CN110229291A - 基于fdu-12的黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子印迹聚合物领域，公开了一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其农作物检测方面应用。选用介孔二氧化硅材料FDU‑12为载体，7‑乙酰氧基‑4‑甲基香豆素为黄曲霉毒素的替代模板，合成表面印迹聚合物FDU‑12@MIPs。将合成的聚合物用作吸附剂制备表面印迹固相萃取柱，对食品中黄曲霉毒素进行萃取和分离，得到了一种快速、高效、廉价的黄曲霉毒素样品前处理方法，与高效液相色谱结合，研发了一种价格低廉、操作简单、检出限低的食品中黄曲霉毒素的检测方法。有利于开发农作物毒素检测样品前处理，解决当前前处理方法成本高，耗时长的问题。

Description

基于FDU-12的黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其应用
技术领域
本发明属于分子印迹聚合物领域，涉及一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其农作物检测方面应用。
背景技术
农作物在生长、收获、储存和加工的过程中容易受到真菌的感染从而产生黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)，AFs属于真菌毒素的一种，是黄曲霉菌感染农作物后产生的有毒代谢产物，对人体中的一些生物系统和器官具有严重的的毒害和致癌作用作用。黄曲霉菌代谢产生的AFs会被留在农产品当中，若农产品被加工成食品，人类食用后会对人体造成损害；若农产品被加工成饲料喂养牲畜，AFs会在牲畜体内聚集，当人们使用肉类产品仍会受到AFs的危害。AFs种类较多，不同种类AFs的结构有一些差别，其中黄曲霉毒素G2，G1，B2和B1(AFG2，AFG1，AFB2和AFB1)结构类似，是AFs中对人体的毒害最大的四种。
AFs具有很好的稳定性，通过普通的光照等方法不能将农作物中的AFs分解。由于AFs对农作物的污染范围大、种类多，分布广阔，各个国家的地区的农作物都会受到AFs的污染，如花生、玉米、大豆、小麦、木耳、各种水果等。因此，世界各国和地区制定了食品中AFs的限量标准。
AFs对食品的污染问题日益受到人们的关注。如何从复杂的食品样品中快速、准确、有效的萃取分离AFs成为研究热点。针对AFs的检测有许多中方法，使用色谱法、光谱法、免疫法、生物传感器等都可以对AFs进行检测。但是实际样品的前处理过程是制约检测的灵敏度的重要因素。前处理过程既要富集目标物质，也要排除杂质的干扰，防止杂质的存在对检测的灵敏度造成影响。因此，如何建立一种快速、高效的AFs样品的前处理方法成为研究热点之一。
在检测四种AFs时，使用了多种样品前处理方法。第一种，样品前处理使用免疫亲和柱；第二种，样品前处理使用固相萃取法；第三种，样品前处理使用免疫亲和柱；第四种为酶联免疫吸附筛查法；第五种为薄层色谱法。而这五种前处理技术也是技术较为成熟的处理AFs的方法。
液液萃取法是利用有机试剂对AFs不同的溶解能力萃取AFs。因此，液液萃取法需要用到大量的有机试剂，如甲醇、乙腈等，导致前处理的成本较高，并会对环境造成危害。而且液液萃取法使用有机试剂将AFs从样品中萃取出来需耗费大量的时间。同时，由于实际样品中基质比较复杂，能够溶于有机试剂中的杂质较多，在使用液液萃取法萃取AFs的同时，有可能将其他杂质同AFs一起萃取到有机试剂中，从而影响检测结果的准确性。
固相萃取法通过吸附剂对样品中目标物和杂质的保留能力的不同，可以分离目标物和杂质。通常是将硅胶、C18等固定相装入固相萃取小柱中，制成固相萃取柱，利用柱填料对AFs的吸附能力将AFs富集到柱填料上，选取AFs的不良溶剂洗去杂质，最后用AFs的良溶剂洗脱AFs。使用固相萃取柱对AFs进行前处理可以一步完成样品的富集与净化。使用固相萃取柱对实际样品进行前处理具有以下优点：操作简便，节省试剂，重现性好，价格较低。但固定相对AFs没有特异性吸附能力，容易将其他杂质吸附到固定相上，会影响含有AFs样品的检测结果。
