JP6747939B2 - 検出方法及びデバイス - Google Patents
検出方法及びデバイス Download PDFInfo
- Publication number
- JP6747939B2 JP6747939B2 JP2016211569A JP2016211569A JP6747939B2 JP 6747939 B2 JP6747939 B2 JP 6747939B2 JP 2016211569 A JP2016211569 A JP 2016211569A JP 2016211569 A JP2016211569 A JP 2016211569A JP 6747939 B2 JP6747939 B2 JP 6747939B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liquid
- target molecule
- membrane
- support
- support membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
Description
まず、実施形態に係る粒子について説明する。図1は、本発明の一実施形態に係る粒子の構成を示す模式図である。実施形態に係る粒子1は、脂質を含有する支持膜12と、粒子本体10と、を有するものである。
支持膜が含有する脂質としては、リン脂質や糖脂質等が挙げられる。リン脂質としては、天然物であっても人工物であってもよい、リン脂質としては、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質;ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスフィチジル酸、ホスフィチジルイノシトール等のグリセロリン脂質が挙げられる。ホスファチジルコリンとしては、ジオレオイル−ホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン(DPPC)等が挙げられる。
支持膜が含有してもよいタンパク質としては、レセプター、イオンチャネル等の膜貫通型タンパク質や、グリセロフォスファチジルイノシトール等に結合する脂質結合型タンパク質、タンパク質付着型タンパク質等が挙げられる。また、ビオチンやヒスチジンオリゴマーでタグ付けされた人工タンパク質などが挙げられる。
さらに、粒子表面に形成された支持膜に対し、任意成分を含むベシクルを支持膜にベシクル融合をさせてもよい。例えば、プロテオソーム等の任意のタンパク質を含むベシクルを、支持膜にベシクル融合させることで、任意のタンパク質を膜タンパク質として支持膜に担持させることができる。また、ベシクルは、人工膜だけでなく小胞体や筋小胞体、単離した細胞膜などの生体由来の膜を直接利用することもできる。
図2は、本発明の一実施形態に係るデバイスの構成を示す模式図である。
実施形態のデバイスは、同一基板上に,複数の流路を有してもよい。実施形態に係るデバイス3は、流路31a,31bと、前記流路に液Lを導入するための導入口33a,33bと、排出口33c,33dと、を有する基板30を備え、前記流路31a,31b内に、脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する粒子1が充填されている。導入口は、基板の表面に開口し、導入口を通じて流路内へと液を導入可能である。なお、各導入口/排出口は、前記流路から液を排出するための排出口/導入口を兼ねることができる。すなわち、流体の流れの上流の開口であれば導入口として用いることができ、流体の流れの下流の開口であれば排出口として用いることができる。液Lとしては、後述の第1の液又は第2の液が挙げられる。
基板は、同一の材料で構成された2つの基板が積層された積層体であってよい。基板への流路の形成には、エッチング法などでウエハを削って溝を形成したり、蒸着法で壁を堆積して溝を形成したりした後に、別の基板で溝のフタをすればよい。流路の形成法としては、ダイシングソーを用いた簡便な方式や、ドライエッチング、ウェットエッチング、サンドブラスト法、ミリング法等が適用できる。ポリスチレンなどの樹脂については、射出成型法などで作製してもよい。
流路の材質および作製方法には、種々の方法が挙げられるが、ポリジメチルシロキサンなどの高分子樹脂を、鋳型を用いて作製する方法が好ましい。
次に、実施形態のデバイス3を用いた検出方法について説明する。なお、本発明の検出方法は、下記実施形態のデバイスで実施されるものに限定されない。
送液工程は、粒子が設けられた前記流路内に、前記標的分子を含む第1の液を送液する工程である。
粒子が設けられた前記流路内に、前記標的分子を含む第1の液を送液することにより、高効率に、支持膜と標的分子とを相互作用させることができる。また、用意する第1の液の量を少なくすることができ、少量のサンプルに対しても検出を行うことができる。
本実施形態の送液工程は、第二送液工程を含む。
第二送液工程は、前記流路に、前記標的分子を含まない液、又は前記第1の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む液である第2の液を送液する工程である。
前記第1の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む第2の液が流路内に導入されても、通常、第1の液に含まれる標的分子と支持膜との相互作用と、同一の程度の相互作用は生じない。
検出工程は、前記粒子の支持膜に標的分子が相互作用した場合の前記支持膜の構造の変化、及び/又は前記支持膜と相互作用する標的分子、をラマン分光法により検出する工程である。
実施形態のデバイス3では、例えば、ラマン分光装置の光学素子を流路31aへと向け、樹脂シート30bを介して、ラマン散乱光を検出すればよい。
1)支持膜の構造変化を検出
標的分子によって支持膜の構造の変化が生じる場合、ラマン分光法によって、その変化を検出する。例えば、支持膜に標的分子が貫入し、その周囲の支持膜の構造に変化が生じた場合、その変化の存在を検出する。
2)標的分子を検出
標的分子自体を、ラマン分光法によって検出する。例えば、支持膜に標的分子が貫入した場合、標的分子の存在を検出する。
本実施形態の検出工程は、第二検出工程を含む。
