对象的化学物质进行捕捉的分子模板及其制造方法，以及使用该分子模板而迅速地、高灵敏度地、且低成本地识别该化学物质的化学物质检测方法以及检测装置。本发明的其它的课题在于提供：可以以超高灵敏度检测前述检测对象的化学物质的化学物质检测方法以及检测装置。
即，关于本发明的化学物质检测方法以及检测装置，通过利用分子模板制作的捕捉体将化学物质捕捉从而进行检测。本发明提供良好的化学传感器，其对于医疗相关人员(医生、临床检查技术人员、护士)当然是使用方便的，即使对于家庭的一般消费者而言也是使用方便的。其目的在于，特别是，通过高灵敏度地检测与应激疾病紧密相关的皮质醇等甾类激素，从而在早期诊断应激疾病的预兆，对预防和早期治疗作出贡献。
用于解决课题的方法
为了迅速、廉价、高灵敏度地检测皮质醇等甾类激素，通过合成对应于甾类激素的分子模板聚合物(MIP)，从而解决上述课题。具体而言，采用例如权利要求书中记载的构成。本申请含有多种解决上述课题的方法，如果列举其一个例子，那么列举出本发明的分子模板，其特征在于，“其为甾类激素的分子模板，由与前述甾类激素相互作用的聚合物形成”。
MIP的合成原理自1950年代前后起为人们所知，但是需要周密地研究对应于想捕捉的化学物质(靶)的合成原料、合成路径、反应时间、反应温度。因此，关于上述专利文献1中列举的那样的利用了MIP的设备结构，在原理上可进行提案，但是实际上为了制作高灵敏度地捕捉靶的MIP，需要进行周密的设计和合成、精制。
关于通过分子印迹制作的分子模板，可通过使用各种各样的基质而构建。本发明人等发现了针对于与应激疾病紧密相关的皮质醇或其衍生物等甾类激素分子的在分子印迹中使用的聚合物。
关于本发明中的聚合物，从网眼结构具有适度的柔软性，并且根据溶剂、环境而溶胀、收缩的观点考虑，适于作为在甾类激素的印迹中使用的基质。即，需要使利用模板分子形成的模板聚合物内的识别部位成为接近模板分子的尺寸。在其另一方面，为了在聚合后去除模板分子，或者为了使化学物质(靶)再结合于识别部位，按照可使分子转移到网眼结构内的方式，需要某种程度大的空间。发现了满足这样的相反的条件的聚合物材料及其合成条件。特别是，皮质醇等甾类激素具有甾体骨架，因而分子是刚性的，且具有羟基等，因此可形成在分子印迹之时所必需的与原料单体的相互作用。特别是在本发明中，通过使原料单体的一部分使用可在二个部位与皮质醇等进行相互作用的二羧酸衍生物，从而谋求合成出可实现高效率的捕捉的分子模板。
另外，关于本发明的化学物质检测方法，通过按照增强所捕捉到的甾类激素的检测灵敏度的方式构成，从而获得高灵敏度的检测能力。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2011-217179号的说明书和/或附图中记载的内容。
发明的效果
根据本发明的化学物质检测方法以及检测装置，通过利用由特定的聚合物形成的分子模板，从而可在不需要浓缩工序、分离工序的状态下将要检测的甾类激素选择性地检测。
另外，根据本发明的化学物质检测装置，可实现与最重要的传感器部分相当的分子捕捉部的小型化，因而可提供具有便携性的化学物质检测装置。
附图说明
图1是示意性地表示分子模板的制造方法的图。
图2是用于说明化学物质检测装置的构成的概念图。
图3是表示分子模板的合成路线的图。
图4A是表示皮质醇的分子结构的图。
图4B是表示衣康酸的分子结构的图。
图5是示意性地表示皮质醇与衣康酸的相互作用的图。
图6是表示各种甾类激素的分子结构的图。
图7是用于说明竞争法的概念图。
图8是表示化学物质检测装置的一个实施方式的图。
图9是表示皮质醇浓度的标准曲线的图。
图10是表示皮质醇的检测结果的图。
图11是表示甲基丙烯酰基化皮质醇的分子结构的图。
图12是表示孕酮的分子结构的图。
图13是表示孕酮浓度的标准曲线的图。
图14是表示皮质醇和孕酮的检测结果的图。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的实施方式进行说明。予以说明，本发明不受这些实施方式的任何限定，可在不脱离其主旨的范围通过各种实施方式来实施。
本发明的化学物质检测装置的一个实施方式由如下部件构成：在表面具有包含利用特定的化学物质而形成出的分子模板的捕捉体的分子捕捉部、将由该分子捕捉部捕捉到的化学物质进行定量的捕捉量计量部。前述捕捉体可依赖于检体中的前述特定的化学物质(靶)所具有的特定分子结构而捕捉该化学物质。本实施方式的化学物质检测装置的特征在于，以该技术为基本而进行化学物质的分子识别。