免疫亲和萃取法是利用生物学中抗原与抗体能够特异性识别的原理，以抗原抗体中的一方作为配基亲和吸附AFs。但是，免疫亲和柱的存放条件较为严格，需要低温进行保存，而在使用免疫亲和柱是需要在常温下使用，这就限制了免疫亲和柱的使用。而且使用免疫亲和柱检测实际样品花费较大。
酶联免疫吸附筛查法是利用酶的颜色反应对AFs进行筛查。但是酶联免疫吸附筛查法检测AFs无法做到准确定量，若检测出样品中含有AFs，还需使用其他方法进行准确定量。
现行的AFs样品前处理方法都有各自的缺点，因此，需要研发一种价格低廉、适用范围广、灵敏度高的AFs的前处理方法。
目前，使用分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)MIPs作为吸附剂，制备分子印迹固相萃取(Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction，MIPSE)柱用于样品前处理的技术受到人们的关注。使用MIPSE柱不仅操作简单，且萃取和分离能够一步完成，还具有对目标物质进行特异性吸附的能力。因此分子印迹与固相萃取相结合能够一步完成对目标分子的萃取、富集，操作简便且可以自动化处理批量样品，节省前处理时间，减少操作产生的误差，节省大量有机试剂，对环境保护有益，而且经济适用，节约检测成本，可大规模应用于食品安全、环境保护、农药残留和爆炸物检测等多个方面。
虽然分子印迹与固相萃取相结合的方法能够有效的萃取目标分子，但传统的分子印迹聚合物也存在一些缺点：不易将模板分子完全洗脱；传质速率较低；聚合物形状不规则；吸附量较低等(Wang Y,Yang Y,Lan X,et al.Bisphenol A sensing based onsurface molecularly imprinted,ordered mesoporous silica[J],ElectrochimicaActa,2011,56(5):2105-2109.；Hongliang H,Xiaoli G,Liying S,et al.Molecularlyimprinted polymers based on SBA-15for selective solid-phase extraction ofbaicalein from plasma samples[J],Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015,407(2):509-519.)，而表面印迹技术能够很好地弥补以上缺点。表面分子印迹技术常用的方法是将具有作用位点的印记聚合物接枝或包覆在载体材料表面，这样使得作用位点暴露在表面分子印迹聚合物的近表面、表面，增加传质速率和效率。相比于传统印迹技术，表面印迹聚合反应发生在载体表面，使能够对目标分子特异性识别的结合位点更多的暴露在吸附材料的表面，具有更大的比表面积，传质速率更高，有利于模板的洗脱和再次结合。
表面印迹聚合物需要合适的载体，载体的选择影响着表面印迹聚合物的吸附性能(Hu X,Xie L,Guo J,et al.Hydrophilic gallic acid–imprinted polymers overmagnetic mesoporous silica microspheres with excellent molecular recognitionability in aqueous fruit juices[J],Food Chemistry,2015,179:206-212.)。为了达到所需的形态结构，合适的粒径和孔径，载体材料的选择显得尤为重要。因此选择新型的、比表面积大、吸附能力强的载体材料，并将其应用于毒素的分析变得更有意义。常用的载体材料具备多孔性、表面可修饰等特点，目前研究较多的有氧化石墨烯、磁性四氧化三铁、碳纳米管和金属有机骨架等。其中金属有机骨架材料作为一种新型纳米材料，因其具有高稳定性、结构易于调控、易功能化、合成条件温和，引起了广泛的关注和研究。目前未见利用介孔二氧化硅FDU-12为载体制备表面分子印迹聚合物用于小麦毒素等农作物的检测。