本実施形態では、流路31b内の粒子の支持膜に対し、ラマン分光法による検出を行う。
実施形態のデバイス3では、例えば、ラマン分光装置の光学素子を流路31bへと向け、樹脂シート30bを介して、ラマン散乱光を検出すればよい。
第2の液が標的分子を含む場合、流路31b内の粒子の支持膜と、第2の液に含まれる標的分子との相互作用をラマン分光法により検出できる。
第2の液が標的分子を含まない場合、流路31b内の粒子の支持膜と、第1の液に含まれる標的分子との相互作用が生じていない状態についての、参照データを取得できる。
算出工程は、粒子の支持膜と接触する前の第1の液と、粒子の支持膜と接触した後の第1の液について、それらの液に含まれる標的分子の量又は濃度の差を測定することにより、支持膜に相互作用した標的分子の絶対量を見積もる工程である。
導入口33aから採取された第1の液に含まれる標的分子の濃度を測定し、排出口33cから採取された第1の液に含まれる標的分子の濃度を測定する。標的分子は、流路31aを通過する過程で、粒子の支持膜に捕捉される。その結果、導入口33aから採取された第1の液に含まれる標的分子の量又は濃度よりも、排出口33cから採取された第1の液に含まれる標的分子の量又は濃度のほうが低くなる。この量又は濃度の差を測定することにより、支持膜に相互作用した、第1の液の標的分子の絶対量を見積もることができる。
(脂質膜を表面に有する粒子の製造)
脂質分子1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(以下、DOPC)のクロロホルム溶液(2.5g/L)を調製した。得られたクロロホルム溶液は、はじめに窒素気流下においてクロロホルムを蒸発させ、次に真空下に1晩おいてクロロホルムをさらに除去した。ここにDOPC濃度が1g/LになるようにHEPES緩衝液(10mM,pH=7.4)を加えた。これに超音波照射を45分間行い、DOPCのベシクルを含む透明溶液を得た。この溶液に、市販のシリカビーズ(直径約5μm)を混合して、ベシクルフュージョン法によりビーズ表面に脂質二分子膜を形成した。ローテータを用いて1晩撹拌した後、HEPES緩衝液を用いて3回洗浄(遠心分離機を用いてビーズを沈殿させ、HEPES緩衝液を加えて撹拌する、を繰り返す)し、余分なベシクルを除去した。このようにして、シリカビーズ表面に支持された脂質膜(支持膜)の、HEPES緩衝液の分散溶液(10g/L)を得た。
(脂質膜を表面に有する平面基板の製造)
上記の実施例において、シリカビーズに代えて2次元平面基板を用い、2次元平面基板上に、脂質膜(支持膜)を形成させた。
まず、実施例1で得た粒子と、比較例1で得た平面基板とで、支持膜構造の観測結果を比較した。観測された支持膜に由来するピークは、以下の通りである。
1)1050−1100cm−1
2)1200−1300cm−1
3)1450cm−1
4)1660cm−1
(マイクロデバイス素子の製造)
脂質膜を表面に有するシリカビーズを流路内に充填したマイクロデバイス素子は、以下のように作製した。
ポリジメチルシロキサン樹脂を、鋳型を用いて流路作製した。流路は2本並んだ配置をとり、それぞれ幅300μm、高さ100μm、直線部の長さ5mm、直前部の2流路の間隔50μmの形状に成形した。流路の両端には、試料溶液を導入/排出するため、直径500μmの導入口/排出口が設けられている。この流路を、表面を親水処理したガラス基板に密着させて搭載した。
2本の流路に、実施例1で得た脂質膜を表面に支持したシリカビーズの分散溶液を導入し、流路内にシリカビーズを充填した(図2参照)。
別途、(−)‐エピガロカテキン3‐ガラート(以下EGCG)をHEPES緩衝液(10mM,pH=7.4)に溶解し、濃度の異なる3種類のECGC溶液(1μM,10μM,10mM)を作製した。2本の流路の一方に、EGCG溶液を、毛管現象による自己相液力により導入した。流路内が乾燥しないように飽和水蒸気雰囲気化にて3時間静置し、溶液中のEGCGを十分に支持膜と作用させた後、流路内の雰囲気をHEPES緩衝液に置換し、支持膜に吸着したEGCGと支持膜の相互作用による支持膜構造の変化を、顕微ラマン分光法により検出した。
EGCGを導入した流路と、EGCGを導入していない参照用の流路において、得られたラマンスペクトルを比較した。4つのラマンピーク全てについて、強度が減少することを観測した(図4)。強度の減少の度合いは、1μM,10μM,10mMと濃度が高くなるほど大きいことが分かった。よって、このピーク強度の変化は、ECGCと支持膜の相互作用に由来し、その相互作用の大きさは、EGCGの濃度が高いほど大きくなることが分かった。
(ラマン分光法と高速液体クロマトグラフィー法との組み合わせ)
上記の実施例2でEGCGを導入した流路において、支持膜と接触する前の液体(液体1)を流路の上流の導入口から、支持膜と接触した後に流路の下流に送液された液体(液体2)を流路の下流の排出口から、それぞれマイクロシリンジで抽出し、高速液体クロマトグラフィー法を用いてEGCG濃度の変化を測定した。その結果、濃度の異なる3種類のECGC溶液(1μM,10μM,10mM)においても、液体2のEGCG濃度は、液体1よりも低い値となることが分かった。これは、シリカビーズ表面に支持された脂質膜上へのEGCG吸着により、液体2中に存在するEGCGの分子数が減少したためと説明できる。
この液体1,2の濃度変化量から、シリカビーズ表面に支持された脂質膜上へのEGCG吸着絶対量を見積もると、20−50ng/cm2程度であった。
Claims (4)
- 脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する粒子の、前記支持膜に標的分子が相互作用した場合の前記支持膜の構造の変化、及び/又は前記支持膜と相互作用する標的分子、を検出する検出工程を有し、
前記相互作用は、前記標的分子と前記支持膜との結合、前記標的分子と前記支持膜との吸着、又は前記標的分子の前記支持膜への貫入若しくは前記支持膜の貫通であり、
前記粒子が、基板に形成された流体を送液可能な流路内に充填されており、前記流路内に、前記標的分子を含む第1の液を送液し、前記支持膜と前記標的分子との前記相互作用により、前記支持膜に前記標的分子を捕捉させる送液工程を有し、