图1示出本实施方式中的分子模板(MIP)22的制作原理。首先，在想捕捉的靶20和、与该靶20相互作用的单体原料A201、单体原料B202以及单体原料C203的混合物中进行聚合反应，形成靶20的识别部位21。其后，通过洗涤等将靶20去除，从而可制作具有识别部位21的分子模板(MIP)22。此处，示出了使用靶20作为用于形成识别部位21的模板分子的例子，但是也可使用靶20的衍生物、类似物来替代靶20。
图2是用于说明本实施方式的化学物质检测装置的构成的概念图。如图2所示那样，本实施方式的化学物质检测装置1具有分子捕捉部10、捕捉量计量部11、试样注入部14、试样运送部15以及排出部16。以下，对各构成进行详细说明。
向试样注入部14中注入检体17。检体17包含作为检测对象的靶170、夹杂物A171、夹杂物B172等。理所当然，根据检体，有时会不包含靶170、包含更多种类的夹杂物。检体17沿箭头111、箭头112的方向被运送。
分子捕捉部10由捕捉体101和支撑体102构成。捕捉体101中包含分子模板103、捕捉到靶的分子模板104。另外，该捕捉体101配置在分子捕捉体10的表面，主要由分子模板(MIP)构成。支撑体102是担载捕捉体101，构成分子捕捉部10的主要形状的固体。支撑体102的材质如果是可保持一定的形状的材质则没有特别限定。具体列举出塑料、金属、玻璃、合成橡胶、陶瓷、实施了耐水处理、增强处理的纸、或它们的组合等。在分子捕捉部10中具有捕捉体101的表面可以是将分子捕捉部10的全部覆盖的面，也可以是一部分的表面。
分子捕捉部10可通过将个别地独立地制作出的捕捉体101与支撑体102结合而制作。支撑体102也可由包含不同的构成成分的多层结构构成。例如，包含玻璃基板与金(Au)的薄膜的二层的情况是适合的。关于捕捉体101与支撑体102的结合方法，如果按照可将靶的捕捉信息向后述的捕捉量计量部11输出的方式而构成，则没有特别限定。例如，捕捉体101与支撑体102可相互地直接结合，也可介由将两者连接的一种以上的其它的连接物质而结合。另外，分子捕捉部10也可通过将由相同原材料形成的捕捉体101与支撑体102进行一体化而构成。例如，具有分子模板的高分子聚合物其自身兼作支撑体的情况等是适合的。
分子捕捉部10按照可使至少具有捕捉体101的表面直接接触于检体17的方式而构成。这是由于，使得捕捉体101可将要检测的靶170捕捉。此处，“检体”是指成为测定的对象的液体或固体。
捕捉是指通过结合、相互作用而捕捉。该捕捉是包括直接捕捉、间接捕捉中的任一个的概念。例如，可以基于分子捕捉部10的捕捉体101对要检测的靶170进行直接捕捉，也可介由固定于分子捕捉部的第二捕捉体而间接地捕捉要检测的靶。
捕捉体101是指包含利用特定的模板分子而形成出的分子模板的捕捉体，对于成为靶的化学物质，可依赖于该靶所具有的特定分子结构而捕捉。关于该捕捉体101的材质，如果是具有依赖于特定分子结构将靶捕捉的功能的材质，则没有特别限定。例如，可以为蛋白质，也可以为聚合物，另外也可以为金属。具体而言抗体、分子模板等是适合的。
本发明中使用的分子模板的制造方法按照传感器领域等中通常使用的分子印迹法即可。例如，首先，在成为靶的化学物质的存在下，将通过离子键、氢键与该靶进行相互作用的功能性单体以及根据需要而使用的其它单体成分一起聚合，将靶固定于聚合物内。此时，关于功能性单体与其它单体成分的共聚比，因各单体成分的种类等而不同，没有特别限定，例如可设为功能性单体：其它单体成分=1：16～1：64(摩尔比)。特别优选为1：32。其后，通过洗涤从聚合物中去除该靶。残留于聚合物中的空腔(空间)记忆着靶的形状，并且也具备有通过固定于空腔内的功能性单体而化学的识别能力。
作为靶，本实施方式中对甾类激素的例子进行说明，但是不受其限定，包括在常温常压下以气化了的状态或液体状态(包括溶解于溶剂中的情况等)存在的各种物质。例如，挥发性化学物质、电解质、酸、碱、糖质、脂质、蛋白质等是适合的。另外，该靶中也包括：在常温常压下仅可以以固体状态存在、并且在气体中或液体中可以以微粒的方式存在的化学物质。对分子捕捉部具有腐蚀效果、溶解效果、改性效果等的靶是不适合的。
关于靶的分子量，如果是捕捉体101可捕捉的分子量则没有特别限定，但在以低分子化学物质的检测为主要目标的本发明中，优选为数十至数百左右的低分子。
分子捕捉部10也可按照可通过装卸部从化学物质检测装置1装卸的方式构成。这是由于，可根据测定环境或检体的状态等而选择最适合的分子捕捉部，或者节省将一次使用了的分子捕捉部进行洗涤的劳力和时间，进一步排除因连续使用而发生的污染的危险性。通过该装卸部而装卸的分子捕捉部未必需要是全部，也可以仅是例如具有捕捉体101的一部分。
装卸部可具有例如将分子捕捉部10固定于化学物质检测装置1的固定构件、用于进行与分子捕捉部10的信息收发的端子等。另外，在1个化学物质检测装置1具有多个分子捕捉部10的情况下，也可具有多个该装卸部。
捕捉量计量部11按照可对由分子捕捉部10捕捉到的化学物质进行定量的方式而构成。“将化学物质进行定量”是指，在将检体17暴露于分子捕捉部10规定的时间时，对成为靶的化学物质的分子有多少被捕捉于捕捉体101的情况进行计量。此处，“规定的时间”是指，在定量前预先确定出的任意的一定时间。例如，可以为1秒，也可以为1分钟。另外，关于该定量，可通过将捕捉体101捕捉到检体17中存在的靶170时的该捕捉体101的动态变化转换为电信号，根据其强度等而计量所捕捉到的靶。如果可将捕捉体101的动态变化转换为电信号，那么该定量的方法没有特别限定。例如，可采用表面等离子共振测定法、石英晶体微天平测定法、电化学阻抗法、比色法、或荧光法等。基于这些方法的定量，任一个都可以以100ms(0.1秒)以下进行测定。
表面等离子共振测定法也被称为SPR(surface plasmon resonance)法，通过利用反射光强度伴随着激光向金属薄膜的入射角度的变化而发生衰减这样的表面等离子共振现象，从而高灵敏度地测定在该金属薄膜上的微量的捕捉物的方法。具体而言，将通过研碎本发明的分子模板而得到的颗粒状固体悬浮于溶剂(水、有机溶剂)，旋涂在金属薄膜上，进行干燥而进行测定。在测定中，在金属薄膜表面侧产生表面等离子。隐失波与表面等离子的波数为一致时，则产生如下的现象：因共振而使得光子能量被用于激发表面等离子，因而反射光衰减。这是，在将激光的入射角度变化时，可捕捉与之相伴的反射光强度的衰减。反射光强度相对于入射光强度的比率即，反射光强度比成为最小时的入射角度(设为共振角度θ)受到在金属表面发生的物质间的相互作用的影响。因此，对于物质的相互作用，可以以其前后的共振角度θ的变化的方式进行捕捉。例如，将担载于金属薄膜表面的分子模板什么也没有捕捉到的状态的共振角度设为θ0时，该分子模板捕捉靶时则共振角度变化为θ1。在此情况下，通过观看作为θ1与θ0的差的Δθ的值的变化，从而可对分子模板捕捉了多少靶进行定量。由此，例如可将在检体中以125μM的浓度包含的皮质醇进行定量。在旋涂之时，重要的是，在等离子共振传播的距离以内进行制膜。具体而言，优选以100nm以内的厚度进行制膜。
石英晶体微天平测定法也被称为QCM(quartz crystal microbalance)法，其为根据由物质附着于石英晶体表面所导致的石英晶体的共振频率的变化量而定量地捕捉极微量的附着物的质量测定方法。具体而言，将通过研碎本发明的分子模板而得到的颗粒状的固体悬浮于溶剂(水、有机溶剂)，旋涂在石英晶体的传感器上，进行干燥而进行测定。测定方法是公知的确立了的方法，按照现有技术进行即可，因而此处省略详细的说明。为了获得测定重现性，石英晶体上的制膜厚度优选制成1μm以下。
电化学阻抗法也被称为表面极化控制法，其为通过利用电极电位来控制金属的表面极化，从而使电极表面与附着于该电极表面的物质的相互作用发生变化，导出与附着了的物质相关的信息的方法。具体而言，将通过研碎本发明的分子模板而得到的颗粒状的固体悬浮于溶剂(水、有机溶剂)，旋涂在电极表面上，进行干燥而进行测定。测定方法是公知的确立了的方法，按照现有技术进行即可，因而此处省略详细的说明。为了获得测定重现性，石英晶体上的制膜厚度优选制成1μm以下。
关于比色法以及荧光法，仅是用于检测的底物的性质不同，其原理是基本上相同的。即，底物生成显色物质的情况下称为比色法，另外在生成荧光物质的情况下称为荧光法。任一种方法都是：预先将作为检测用探针的底物等担载于捕捉体或夹杂物质等，利用吸光光度计、光度计等测定基于该底物的显色浓度、荧光强度，从而将与靶的结合进行定量的方法。这些方法中，在捕捉体为抗体的情况下，对应于ELISA法等。ELISA法也被称作酶免疫吸附分析方法。其原理在于，对于与靶结合了的一次抗体，介由作为酶标识了的夹杂物质的二次抗体等，利用该酶的作用而产生显色物质或荧光物质，基于其显色浓度、荧光强度将靶进行定量。另外，在分子模板的情况下，在空腔内具有担载了底物探针等的功能性单体的分子模板等是适合的。例如，通过将靶捕捉于该分子模板，从而可使空腔内的底物探针的状态发生变化而发出显色、或荧光，可根据其显色浓度、荧光强度将靶进行定量。
图3表示分子模板的合成路线。在聚合反应之后，将所生成的聚合物粉碎，其后，经由筛分、洗涤工序从而可获得分子模板。按照此顺序，以下对以衣康酸为原料来合成作为甾类激素的一种的皮质醇的分子模板的情况进行说明。
(皮质醇的分子模板的制造)
在皮质醇的存在下，进行与皮质醇相互作用的功能性单体的聚合，将通过聚合反应获得的聚合物进行洗涤，从而可获得在内部特异性地识别皮质醇的分子模板。图4A表示皮质醇的分子结构。图4B表示衣康酸的分子结构。如图4A所示，在皮质醇的骨架之中，将末端5元环的碳命名为C4时，则将其相邻的羰基的碳命名为C3，将其相邻的亚甲基的碳命名为C2，将其相邻的羟基的氧命名为O1。将直到O1为止认为是骨架时，则从甾体骨架的末端起，介由2个碳，直至氧，形成着结合。
另一方面，关于衣康酸，如图4B所示那样，将图左侧的羧基的碳命名为C1’时，则将相邻的亚甲基的碳命名为C2’，将其相邻的乙烯基的碳命名为C3’，将其相邻的羧基的碳命名为C4’。本发明的分子模板的制造中重要的点在于，靶与聚合性单体的相互作用力的强度。皮质醇的分子模板的原料中使用衣康酸，这是由于，可认为在衣康酸的分子的两末端存在羧基，且其距离为恰当，因而容易与皮质醇的一部分相互作用。图5示意性地表示皮质醇与衣康酸的相互作用。通过按照由虚线501和虚线502表示的方式，使用衣康酸，从而可在多个部位与皮质醇相互作用。可认为，这样地，通过在聚合单元中包括具有2个以上的与皮质醇等甾类激素相互作用的官能团的单体，从而可提高甾类激素与单体的拟合性(fitting property)，可带来作为分子模板的显著的性质。
此处，“官能团”是指，共同地包含于某一化学物质的集团中，且在该集团中显示共同的化学物性、反应性的原子团。例如，列举出羟基、醛基、羧基、羰基、硝基、氨基、磺基、偶氮基等。与上述甾类激素相互作用的单体具有2个以上的官能团的情况下，作为该官能团，特别优选为羧基。
即使对于除了皮质醇以外的甾类激素，也优选通过利用在多个点上相互作用的聚合性单体，从而可合成分子模板。天然的甾类激素一般在生殖腺、肾上腺中由胆固醇合成。图6表示胆固醇和代表性的甾类激素的分子结构。如果使用上述的皮质醇的分子模板合成的方法，那么可制作其它的甾类激素的分子模板。图6的A是胆固醇，将其设为母骨架，代谢合成出图6B的醛固酮、C的雌二醇、D的睾酮。
如上述那样，针对于皮质醇的分子模板的原料优选使用衣康酸，这是以在多点上进行氢结合为目标而选定了原料。与此同样地，可选定适合于具有平面性高的甾体骨架的甾类激素的单体结构。对于图6的B的醛固酮，通过着眼于在末端介由羰基以及亚甲基而存在的羟基(OH)与直接结合于骨架的醛基(CHO)这2个，从而可选定分子模板的单体原料。相对于上述那样的多个官能团，将可同时地相互作用那样的长度的单体分子用作分子模板原料即可。即，可使用如下单体作为聚合单元来制造分子模板，所述单体为乙烯基单体，并且是在骨架中具有2个羧基、具有拟合于分子模板的靶的恰当的距离(亚甲基时为2或者3)的单体。与皮质醇的分子模板同样地，在设为靶的甾类激素的存在下，将上述乙烯基单体和、根据需要的苯乙烯、二乙烯基苯等其它单体成分，与聚合引发剂剂一起进行共聚，从而可获得分子模板。除了共聚以外，也可将相互作用的乙烯基单体进行均聚。使上述乙烯基单体与其它单体成分进行共聚的情况下，其共聚比因各单体成分、甾类激素的种类等而不同，没有特别限定，例如可设为与甾类激素相互作用的乙烯基单体：其它单体成分=1：16～1：64(摩尔比)。特别优选为1：32。
图6的C的雌二醇、D的睾酮中官能团是远离着的，因而在分子模板制作时，对于一个单体不需要同时在多个点上相互作用，通过使用识别各个官能团的多个聚合性单体，在靶的存在下与苯乙烯、二乙烯基苯、聚合引发剂等一起进行共聚即可。
在上述的例子中，对在甾类激素与单体之间形成基于氢键等的相互作用的情况进行了说明，但作为另一实施方式，也可将成为模板分子的甾类激素进行衍生物化，导入与形成分子模板的单体进行共聚反应的官能团。在甾类激素与单体之间形成基于共聚反应的共价键，从而可使两者的相互作用变得更加牢固，甾类激素与单体的拟合性提高，带来作为分子模板的有利的性质。作为这样的与甾类激素共聚的单体，与上述同样地，可组合使用具有2个以上的官能团的衣康酸等单体、多种单体。
另外，作为导入至甾类激素分子的与单体进行共聚反应的官能团，例如，列举出丙烯酰基、甲基丙烯酰基、乙烯基、环氧基等聚合性取代基等，特别优选为甲基丙烯酰基。
予以说明，分子捕捉部也可按照利用竞争法或置换法而增强甾类激素的检测灵敏度的方式构成。“置换法”是利用在预先捕捉于捕捉体的具有特定分子结构的化学物质与检体中的要检测的靶之间发生的针对于捕捉体的竞争的方法。例如，在捕捉体为抗体的情况下，预先将该抗体固定于支撑体，预先将具有特定分子结构的复合体抗原捕捉于该抗体中。在该状态下将包含要检测的靶的检体暴露于分子捕捉部时，则根据结合力之差而使复合体抗原从抗体解离，代替地将检体中的要检测的靶捕捉于抗体中。可通过将基于该置换反应的变化进行定量从而以高灵敏度将靶进行定量。例如，如果是使用表面等离子共振测定法的情况，那么捕捉基于置换反应的共振角度θ的变化即可。通过基于该置换法而增强检测灵敏度，使得即使是ppt水平的浓度的靶也可进行检测。