发明内容
针对小麦等农作物中真菌毒素的样品前处理，本发明目的在于研发出一种快速、灵敏且价格低廉的黄曲霉毒素表面印迹聚合物，替代免疫亲和柱，实现小麦等农作物黄曲霉毒素的检测。
为实现本发明目的，技术方案如下：
考虑到AFs毒性极大，价格昂贵，本发明选用介孔二氧化硅FDU-12为载体，7-乙酰氧基-4-甲基香豆素为替代模板，合成了表面印迹聚合物FDU-12@MIPs。
具体通过如下方法制备而成：
(1)将煅烧过的FDU-12分散在干燥的甲苯中，加入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(Methacryloxy Propyl Trimethoxyl Silane，MPS)，在N2气氛下，加热搅拌反应，反应结束后经洗涤，干燥，得到FDU-12-MPS。
(2)FDU-12@MIPs的合成
取7-乙酰氧基-4-甲基香豆素，加入FDU-12-MPS，单体α-甲基丙烯酸(α-MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA)，再加入偶氮二异丁腈(AIBN)，超声反应，反应结束后，加入乙醇，磁力搅拌，将得到的产物置于烘箱中干燥。得目标物FDU-12@MIPs。
优选条件：模板分子7-乙酰氧基-4-甲基香豆素与α-MAA和EGDMA用量的比例(摩尔比)为：1:6:50，反应温度83℃。
将本发明合成的表面印迹聚合物FDU-12@MIPs作为自制柱填料，应用于样品中毒素的分离与分析，对小麦样品进行前处理实验，分析发现，本发明自制柱均可以良好的选择性吸附黄曲霉毒素，在选择性和吸附能力方面，本发明自制柱对黄曲霉毒素的效果表现更好。
实验表明：FDU-12@MIPs对黄曲霉毒素的吸附量较大(>3μg mL-1)，可以满足实际样品分析；FDU-12@MIPs对AFs的吸附速率较快，5min就可以达到吸附平衡。通过实验对方法进行评价：方法的线性范围是0.5μg kg-1-50μg kg-1，方法对AFG2，AFG1，AFB2和AFB1的检出限分别为0.05μg kg-1、0.06μg kg-1、0.06μg kg-1和0.05μg kg-1；定量限分别为0.15μg kg-1、0.2μg kg-1、0.2μg kg-1和0.15μg kg-1。通过加标回收实验测定：在1μg kg-1、5μg kg-1和10μg kg-1加标浓度下，四种AFs的加标回收率为82.6％-116.6％，RSD范围为2.73％-4.21％。通过FDU-12@MIPs固相萃取柱与免疫亲和柱的对比，发现自制柱对AFs的萃取能够达到替代免疫亲和柱的效果，而且成本较免疫亲和柱更低，可用于食品中AFs的分析检测。
本发明创新点：以7-乙酰氧基-4-甲基香豆素为替代模板，能够降低成本，排除模板泄漏问题，提高检测结果的准确性；以介孔二氧化硅FDU-12为载体，载体材料比表面积高，疏松多孔，结构稳定，聚合物能够接枝在载体表面；采用表面印迹技术，利用配位作用和共价键作用，将聚合物接枝在载体表面，而不是简单的包裹在载体表面，接枝的方法能够使载体与聚合物更加牢固的结合，不易使聚合物层从载体表面脱落，能更好的用于实际样品富集；合成表面印迹聚合物比表面积高、传质速率快，洗脱速率较快、重复使用性好；结合表面分子印迹与固相萃取，制备表面印迹固相萃取柱用于AFs的样品前处理，以替代AFs免疫亲和柱。将此方法结合高效液相-荧光检测器，为小麦中黄曲霉毒素的分离、分析与检测提供了一种新的低成本、低耗时以及高灵敏的检测方法。
附图说明
图1为FDU-12和FDU-12@MIPs的SEM图；A、B：FDU-12@MIPs的SEM图；C、D：FDU-12@MIPs的SEM图；
图2为FDU-12和FDU-12@MIPs的EDX图；
图3为FDU-12和FDU-12@MIPs的XRD图；