前記検出する手法として、ラマン分光法を用いることを特徴とする、検出方法。 - 前記送液工程が、前記流路に、前記標的分子を含まない液、又は前記第1の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む液である第2の液を送液する第二送液工程を有することを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記粒子の前記支持膜と接触する前の第1の液と、前記粒子の前記支持膜と接触した後の第1の液について、それらの液に含まれる前記標的分子の量又は濃度の差を測定することにより、前記支持膜に相互作用した前記標的分子の絶対量を見積もる算出工程を有することを特徴とする、請求項1又は2に記載の検出方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の検出方法に用いられるデバイスであって、
流路と、前記流路に液を導入するための導入口と、を有する基板を備え、
前記流路内に、脂質を含有する支持膜及び粒子本体を有し、前記支持膜と標的分子との前記相互作用により、前記支持膜に前記標的分子を捕捉する粒子が充填され、
前記相互作用は、前記標的分子と前記支持膜との結合、前記標的分子と前記支持膜との吸着、又は前記標的分子の前記支持膜への貫入若しくは前記支持膜の貫通であることを特徴とする、デバイス。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016211569A JP6747939B2 (ja) | 2016-10-28 | 2016-10-28 | 検出方法及びデバイス |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016211569A JP6747939B2 (ja) | 2016-10-28 | 2016-10-28 | 検出方法及びデバイス |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018072134A JP2018072134A (ja) | 2018-05-10 |
JP6747939B2 true JP6747939B2 (ja) | 2020-08-26 |
Family
ID=62113768
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016211569A Active JP6747939B2 (ja) | 2016-10-28 | 2016-10-28 | 検出方法及びデバイス |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6747939B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109596597A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-09 | 中兴高能技术有限责任公司 | 一种评价石墨表面包覆改性的方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998037417A1 (en) * | 1997-02-20 | 1998-08-27 | The Regents Of The University Of California | Plasmon resonant particles, methods and apparatus |
US7588827B2 (en) * | 2003-08-18 | 2009-09-15 | Emory University | Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS)-active composite nanoparticles, methods of fabrication thereof, and methods of use thereof |
EP2193371A2 (en) * | 2007-03-26 | 2010-06-09 | Owe Orwar | Methods and devices for controlled monolayer formation |
JP2009270852A (ja) * | 2008-05-01 | 2009-11-19 | Fujifilm Corp | ラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置 |
US20130273561A1 (en) * | 2010-10-29 | 2013-10-17 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Lipid encapsulation of surface enhanced raman scattering (sers) nanoparticles |
EP2717038A4 (en) * | 2011-06-03 | 2015-04-08 | Hitachi High Tech Corp | METHOD AND DEVICE FOR OPTICALLY ANALYZING A BIOPOLYMER |
WO2013046826A1 (ja) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | 株式会社日立製作所 | 分子鋳型及びその製造方法 |
JP6602202B2 (ja) * | 2012-12-11 | 2019-11-06 | アール. ザメツニク,コリン | 造影剤としての、増加した表面増強ラマン散乱特性を有する封入色素コーティング貴金属ナノ粒子 |
EP2993460B1 (en) * | 2013-05-30 | 2019-07-03 | Osaka Prefecture University Public Corporation | Target-substance detection apparatus and method |
-
2016