另外，基于图7说明使用了竞争法的例子。如图7所示那样，向容器84中，预先加入分子模板80的悬浮水溶液，向其中加入检体82和标识化靶83的固体或水溶液。检体82包含有靶820、夹杂物A821以及夹杂物B822等。不用说，也可存在有不存在靶820的情况、存在多种夹杂物的情况。标识化靶83包含靶部分832和标识部分831。通过使靶820以及标识化靶83进行竞争而与分子模板80在室温下反应了1小时，然后测定标识部分831的比色量、荧光量，从而可算出检体82中的靶量。即，靶量越多，则荧光变得越小，溶液的颜色变得越薄。在检体82中的靶量的算出中，可使用另行算出了的比色、荧光的标准曲线。根据此测定，例如，可将在检体中以125μM以下的浓度包含的皮质醇优越地进行定量。
另外，在上述实施方式中，由捕捉量计量部取得的电信号通常大多为微弱，因而也可根据需要将所取得的电信号放大。关于该放大，可利用在捕捉量计量部中设置放大器等方法来进行。另外，取得了的电信号为模拟信号(analogsignal)的情况下，也可根据需要将该模拟信号进行AD转换。关于AD转换，可利用在捕捉量计量部中设置比较器等AD变换器等的方法来进行。
进一步，捕捉量计量部按照可将计量结果输出的方式而构成。测定结果的输出目的地没有特别限定。例如，也可将该计量结果输出到监控器等的外部显示部。在输出之时的输出形式方面也没有特别限定。也可直接介由布线而输出，也可设置USB端子等连接端子介由电缆而输出。另外，也可通过无线而发送。
图8表示本发明的化学物质检测装置的另一实施方式。图8的化学物质检测装置主要是在树脂、玻璃、硅胶、纸、金属等原材料上涂布分子模板而得到的化学物质检测装置。关于检测装置，大致包含3个部分，即，包含试样注入部91、捕捉检测部90、以及前处理层92。在前处理层92中固定有将唾液中的蛋白质、脂质等进行吸附的非织造布。因此，不使对皮质醇等甾类激素的检测构成妨碍的蛋白质、脂质等进入捕捉检测部90。予以说明，此前处理层92中使用的原材料不限定为非织造布，也可以为树脂、玻璃、硅胶、纸等。在捕捉检测部90中涂布着分子模板。另外，利用置换法的情况下，也可预先将标识化甾类激素的一定量进行固定化。接着，在试样注入部91上涂布检体93。检体93中包含靶930、夹杂物A931、夹杂物B932等。在利用竞争法的情况下，在检体93中混合标识化靶，涂布于试样注入部91。其后，检体93以及标识化靶沿箭头933的方向行进，在前处理层92中，将检体93中的夹杂物的一部分或全部去除。其后，利用捕捉检测部90的分子模板，将检体93中的靶930以及标识化靶进行捕捉。在检测方面，可通过使用荧光显微镜、目视确认、光学显微镜等，利用判定显色出的颜色等操作，从而进行。通过使用该芯片(chip)形态的化学物质检测装置，从而可检测出例如检体中的125μM以下的浓度的靶。
实施例
下面，基于实施例而进一步详细地说明本发明。但是，以下的实施例仅为例示，本发明不受这些实施例的任何限定。
(实施例1)
溶剂使用THF(四氢呋喃)，通过以下所示的方法进行了分子模板的合成。首先，向皮质醇：衣康酸：苯乙烯：二乙烯基苯(DVB)=1：4：4：20(摩尔比)的混合物中，添加了相对于单体成分按摩尔比计为2％的作为聚合引发剂的V-70(2,2’-偶氮二(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈))。
具体而言，按照表1的配方进行了分子模板聚合物(MIP)的聚合。向管形(vial)瓶中，加入皮质醇362.5mg(1mmol)、衣康酸524mg(4mmol)、苯乙烯418mg(4mmol)、二乙烯基苯(DVB)2604mg(20mmol)，溶解于THF(20ml)，然后移至
Figure BDA0000456597200000131
18×180mm的试验管，使作为聚合引发剂的2,2’-偶氮二(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)(V-70)(0.56mmol)进行溶解。盖上隔帽(septum cap)而进行氮气置换，在30℃水浴中进行了72小时聚合。
为了参照实验，进行了非分子模板聚合物(NIP：non-imprinted polymer)的聚合。按照表1的配方，向管形瓶中，不添加皮质醇，将衣康酸524mg(4mmol)、苯乙烯418mg(4mmol)、以及二乙烯基苯(DVB)2604mg(20mmol)溶解于THF(20ml)，然后移至
Figure BDA0000456597200000132
18×180mm的试验管，使作为聚合引发剂的2,2’-偶氮二(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)(V-70)(0.56mmol)进行溶解。盖上隔帽而进行氮气置换，在30℃水浴中进行了72小时聚合。
表1
Figure BDA0000456597200000141
将聚合后的聚合物进行减压干燥而由研钵研碎后，使用索格利特萃取器(Soxhlet)按照丙酮、甲醇/乙酸(9/1、体积/体积)、甲醇的顺序洗涤，进行洗涤直至无法从溶剂中检测到作为靶的皮质醇。对于没有装入靶的非分子模板聚合物(NIP)也同样地操作而进行了聚合、洗涤。
皮质醇分子模板聚合物的评价
使用洗涤后的聚合物而进行了吸附实验。准备调整为0、125、250、500以及1000μM的皮质醇的乙腈溶液，分别由移液管计量1mL而放入微管。逐个量取5mgMIP或者NIP而加入其中，盖上帽，以25℃、800rpm进行搅拌而进行了40小时培育(incubation)。培育后，进行过滤而去除聚合物，利用HPLC将溶液中的皮质醇进行了定量。过滤中使用的膜使50μm以下的固体通过。根据定量的结果，求出了在各浓度下的向分子模板聚合物的吸附量。
HPLC条件为如下：色谱柱使用Merck公司制CHROMOLITH(注册商标)RP-18e100-4.6，洗脱液使用乙腈/H2O(70/30、体积/体积)，将流速设为1mL/分钟，在检测中使用了UV光(241nm)。
首先，在求出吸附量之前，制成了HPLC的标准曲线。将所制成的标准曲线示于图9。图的横轴表示皮质醇浓度(μM)，纵轴表示根据HPLC而求出了的峰面积的106分之一。关于皮质醇浓度，使用0、62.5、125、250、500以及1000μM的试样，进行了峰面积相对于各浓度的绘图。与该绘图的近似曲线中，成为Y=7589.7X，求出了相关二次方系数(R2)为0.99。使用此标准曲线，从而算出了向MIP以及NIP的吸附量。
对去除了聚合物的上清液中的浓度进行定量，据此而求出了向分子模板聚合物的吸附量。将吸附行为结果示于表2和图10。图10的横轴表示皮质醇浓度(μM)，纵轴表示根据标准曲线而求出了的3次平均的结合量(μmol/g)。在测定结果中成为0以下的情况下，可认为是大致全部的皮质醇被回收于上清液，向MIP或NIP的结合量小。
表2
Figure BDA0000456597200000151
在NIP中，不管浓度为如何，基本上没有吸附，相对于此，在MIP中发现了吸附量随着浓度提高而增加。该情况表明，利用上述所示的原材料和方法制成的分子模板聚合物可特异性地识别皮质醇。因此，可提供对于皮质醇等甾类激素具有高的识别能力的分子模板。
(实施例2)
皮质醇的甲基丙烯酰基化
在上述实施例1中叙述了，利用衣康酸等分子模板原料与作为模板分子的皮质醇之间的氢键而进行了MIP合成的例子。以下叙述，利用原料与模板分子之间的共价键而进行MIP合成的例子。将在该实施例2中制作的MIP称为MIP1。首先，在合成MIP1之时，按照以下的顺序变换了作为模板分子的皮质醇。
首先，在氮气气氛下，将皮质醇(2.5mmol、907mg)溶解于干燥THF(40mL)，加入三乙胺(30mmol、4.2ml)并且进行冰冷却。向其中，缓慢地滴加溶解了甲基丙烯酰氯(15mmol、1.5ml)的干燥THF(40mL)，在0℃搅拌1小时，其后在室温下搅拌4小时。
接着，向反应液中加入乙酸乙酯，利用分液漏斗用饱和碳酸氢钠水溶液、柠檬酸、以及氯化钠水溶液洗涤有机相。其后，用硫酸钠将有机相干燥。
接着，用蒸发器将溶剂蒸馏去除，利用硅胶柱色谱法(硅胶C-200、展开溶剂：乙酸乙酯/己烷=1：1)将萃取物分离精制，获得了白色固体(收率65％)。将通过其而获得的甲基丙烯酰基化皮质醇的分子结构示于图11。
予以说明，该图11所示的甲基丙烯酰基化皮质醇也可通过以下的方法获得。即，在氮气气氛下，在二口烧瓶中，将皮质醇(2.5mmol、907mg)以及二甲基氨基吡啶(0.25mmol、30.5mg)溶解于干燥THF(40mL)，进行冰冷却。接着，缓慢地滴加三乙胺(30mmol、4.2ml)以及甲基丙烯酸酐(7.5mmol、1.2ml)，在0℃搅拌1小时，其后在室温下搅拌2天。向反应液中加入乙酸乙酯，利用分液漏斗用纯水将有机相进行3次洗涤，用硫酸钠干燥。用蒸发器将溶剂蒸馏去除，利用硅胶柱色谱法(硅胶C-200、展开溶剂：乙酸乙酯/己烷=1：1)将萃取物进行分离精制，获得了白色固体(收率89％)。
MIP1的合成
以利用上述中任一种方法而调制出的导入甲基丙烯酰基而得到的皮质醇衍生物作为模板分子，按照以下的表3所示的原料组成而合成了MIP1。甲基丙烯酰基具有烯属不饱和基，是聚合反应性的，因而导入甲基丙烯酰基而得到的皮质醇可与表3所示的添加单体进行共聚。其结果是分子模板原料与皮质醇衍生物可较强地进行结合、识别，因而可制作能够以高的选择性捕捉皮质醇的分子模板。
具体而言，按照表3的配方进行了分子模板聚合物(MIP1)的聚合。首先，向管形瓶中，加入甲基丙烯酰基化皮质醇215.3mg(0.5mmol)、衣康酸262mg(2mmol)、苯乙烯209mg(2mmol)以及二乙烯基苯(DVB)1304mg(10mmol)，溶解于THF(10ml)，然后移至18×180mm的试验管，使作为聚合引发剂的2,2’-偶氮二(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)(V-70)(0.28mmol)进行溶解。盖上隔帽而进行氮气置换，在30℃水浴中进行了72小时聚合。将所获得的聚合物进行真空干燥，由研钵研碎后，利用50ml的2M氢氧化钠水溶液/甲醇=1：1进行48小时水解，其后，用1M盐酸/甲醇=1：1、纯水/甲醇=1：1洗涤，然后以6小时利用甲醇进行了索格利特萃取。通过水解，可从MIP1去除皮质醇衍生物。
表3
Figure BDA0000456597200000171
皮质醇吸附实验
量取聚合物(MIP1)5mg，分别加入1ml的调整为1000、500、250、125及62.5μmol/l的皮质醇的氯仿/己烷=4/1溶液，以25℃、800rpm培育了48小时。用注射器过滤器将培育后的溶液过滤，在其中采取0.5ml，真空干燥后，再溶解于0.5ml的乙腈，利用LC进行了定量。另外，对于没有加入MIP1的仅是溶液的样品进行同样的操作，将其用作对照的标准曲线而求出了结合量。过滤中使用的膜使50μm以下的固体通过。根据定量的结果，求出了各浓度下的向分子模板聚合物MIP1的皮质醇吸附量。
关于HPLC条件，色谱柱使用Merck公司制CHROMOLITH(注册商标)RP-18e100-4.6，洗脱液使用乙腈/H2O(70/30、体积/体积)，将流速设为1mL/分钟，在检测中使用了UV光(241nm)。
孕酮吸附实验
量取5mg的MIP1，分别加入1ml的调整为1000、500、250、125及62.5μmol/l的孕酮的氯仿/己烷=4/1溶液，以25℃、800rpm培育了48小时。将孕酮的化学结构示于图12。用注射器过滤器将培育后的溶液过滤，在其中采取0.5ml，真空干燥后，再溶解于0.5ml的乙腈，并且利用LC进行了定量。另外，对于没有加入MIP1的仅是溶液的样品进行同样的操作，将其用作对照的标准曲线而求出了结合量。过滤中使用的膜使50μm以下的固体通过。根据定量的结果，求出了各浓度下的向分子模板聚合物MIP1的孕酮吸附量。
关于HPLC条件，色谱柱使用Merck公司制CHROMOLITH(注册商标)RP-18e100-4.6，洗脱液使用乙腈/H2O(70/30、体积/体积)，将流速设为1mL/分钟，在检测中使用了UV光(241nm)。
予以说明，在求出吸附量之前，对于孕酮制成了HPLC的标准曲线。将所制成的标准曲线示于图13。图的横轴表示孕酮浓度(μM)，纵轴表示根据HPLC而求出了的峰面积。关于孕酮浓度，使用62.5、125、250、500以及1000μM的试样，从而进行了峰面积相对于各浓度的绘图。近似于该绘图的近似曲线中，成为Y=2818.7X，求出了相关二次方系数(R2)为0.9999。使用此标准曲线，从而算出了向MIP1的吸附量。予以说明，关于皮质醇的HPLC的标准曲线有效利用了上述的图6。
对去除了聚合物的上清液中的浓度进行定量，基于其定量结果而求出了向分子模板聚合物MIP1的吸附量。将吸附行为结果示于表4和图14。图14的横轴表示甾类激素(皮质醇以及孕酮)的浓度(μM)，纵轴表示根据标准曲线而求出了的3次平均的结合量(μmol/g)。
其结果是在甾类激素的浓度为62.5μM时，关于向MIP1的吸附量，皮质醇为2.9(μmol/g)，相对于此，孕酮为1.5(μmol/g)，获得了显著的差。因此，在唾液中存在2种甾类激素的情况下，该MIP1可以以高的选择性将皮质醇捕捉。同样地，在甾类激素的浓度为125μM时，关于向MIP1的吸附量，皮质醇为13.7(μmol/g)，相对于此，孕酮为1.0(μmol/g)，发现了显著的差。在甾类激素的浓度为250μM时，关于向MIP1的吸附量，皮质醇为19.0(μmol/g)，相对于此，孕酮为1.3(μmol/g)，发现了显著的差。在甾类激素的浓度为500μM时，关于向MIP1的吸附量，皮质醇为28.2(μmol/g)，相对于此，孕酮为5.2(μmol/g)，发现了显著的差。即使在甾类激素的浓度为1000μM时，关于向MIP1的吸附量，皮质醇为32.7(μmol/g)，相对于此，孕酮为6.0(μmol/g)，也发现了显著的差。
表4
另外，根据表2和表4的比较可知，在相同的皮质醇浓度时，与实施例1中的向MIP的吸附量相比，实施例2中的向MIP1的吸附量高。即，关于MIP1，在任一个皮质醇浓度下，与实施例1的MIP相比皮质醇的捕捉量都多。因此，将作为模板分子的皮质醇进行甲基丙烯酰基化、制作出分子模板MIP1的方式由于高灵敏度化而是有利的。
以上，对用于实施本发明的实施方式进行了说明。MIP具有作为生物体高分子的抗体那样的选择性、捕捉性，并且是非天然合成物，因而环境耐受性、温度耐受性优异。因此，具有即使是使用者在保管等中不是很谨慎敏感(神経質)也能够使用的长处。因此，对于设想作为使用者的医疗相关人员(医生、临床检查技术人员、护士)为代表，家庭一般消费者而言，都可提供使用方便的良好的化学传感器。特别是，通过高灵敏度地检测与应激疾病紧密相关的皮质醇等甾类激素，从而可在早期诊断应激疾病的预兆，可对预防和早期治疗作出贡献。
予以说明，本发明不受限于上述实施方式，包含各种各样的变形例。例如，可将某一实施方式的构成的一部分置换为其它实施方式的构成，另外，可向某一实施方式的构成中加入其它实施方式的构成。另外，对于各实施方式的构成的一部分，可进行其它的构成的追加、削除、置换。
符号说明
1化学物质检测装置，10分子捕捉部，101捕捉体，102支撑体，103分子模板，104分子模板，11捕捉量计量部，111箭头，112箭头，14试样注入部，15试样运送部，16排出部，17检体，170靶，171夹杂物A，172夹杂物B，20靶，201单体原料A，202单体原料B，203单体原料C，21识别部位，22分子模板，501箭头，502箭头，80分子模板，82检体，83标识化靶，820靶，821夹杂物A，822夹杂物B，832靶部分，831标识部分，84容器，90捕捉检测部，91试样注入部，92前处理层，93检体，930靶，931夹杂物A，932夹杂物B，933箭头
将本说明书所引用的全部的刊物、专利以及专利申请直接以参考方式并入本说明书中。

Claims (19)

1.一种分子模板，其为甾类激素的分子模板，由与所述甾类激素相互作用的聚合物形成。
2.根据权利要求1所述的分子模板，其中，所述聚合物在聚合单元内具有2个以上的与所述甾类激素相互作用的官能团。
3.根据权利要求2所述的分子模板，其中，在所述聚合单元内，具有2个以上的羧基作为与所述甾类激素相互作用的官能团。
4.根据权利要求3所述的分子模板，其中，所述甾类激素是皮质醇或其衍生物，所述聚合物包含衣康酸作为聚合单元。
5.一种分子模板的制造方法，其包含如下工序：
在甾类激素的存在下进行与甾类激素相互作用的单体的聚合反应的工序，
将通过所述聚合反应获得的聚合物进行洗涤，从而从所述聚合物中去除甾类激素的工序。
6.根据权利要求5所述的分子模板的制造方法，其中，所述单体包括具有2个以上的与所述甾类激素相互作用的官能团的单体。
7.根据权利要求6所述的分子模板的制造方法，其中，所述单体具有2个以上的羧基作为与所述甾类激素相互作用的官能团。
8.根据权利要求7所述的分子模板的制造方法，其中，所述甾类激素是皮质醇或其衍生物，所述单体是衣康酸。
9.根据权利要求5所述的分子模板的制造方法，其中，所述单体包括具有与所述甾类激素相互作用的官能团的2种以上的单体。
10.根据权利要求5所述的分子模板的制造方法，其中，所述甾类激素具有与所述单体进行共聚反应的官能团。
11.根据权利要求10所述的分子模板的制造方法，其中，所述官能团是甲基丙烯酰基。
12.根据权利要求10或11所述的分子模板的制造方法，其中，所述单体包括具有2个以上的与所述甾类激素相互作用的官能团的单体。
13.根据权利要求12所述的分子模板的制造方法，其中，所述单体具有2个以上的羧基作为与所述甾类激素相互作用的官能团。
14.根据权利要求10所述的分子模板的制造方法，其中，所述甾类激素是甲基丙烯酰基化皮质醇，所述单体是衣康酸。
15.一种化学物质检测装置，其包含：
具有包含权利要求1～4中任一项所述的分子模板的捕捉体的分子捕捉部，
将捕捉于所述分子捕捉部的甾类激素进行定量的捕捉量计量部。
16.根据权利要求15所述的化学物质检测装置，其中，所述分子捕捉部按照利用竞争法或置换法增强甾类激素的检测灵敏度的方式而构成。
17.根据权利要求15或16所述的化学物质检测装置，其中，在所述捕捉量计量部，使用表面等离子共振测定法、石英晶体微天平测定法、电化学阻抗法、比色法或荧光法将甾类激素进行定量。
18.一种化学物质检测方法，其包含如下工序：
使包含甾类激素的检体接触于具有包含权利要求1～4中任一项所述的分子模板的捕捉体的分子捕捉部，在所述分子捕捉部中捕捉所述甾类激素的工序，
将捕捉于所述分子捕捉部的甾类激素进行定量的工序。
19.根据权利要求18所述的化学物质检测方法，其中，所述分子捕捉部按照利用竞争法或置换法增强甾类激素的检测灵敏度的方式而构成。
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