图4为FDU-12、FDU-12-MPS和FDU-12@MIPs的红外光谱图；
图5为FDU-12@MIPs的等温吸附曲线图；A：FDU-12@MIPs和FDU-12@NIPs的等温吸附曲线；B：FDU-12@MIPs和MIPs的吸附速率曲线；C：朗格缪尔吸附等温方程拟合曲线；D：伪二级动力学方程拟合曲线；
图6为FDU-12@MIPs固相萃取柱的重复使用性柱状图；
图7为实际样品检测色谱图；A：未加标大米；B：加标大米；C：未加标花生；D：加标花生；E：为未加标小麦；F：加标小麦；G：未加标玉米；H：加标玉米；
图8为FDU-12@MIPs固相萃取柱和免疫亲和柱高效液相色谱图对比图；A：AFs标样的高效液相色谱图；B：经AFs免疫亲和柱处理过的加标样品的高效液相色谱图；C：FDU-12@MIPs固相萃取柱处理过的加标样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实施例1
(1)FDU-12的合成
准确称取2.0g聚醚表面活性剂F127、2.0g均三甲苯(TMB)、5.0g氯化钾于三口瓶中，加入120mL 2mol L-1HCl溶液，40℃下搅拌24h，加入8.3g正硅酸乙酯(TetraethylOrthosilicate，TEOS)搅拌24h，继续在100℃下水热反应72h，将合成的产物过滤水洗后置于烘箱中干燥，最后将产物在550℃高温下煅烧6h。
(2)FDU-12接枝MPS
将0.5g煅烧过的FDU-12分散在50mL的干燥甲苯中，加入10mL MPS，在N2气氛下，55℃下搅拌24h，产物先用甲苯洗涤两三次，再用甲醇洗涤，干燥，得到FDU-12-MPS。
(3)FDU-12@MIPs的合成
取0.2182g(1mmol)7-乙酰氧基-4-甲基香豆素，加入3.33g FDU-12-MPS，加入0.506mL(6mmol)α-MAA、9.44mL(50mmol)EGDMA，再加入0.1292g的AIBN，超声10min后，移至三口瓶中，加入乙醇，在83℃下磁力搅拌5h，将得到的产物置于烘箱中干燥。
表面分子非印迹聚合物(FDU-12@NIPs)的合成过程如FDU-12@MIPs(不加7-乙酰氧基-4-甲基香豆素)。
(4)FDU-12@MIPs的表征
取少量合成的FDU-12和FDU-12@MIPs，使用SEM进行表征，观察聚合物表面结构，对比MIPs接枝在FDU-12前后聚合物表面结构的差别。见图1，通过扫描电镜图可以看到合成的AFs表面印迹聚合物FDU-12@MIPs的微观结构及表面情况，如图20所示。对比FDU-12@MIPs和FDU-12的扫描电镜图可以看出：FDU-12@MIPs和FDU-12的表面结构并不相同。聚合物接枝到FDU-12的表面上之后，外观发生变化，造成FDU-12@MIPs和FDU-12在扫描电镜下呈现不同的外观。可以说明MIPs接枝到了FDU-12的表面，成功合成了AFs表面印迹聚合物FDU-12@MIPs。
取少量合成的FDU-12和FDU-12@MIPs，使用EDX进行表征，通过谱图分析FDU-12和FDU-12@MIPs聚合物表面元素组成，对比MIPs接枝在FDU-12前后聚合物元素组成的差别，确定MIPs已成功接枝在FDU-12的表面。见图2和表1所示。FDU-12表面上C，O和Si三种元素所占质量百分比分别为：61.58％,19.25％和19.17％。FDU-12@MIPs表面上C，O和Si三种元素所占质量百分比分别为：90.02％，8.40％和1.58％。可以看出分布在FDU-12@MIPs表面上Si元素所占质量百分比远低于FDU-12表面上Si元素所占质量百分比。而分布在FDU-12@MIPs表面上C元素所占质量百分比远高于FDU-12表面上C元素所占质量百分比。FDU-12主要由TEOS合成，因此其表面分布较多Si元素；FDU-12@MIPs表面是聚合物层，主要由甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯合成，因此聚合物层主要含有C元素和O元素。由于聚合物层的包裹，FDU-12无法裸露在表面，因此EDX图谱上Si元素的含量极低，也说明了聚合物“覆盖”了FDU-12的整个表面。通过对比FDU-12@MIPs和FDU-12的表面元素分布图，可以得知MIPs已经成功接枝到了FDU-12的表面，成功合成了AFs表面印迹聚合物FDU-12@MIPs。
表1 FDU-12和FDU-12@MIPs表面元素分布
取少量合成的FDU-12和FDU-12@MIPs，使用XRD进行表征，分析谱图，对比MIPs接枝在FDU-12前后聚合物的差别。见图3，可以看出，在22.5°处，FDU-12和FDU-12@MIPs都有X射线衍射峰，说明FDU-12和FDU-12@MIPs具有部分相同结构，MIPs接枝FDU-12后没有改变FDU-12的结构。并且，在22.5°处，FDU-12的X射线衍射光强度为1300，要高于FDU-12@MIPs的X射线衍射光强度900，说明MIPs接枝到FDU-12表面上，聚合物层包裹了FDU-12，影响了衍射峰高度，从而使FDU-12和FDU-12@MIPs的X射线衍射光强度不同，证明了AFs表面印迹聚合物FDU-12@MIPs的成功合成。
取少量合成的FDU-12、FDU-12-MPS和FDU-12@MIPs，使用ATR-FT-IR进行表征，分析谱图，对比MIPs接枝在FDU-12前后聚合物所含官能团的差异。确定FDU-12已成功接枝MPS且MIPs已接枝在FDU-12表面。见图4，1052cm-1处吸收峰为Si-O-Si的不对称伸缩振动，806cm-1处为Si-O-Si对称伸缩振动，而443cm-1处为Si-O-Si弯曲振动，FDU-12和FDU-12@MPS在1052cm-1处、806cm-1处和443cm-1处都有强烈的吸收，说明成功合成了FDU-12。对于FDU-12@MIPs的ATR-FT-IR光谱，在1739cm-1、1453cm-1、1388cm-1和1250cm-1处的吸附峰分别属于EGDMA的C＝O、CH2、CH3和OH基团。在1739cm-1处，FDU-12@MIPs和FDU-12@MPS都有吸收峰，而FDU-12在此处没有吸收峰，FDU-12@MIPs的吸收峰来自于MPS、α-MAA和EGDMA，FDU-12@MPS的吸收峰来自于MPS，说明α-MAA和EGDMA在FDU-12表面进行了聚合反应。而且，FDU-12和FDU-12@MPS的特征吸收峰也出现在FDU-12@MIPs的ATR-FT-IR光谱图中。结果表明，在引发剂的作用下，单体α-MAA和交联剂EGDMA在FDU-12表面进行聚合反应，MIPs接枝到了FDU-12的表面，成功合成AFs表面印迹聚合物FDU-12@MIPs。
应用例1实际样品分析
(1)实际样品的制备
大米，花生，小麦，大豆和玉米样品皆从当地超市购买。使用粉碎机将样品打成粉末，过筛(<80目)。取5.0±0.1g的样品，加20mL的乙腈/水(84:16，v/v)溶液，振摇20min，玻璃纤维滤纸过滤。取4mL过滤后的溶液，并加入46mL1％的Tween-20PBS缓冲溶液，将AFs标准溶液加入样品中可配置不同浓度的上样溶液。
(2)自制柱净化
称取200mg FDU-12@MIPs用于制备分子印迹固相萃取柱。用10mL甲醇对分子印迹固相萃取柱进行活化，再用10mL蒸馏水洗去甲醇以避免甲醇将目标毒素带出而造成的对目标毒素浓度的影响。取10mL玉米实际样品提取液上样，之后用10mL水淋洗以洗去杂质。2.5mL色谱级甲醇洗脱，N2下吹干，2mL流动相溶解，用滤膜过滤，使用HPLC-FD检测溶液浓度。
(3)免疫亲和柱净化
取免疫亲和柱，等柱内液体流完后，用50mL 1ng mL-1的实际样品提取液上样，10mL水淋洗，2mL甲醇洗脱。用滤膜过滤，使用HPLC-FD检测溶液浓度。
(4)FDU-12@MIPs的吸附性能
通过等温吸附实验和吸附速率实验对FDU-12@MIPs的吸附性能进行检测，
如图5的A图所示，使用0.1μg mL-1至4μg mL-1的不同浓度的AFs测定FDU-12@MIPs和FDU-12@NIPs对AFs的吸附能力。结果表明，随着AFs初始浓度的增加，FDU-12@MIPs和FDU-12@NIPs对AFs的吸附量逐渐增加。FDU-12@NIPs对AFs的吸附在4min基本达到吸附平衡，而FDU-12@MIPs对AFs的吸附在4min仍未达到吸附平衡。在浓度为4μg mL-1时，FDU-12@MIPs和FDU-12@NIPs对AFs的最大吸附量分别超过3.0μg mg-1和1.24μg mg-1。显然，FDU-12@MIPs对AFs的吸附量比FDU-12@NIPs大得多，表明FDU-12@MIPs对AFs具有较好的吸附能力。AFs在FDU-12@NIPs上的弱吸附是由于与非印迹聚合物和介孔二氧化硅FDU-12的非特异性相互作用所致。不同于FDU-12@NIPs对AFs的非特异性吸附，FDU-12@MIPs对AFs的吸附是通过FDU-12@MIPs表面的特异性识别位点产生。FDU-12@MIPs表面的特异性识别位点的尺寸和几何结构与AFs的尺寸和几何结构是互补，而且特异性识别位点表面会与AFs的官能团形成氢键作用。
如图5的图B所示，用5μg mL-1AFs溶液检测FDU-12@MIPs和MIPs的吸附速率。FDU-12@MIPs对AFs的吸附在5分钟内达到吸附平衡，显示了表面印迹聚合物对AFs的快速吸附能力。这是由于FDU-12@MIPs的比表面积较大，而且FDU-12@MIPs对AFs的特异性识别位点大多位于FDU-12@MIPs的表面或近表面，因此在AFs接触FDU-12@MIPs表面即被吸附，达到快速吸附效果。而MIPs对AFs的吸附在10min左右才达到吸附平衡，是由于其大部分识别位点位于聚合物内部，位于MIPs内部的特异性识别位点对AFs的吸附需要更长的时间。因此，MIPs对AFs的吸附要达到吸附平衡需较长的时间，FDU-12@MIPs具有比MIPs更高的吸附速率。在对含有AFs的实际样品的预处理过程中，使用FDU-12@MIPs能够节省较多的时间，有助于提高样品预处理效率，减小实验误差。
如图5的图C所示，FDU-12@MIPs对AFs的吸附较为符合朗格缪尔等温吸附模型，具有较高R2值(0.9944)。可以表明，对AFs的吸附过程发生在吸附剂表面，而不是内部。FDU-12@MIPs表面的聚合物对AFs进行了吸附，对AFs的吸附近似单分子层吸附。说明接枝在FDU-12@MIPs表面的聚合物层较薄，能够在表面吸附溶液中的AFs，可以提高对AFs的吸附速率，因而在上样过程中更容易将AFs保留在FDU-12@MIPs上，洗脱时也更容易将吸附在FDU-12@MIPs表面的AFs洗脱下来。
如图5的图D所示，FDU-12@MIPs对AFs的吸附较为符合伪二阶动力学模型，具有较高R2值(0.9999)。可以表明，FDU-12@MIPs对AFs的吸附可能存在化学作用，而不单是物理吸附。FDU-12@MIPs表面的聚合物层上“空腔”，形状与AFs相似，表面分布有α-MAA的羟基，能够与AFs上的羰基相互作用，将AFs分子固定起来，只有破坏羟基与AFs的氢键作用，才能洗脱AFs。而FDU-12@NIPs对AFs只是单纯的物理吸附，只是利用疏松的表面吸附AFs，吸附量较低，易达到吸附平衡。因此，FDU-12@MIPs对AFs具有更好的吸附能力。
(5)重复使用性
FDU-12@MIPs的重复使用性是影响其应用价值的关键因素之一。为检测FDU-12@MIPs的重复使用性，在同一根FDU-12@MIPs固相萃取柱上重复六次活化、上样、淋洗和洗脱步骤。如图6所示，随着重复使用次数的增加，FDU-12@MIPs固相萃取柱对AFs的回收率逐渐降低，但降低的速率较慢，而且在第六个循环的回收率仍大于90％。结果表明，FDU-12@MIPs固相萃取柱对AFs的吸附/洗脱具有较高的稳定性和可重复使用性，具有较好的实用价值。
应用例2方法评价
参考国家标准对食品中AFs的限量，以样品基质液为溶剂，AFs为溶质，配置梯度浓度的AFs溶液，过FDU-12@MIPs柱，收取洗脱液进HPLC-FD检测。如表2所示，四种毒素的标准曲线线性范围为0.5μg kg-1-50μg kg-1，R2＝0.9992-0.9996，对AFG2，AFG1，AFB2和AFB1的检出限分别为0.05μg kg-1、0.06μg kg-1、0.06μg kg-1和0.05μg kg-1；定量限分别为0.15μgkg-1、0.2μg kg-1、0.2μg kg-1和0.15μg kg-1。
表2四种AFs检测方法的检出限、定量限和线性范围
为验证方法的可靠性，对四种AFs进行加标回收实验。根据优化好的FDU-12@MIPs固相萃取柱的固相萃取条件，设定1μg kg-1、5μg kg-1和10μg kg-1三个加标浓度，进行加标回收实验。
表3四种AFs的加标回收率
表4方法的精密度
由表3表4得知：在1μg kg-1、5μg kg-1和10μg kg-1加标浓度下，四种AFs的加标回收率为82.6％-116.6％，RSD范围为2.73％-4.21％。对四种AFs在三个浓度水平的加标回收率的相对标准偏差均小于国家标准方法中规定的15％，说明FDU-12@MIPs固相萃取柱用于食品中四种AFs的检测具有较好的回收率和准确度，可用于实际样品中四种AFs分析检测。
应用例3实际样品检测
为进一步验证FDU-12@MIPs固相萃取柱能够应用于实际样品的分析检测，取在室温下放置一个月的小麦、大米、玉米和花生样品作为实际样品，过FDU-12@MIPs固相萃取柱，收集洗脱液，进HPLC-FD进行检测。
如图7所示：可以看出，相同存放条件下，不同种类的样品产生的AFs种类不同，产生的毒素的含量也不同，但六种样品在放置一定时间后都会产生一定量的AFs。大米样品检测出AFB2；花生样品检测出AFG2；小麦样品检测出AFB2，玉米样品检测出AFG1，AFB2。加标前后，色谱峰高度明显不同，加标后AFs的色谱峰增高，但保留时间不变，说明FDU-12@MIPs固相萃取柱能够有效地萃取实际样品中的AFs。
应用例4自制柱与免疫亲和柱对比
为进一步验证FDU-12@MIPs固相萃取柱在食品中AFs的分析检测中的实际应用价值，将FDU-12@MIPs固相萃取柱与市面上广泛应用的AFs免疫亲和柱进行了对比。取含有相同浓度的AFs实际样品，分别过FDU-12@MIPs固相萃取柱和AFs免疫亲和柱，收集两根柱子的洗脱液，进HPLC-FD进行检测。
如图8所示：由图8的图C可以看出：FDU-12@MIPs柱对AFs富集效果较好，色谱图中四种AFs对应色谱峰分离度较好，对照标准谱图能够定性每种AFs。对比图29B和图29C可以发现FDU-12@MIPs固相萃取柱和AFs免疫亲和柱对实际样品中的AFs均有较好的萃取能力，两种萃取柱对AFG2和AFB2萃取能力相差无几，但相比于AFs免疫亲和柱，FDU-12@MIPs固相萃取柱对AFG1和AFB1有更好的萃取效果。而且FDU-12@MIPs固相萃取柱生产成本较低，价格低廉，应用前景广泛。

Claims (2)

1.黄曲霉毒素表面印迹聚合物，其特征在于，通过如下方法制备而成：
（1）将煅烧过的FDU-12分散在干燥的甲苯中，加入3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS），在N2气氛下，加热搅拌反应，反应结束后经洗涤，干燥，得到FDU-12-MPS；
（2） FDU-12@MIPs的合成
取7-乙酰氧基-4-甲基香豆素，加入FDU-12-MPS，单体α-甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯，再加入偶氮二异丁腈，超声反应，反应结束后，加入乙醇，磁力搅拌，将得到的产物置于烘箱中干燥，得目标物FDU-12@MIPs。
2.如权利要求1所述的黄曲霉毒素表面印迹聚合物，其特征在于，模板分子7-乙酰氧基-4-甲基香豆素与α-甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为：1:6:50，反应温度83℃。
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