- 2016-10-28 JP JP2016211569A patent/JP6747939B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2018072134A (ja) | 2018-05-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Viehrig et al. | Quantitative SERS assay on a single chip enabled by electrochemically assisted regeneration: a method for detection of melamine in milk | |
Ferhan et al. | Solvent-assisted preparation of supported lipid bilayers | |
Kleefen et al. | Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays | |
Primiceri et al. | Cell chips as new tools for cell biology–results, perspectives and opportunities | |
Yan et al. | Advances in analytical technologies for extracellular vesicles | |
CN108636153B (zh) | 射流装置 | |
JP4783422B2 (ja) | プロテオリピド膜及び脂質膜バイオセンサー | |
US7258837B2 (en) | Microfluidic device and surface decoration process for solid phase affinity binding assays | |
US20160223531A1 (en) | Method for detecting target molecule | |
CN110954686B (zh) | 混合纳米孔传感器 | |
US20090274579A1 (en) | Methods and devices for controlled monolayer formation | |
JP6082996B2 (ja) | 生体分子の1分子検出方法および1分子検出装置、疾病マーカ検査装置 | |
WO2009091048A1 (ja) | 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 | |
Michelle Grandin et al. | Bioinspired, nanoscale approaches in contemporary bioanalytics | |
Paganini et al. | Rapid Characterization and Quantification of Extracellular Vesicles by Fluorescence‐Based Microfluidic Diffusion Sizing | |
JP6747939B2 (ja) | 検出方法及びデバイス | |
JP2011185874A (ja) | 生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法 | |
Ressine et al. | Macro/nao-structured silicon as solid support for antibody arrays: Surface design, reproducibility, and assay characteristics enabling discovery of kallikrein gene products for prostate disease diagnostics | |
JP4732913B2 (ja) | マイクロチップ及びマイクロチップの使用方法 | |
CN107589254B (zh) | 一种免疫脂质体复合物纳米粒子生物芯片的制造方法及应用 | |
US10444244B2 (en) | Microfluidic array supporting a lipid bilayer assembly | |
JP2013536434A (ja) | 非極性溶媒の電気浸透輸送のためのデバイス及び方法 | |
Zeng et al. | Mechanism and kinetics of lipid bilayer formation in solid-state nanopores | |
Usman et al. | Single Molecule Spectroscopy Studies of Acid–Base Chemical Gradients Using Nile Red as a Probe of Local Surface Acidity | |
Stamm et al. | Functionalization of ceramic liposomal nanoparticles, cerasomes, with antibodies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191001 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190930 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191112 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200114 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200220 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200804 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200806 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6747939 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |