CN110156938A - 槲皮素表面印迹聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属分子印迹聚合物领域，涉及一种槲皮素表面印迹聚合物及其在小麦等农作物毒素检测中的应用。其槲皮素为替代模板，选用UIO‑66‑NH2作为表面印迹的载体材料，采用化学接枝法制备出面印迹聚合物。将合成的聚合物用作吸附剂制备表面印迹固相萃取柱，对食品中黄曲霉毒素进行萃取和分离，形成一种简便快速，高效灵敏的检测小麦样品中黄曲霉毒素的分析方法。通过与商品柱和免疫亲和柱对比分离富集效果，本发明聚合物可以择性吸附黄曲霉毒素，在选择性和吸附能力方面对黄曲霉毒素的效果表现更好。有利于开发农作物毒素检测样品前处理，解决当前前处理方法成本高，耗时长的问题。

Description

槲皮素表面印迹聚合物及其应用
技术领域
本发明属分子印迹聚合物领域，涉及一种槲皮素表面印迹聚合物及其在小麦等农作物毒素检测中的应用。
背景技术
玉米、小麦、大米、大豆、饲料等农作物在储存及加工过程中容易受到真菌毒素的污染，较为常见的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素(ochratoxins)等。人类在食用被真菌污染的粮食会使真菌毒素进入人体；动物在摄入了霉变的农作物或其加工产品(例如：饲料)以后，真菌毒素能够沉积于家禽和家畜的体内，经过食物链的传递，最终会进入人体，最终在真菌毒素的影响下损害人体器官，危害人体生命健康。在常见的真菌毒素中，AFT受到了广泛的关注和研究，它几乎能够污染所有的农作物，是一组具有相似结构的香豆素衍生物，目前食品安全限定的主要是四种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，经过大量的流行病学调查，AFT的摄入量若总是维持在高水平状态，则肝癌发病的几率也大大增大。
真菌毒素对生活质量的影响很大，因此，急需针对真菌毒素的污染建立一种不仅灵敏、高效，而且具备简单、快速、低廉等优点的检测方法，但是由于实际样品形态各异，不能直接用于液相检测。且样品基质成分复杂，对检测的干扰也多，而真菌毒素含量通常很低，故需使用样品前处理对实际样品进行分离与富集。
检测分析真菌毒素的方法中，固相萃取法(Solid-Phase Extraction，SPE)使用最为广泛，它能减少溶剂的使用，既能净化样品，同时又能富集样品，从而提高检测结果的准确性。但SPE法也存在以下缺点：本身容易堵塞、填料选择范围有限，只能用于分离保留性质有很大差别的化合物，柱性能受pH值、溶剂种类及离子强度等因素影响。目前我国规定及常用的毒素样品处理手段仍以免疫亲和柱(Immunoaffinity Chromatography，IAC)处理为主，IAC是利用了酶联免疫的原理，不仅净化效果好，又具有富集作用。但其存在较大弊端，由于其价格昂贵，无法重复使用，且不易保存的特性使得这种方法无法应用于多样品的大通量筛查与检测。IAC法也无法实现对多种不同结构毒素的同时测定，结果准确性远远不如单一种类。因此，寻找一种可以解决以上问题，有效替代IAC作为样品前处理的处理材料作为研究重点。
近来年新发展起来的分子印迹技术以其特异性的选择吸附能力，重复性高，受样品基体干扰小，价格低廉等优点，被广泛应用于分子印迹固相萃取领域。该技术弥补了固相萃取与免疫亲和柱的缺点，作为一种分离技术，既有高选择性，生产成本又低。将聚合反应制得的印迹聚合物用作固相萃取柱的柱填料，用于食品中真菌毒素的样品前处理过程，已经成为一种新的趋势。
传统的分子印迹聚合物存在对目标分子结合位点有限、传质速度低、模板不能完全去除及重新结合能力低等问题，无法完全发挥分子印迹技术的特性与能力，因此需对分子印迹技术进行改进。近年来发展起来的表面分子印迹技术是相对与传统的分子印迹技术的重要改进类型之一，并受到了人们的广泛关注。
表面分子印迹技术与传统分子印迹的不同之处是聚合直接发生在载体材料表面。常用的方法是将具有作用位点的印记聚合物接枝或包覆在载体材料表面，这样使得作用位点暴露在表面分子印迹聚合物的近表面、表面，增加传质速率和效率。为了达到所需的形态结构，合适的粒径和孔径，载体材料的选择显得尤为重要。因此选择新型的、比表面积大、吸附能力强的载体材料，并将其应用于毒素的分析变得更有意义。常用的载体材料具备多孔性、表面可修饰等特点，目前研究较多的有氧化石墨烯、磁性四氧化三铁、碳纳米管和金属有机骨架等。其中金属有机骨架材料作为一种新型纳米材料，因其具有高稳定性、结构易于调控、易功能化、合成条件温和，引起了广泛的关注和研究。目前未见利用金属有机骨架材料做为载体制备表面分子印迹聚合物用于小麦毒素的检测。
发明内容
针对小麦等农作物中真菌毒素的样品前处理，本发明目的在于研发出一种快速、灵敏且价格低廉的槲皮素表面印迹聚合物，替代免疫亲和柱，实现小麦等农作物黄曲霉毒素的检测。
为实现本发明目的，技术方案如下：
由于真菌毒毒性大，价格高无法直接作为模板分子进行试验，本发明使用替代模板分子印迹技术，选用与黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的结构均有相似官能团的槲皮素为替代模板，选用UiO-66-NH2为载体材料，化学接枝法引入新单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，将表面印迹技术和替代模板技术相结合，制备出表面印迹聚合物(UiO-66-NH2@MIPs)。
具体通过如下方法制备而成：
(1)UiO-66-NH2载体材料的修饰
将UiO-66-NH2溶解于THF中，向溶液中添加甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)。将混合物溶液加热搅拌，过滤回收固体，固体经洗涤，干燥得UiO-66-NH2@GMA。
(2)表面印迹聚合物的制备
将UiO-66-NH2@GMA超声分散于无水乙醇中，加入槲皮素和丙烯酰胺。然后将乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入上述混合物中，加热搅拌反应，经真空过滤，洗涤，烘干。
模板分子槲皮素的氧原子能与功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的氢原子形成氢键。单体用量的多少，不仅会影响反应时间，也会影响反应产率，模板与单体的比例会对实验产生影响，比例过小会使聚合物的结合位点降低，最终影响着聚合物的吸附量。
在聚合反应中，交联剂有着重要的作用。若交联剂用量较少会使功能单体形成大量单链聚合，聚合强度不够，聚合物产率过低；若交联剂用量过多会使交联发生过快，聚合物结构过于紧密，空穴减少，降低聚合物吸附能力。
载体材料用量的优化见表1：
表1不同载体材料用量下合成的聚合物的吸附量
可以看出，加入载体材料后聚合物的吸附量均有提升，且当加入量为0.8g时吸附量提升最大，此时的吸附量分别为17.83mg g-1、17.59mg g-1。
通过单因素优化、正交试验得出，合成表面印迹聚合物的较优条件如下：
槲皮素：丙烯酰胺：乙二醇二甲基丙烯酸酯(物质的量之比)＝1：7：15,引发剂偶氮二异丁腈用量为丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯质量和的2％，载体材料UiO-66-NH2@GMA的添加量为0.8g，反应温度为88℃，反应时间5h，将本发明合成的表面印迹聚合物作为自制柱填料，应用于样品中毒素的分离与分析，此条件下吸附量为17.83mg g-1。
本发明创新点在于：选用替代模板技术解决以毒素为模板的弊端，选用经修饰的新型载体材料与分子印迹结合制备表面分子印迹聚合物，改善传统印迹聚合物的缺点，将聚合物制备成柱与免疫亲和柱对比，弥补了固相萃取柱与免疫亲和柱的不足，为样品前处理中替代免疫亲和柱提供了可能。
以本发明自制柱对小麦样品进行前处理实验，分析发现，自制柱均可以良好的选择性吸附黄曲霉毒素，在选择性和吸附能力方面，本发明自制柱对黄曲霉毒素的效果表现更好。
对比本发明自制柱、免疫亲和柱和商品固相萃取柱对小麦中黄曲霉毒素的处理效果，结果表明：本发明自制柱对含有黄曲霉毒素的实际样品具有更好的处理效果；同时将此方法结合高效液相-荧光检测器，为小麦中黄曲霉毒素的分离、分析与检测提供了一种新的低成本、低耗时以及高灵敏的检测方法。
对比表面印迹聚合物和印迹聚合物的吸附性能，吸附速率的测定结果表明，本发明表面印迹聚合物的吸附速率能在5min内就能达到吸附平衡，较快的传质速度有利于固相萃取柱对样品的处理。等温吸附实验中，在一定浓度的溶液中本发明表面印迹聚合物呈现出较好的吸附曲线，且MOFs@MIPs的最大吸附量为13.2mg g-1大于MIPs的最大吸附量7mg g-1，说明本发明MOFs@MIPs的吸附能力优于MIPs。
对小麦中黄曲霉毒素的加标回收实验中，本发明自制柱表现出良好的准确度和精密度，当加标浓度分别为0.5ng mL-1、0.8ng mL-1、1.0ng mL-1时，四种黄曲霉毒素的回收率范围为74.3％-98.6％，其相对标准偏差(RSD)范围为0.99％-5.85％。四种黄曲霉毒素的标准曲线的线性相关系数均接近0.999，具有较低的检出限(0.05-0.11ng mL-1)和定量限(0.20-0.35ng mL-1)。该方法可靠和可行，方便快捷且灵敏高效，可以用来替代传统的免疫亲和柱处理分析方法。
附图说明
图1为本发明化学接枝法合成步骤示意图；
图2为物理包覆MOFs@MIPs扫描电镜图(a:10000×，b:50000×)；由图a和图b可以观察到MIPs部分包裹在MOFs材料的表面，从而使聚合物的比表面积有所增大。但图中仍可看出有部分零散的碎片为没有包裹上的MIPs颗粒及散落的MOFs材料，说明物理包裹合成表面聚合物的方法并未达到预期的效果。且物理包裹法制备的表面印迹聚合物产物形态并不稳定，要获得均匀合适的聚合物材料不易控制。
图3为本发明化学接枝MOFs@MIPs扫描电镜及透射电镜图；其中a和b为MOFs材料的透射电镜图(200000×，100000×)，c和d为MOFs@MIPs的透射电镜图(10000×，50000×)，e和f为MOFs@MIPs的扫描电镜图(10000×，20000×)。由图a和图b可以观察到MOFs材料为八面体结构，由图c和图d可以看出MIPs已经包裹在MOFs材料的表面，从而聚合物的比表面积显著增大，且其结构疏松多孔，说明包裹效果好，由图e和图f可以看出MOFs@MIPs材料颗粒均匀，粒径较小适合作为固相萃取柱填料。
图4为MOFs和MOFs@MIPs的粒径分布图；
图5为MIPs、MOFs和MOFs@MIPs的红外光谱图；由图可知，MIPs在1732cm-1处有吸收峰，这是由羰基的C＝O双键引起的，1270cm-1处的吸收峰是由C-O的伸缩振动引起的。MOFs材料中3500cm-1附近的吸收峰是由二氨基对苯二甲酸的O-H以及N-H的伸缩振动引起的，1397cm-1处的吸收峰是由C-H引起的，指纹区750cm-1附近为MOFs材料的特征吸收峰。而在MOFs@MIPs聚合物中可以看出，既有MIPs的C＝O吸收峰，也有C-O吸收峰，同时包含MOFs材料的所有特征吸收峰，同时在3500cm-1附近的吸收峰有所降低则是由于新化学键的形成使原化学键发生断裂，说明合成的表面印迹聚合物中，MIPs很好的通过化学键接枝于MOFs材料的表面。
图6为MOFs和MOFs@MIPs的X射线单晶衍射图；由图可以看出，MOFs@MIPs的XRD谱图中的反射峰与纯MOFs晶体微球的反射峰相匹配，特征反射峰均有出现，这证实MIPs成功的接枝与MOFs材料的表面。同时由于MOFs材料与分子印迹聚合物的键合作用，使MIPs成功接枝于MOFs表面，导致MOFs@MIPs材料的反射峰相对降低，同时降低程度并不严重也证明了MIPs是以薄层状态形成于MOFs材料表面，表明两种材料的成功接枝。
图7为MIPs和MOFs@MIPs对伊索克酸的等温吸附图；由图可知，随着槲皮素浓度的增加，MIPs和MOFs@MIPs对槲皮素的吸附量也在不断增加，当浓度为50μgmL-1时，MOFs@MIPs的吸附量达到13.2mg g-1，MIPs的吸附量在7mg g-1左右，可以看出MOFs@MIPs对槲皮素的吸附量远远大于MIPs对槲皮素的吸附量，说明合成的表面印迹聚合物效果较好，吸附能力强于分子印迹聚合物。
图8为MIPs和MOFs@MIPs对槲皮素的吸附速率图；图可以看出，两种聚合物在反应初始时期，特别是在聚合物和模板溶液接触后的五分钟内，吸附速率变化较大，吸附速率较快，在5min左右两种聚合物均能达到吸附平衡，吸附量达到最大值并在吸附后期趋于稳定，在吸附后的5min至15min期间，两种反应物的吸附量几乎没有变化。同时在整个吸附平衡过程中，MOFs@MIPs对槲皮素的吸附能力始终大于MIPs对槲皮素的吸附能力。
图9为本发明自制柱使用性结果图；
图10为免疫亲和柱、自制MOFs@MIPs柱及商品固相萃取柱萃取性能比较图；
图11为小麦样品MOFs@MIPs自制柱分离提取高效液相色谱图；a：新鲜小麦样品；b：发霉小麦样品MIPs柱处理；c：发霉小麦样品MOFs@MIPs柱处理。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实施例1
(1)UiO-66-NH2载体材料的合成
将ZrCl4(0.84g；3.60mmol)溶解于DMF(40ml)中，向溶液中加入浓HCl(8ml)，超声振荡20min，130℃磁搅拌2h，冷却至室温。将2-氨基对苯二甲酸(0.84g，4.65mmol)溶解于DMF(40ml)中并倒入ZrCl4溶液中。最后的混合物在50℃磁搅拌24小时，然后真空过滤分离黄色固体，用DMF洗涤三次，用氯仿交换溶剂。将黄色化合物在80℃真空中加热24小时。
(2)载体材料的修饰
超声将UiO-66-NH2(0.60g)溶解于THF(50ml)中20min，并向溶液中添加GMA(2.12ml，16mmol)。将混合物溶液在60℃反应温度下，磁力搅拌24小时，过滤回收黄色固体，用四氢呋喃洗涤数次，用氯仿交换溶剂。最后，在室温下干燥得黄色粉末状UiO-66-NH2@GMA。
(3)表面印迹聚合物的制备
将UiO-66-NH2@GMA(0.5g)超声分散于100ml无水乙醇中15min，加入槲皮素(0.13g，0.5mol)和丙烯酰胺(0.22g，3mmol)。最后，将(1.88ml，10mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.05g的偶氮二异丁腈经超声振动20min后加入上述混合物中，反应温度为80℃下机械搅拌反应7h，经真空过滤后，用乙醇洗涤数次，在80℃恒温烘箱中烘干12小时，备用。
按照相同的条件和方法，在不添加载体材料的情况下合成印迹聚合物(MIPs)。
用激光粒度分布仪对MOFs材料和合成的MOFs@MIPs进行检测，观察聚合物的粒度大小及分布情况。图4中，a为MOFs的粒径图，粒度分布范围为0.209～7.586μm，平均粒径是2.916μm。图中b为MOFs@MIPs的粒径图，粒度分布范围为1.660～13.183μm，平均粒径是4.736μm。与MOFs的粒径相比，MOFs@MIPs的粒径有所增大，说明MIPs在MOFs材料上包裹了薄薄的一层，导致粒度范围的少许偏移。且表面印迹聚合物粒径均较小，适合用于固相萃取柱的柱填料。
应用例1
黄曲霉毒素实际样品分析
(1)样品提取：分别称取25g小麦实际样品(新鲜小麦样品和发霉小麦样品)置于锥形瓶中，加入5g NaCl，加入125mL提取液(甲醇:水＝7:3，V/V)，振荡器震荡1h，用定量滤纸过滤。加水将溶液稀释3倍，将稀释液通过玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清。低温保存备用。
(2)固相萃取柱的制备：分别准确称取100mg MIPs和MIPs@MOFs，用甲醇湿法装于直径8mm，长8cm的固相萃取小柱中，萃取柱顶端和底部均用聚四氟乙烯隔垫封口。柱子使用前先用10mL甲醇进行活化，再用5mL蒸馏水洗脱甲醇。然后分别取10mL样品上样，控制流出液以每2～3秒一滴的速度流出。待溶液全部流出后，再用10mL的水淋洗柱子。再准确加入3mL洗脱液(乙腈:水＝9:1)洗脱，将收集的洗脱液联合高效液相色谱-荧光检测器进行检测。
其结果如图11：由图可以看出，在新鲜小麦样品中未检测到黄曲霉毒素，而对于发霉的小麦样品无论用MIPs柱和MOFs@MIPs柱进行处理均检测到黄曲霉毒素的存在，包括AFG2、AFB2和AFB1三种毒素。还可以看出对于同样的小麦样品，MOFs@MIPs柱的分离富集效果更优。
应用例2
1、方法的线性范围、检出限和定量限
利用小麦空白样品提取液制备了一系列浓度为0.5～500ng ml-1的基质匹配标准溶液。通过色谱峰面积和各标准溶液浓度的线性回归分析，建立了黄曲霉毒素的标准曲线。表2给出了校准曲线和相关系数，以及该方法的定量限和检测限。
表2四种黄曲霉毒素的标准曲线
通过表2可以看出，标准曲线的线性相关系数均接近0.999，说明四种黄曲霉毒素的标准曲线均表现出良好的线性，同时对于四种黄曲霉毒素均具有较低的检出限(0.05-0.11ng mL-1)和定量限(0.20-0.35ng mL-1)。可以作为后续实验回收率的计算标准。
2、方法的精密度和准确度
为了验证建立方法的准确性，进行了三个浓度六个水平的加标回收实验。加标浓度分别为0.5ng mL-1、0.8ng mL-1、1.0ng mL-1，得到加标回收回收率和精密度的表格如下：
表3四种黄曲霉毒素加标回收实验(n＝6)
表3列出了加标浓度为0.5，0.8，1.0ng mL-1时的回收率和相对标准偏差(RSD)。如表所示，通过高效液相色谱-荧光检测加标样品中黄曲霉毒素的浓度，计算不同加标情况下黄曲霉毒素的回收率。当加标浓度分别为0.5ng mL-1、0.8ng mL-1、1.0ng mL-1时，AFG2的回收率范围为78.2％-96.4％，其相对标准偏差(RSD)范围为1.52％-3.14％；AFG1的回收率范围为77.1％-98.6％，其相对标准偏差(RSD)范围为1.07％-3.09％；AFB2的回收率范围为74.3％-95.9％，其相对标准偏差(RSD)范围为2.43％-5.85％；AFB1的回收率范围为85.6％-97.1％，其相对标准偏差(RSD)范围为0.99％-4.51％。通过结果可以看出该方法是具有可行性的，能够用于同时处理实际样品中四种黄曲霉毒素，可应用于小麦样品中四种黄曲霉毒素的分析与检测。
3、柱子重复使用性
为验证自制柱的重复使用能力对柱子进行了重复使用实验。由图9知，对MOFs@MIPs柱子重复使用10次，将洗脱液用高效液相-荧光检测器进行测定，计算其回收率，得到结果如图所示，在10次重复使用中，柱子的回收率在逐渐降低，前8次在90％以上，在第9次时，回收率降低到了90％以下。可已看出自制固相萃取柱具有良好的重复使用性能，可以在样品前处理中不影响吸附效果的情况下多次使用，有效降低了在样品前处理过程中的成本消耗。
4、自制柱与商品柱的比较
以小麦为基质，加标浓度为10ng mL-1，上样10mL分别注入到自制柱与免疫亲和柱中，淋洗液为3mL水，洗脱液为3mL色谱乙腈。随后用配有荧光检测器的高效液相色谱检测，得到高效液相色谱图如图10。
由色谱图可以看出，在完全相同的条件下自制柱虽然有杂峰但是并不影响黄曲霉毒素出峰，自制柱的信号强度明显高于免疫亲和柱，表明自制柱对黄曲霉毒素的分离富集效果明显优于免疫亲和柱，同时其他商品固相萃取柱(C18柱,Silica柱及Florisil柱)的分离富集效果明显较差，只能提取个别黄曲霉毒素不能有效分离提取出四种黄曲霉毒素，且提取效果相对较差，因此自制柱可以替代免疫亲和柱及商品固相萃取柱作为黄曲霉毒素样品前处理的固相萃取柱。

Claims (2)

1.一种槲皮素表面印迹聚合物，其特征在于，通过如下方法制备而成：
（1）UiO-66-NH2载体材料的修饰
将UiO-66-NH2溶解于THF中，向溶液中添加甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），加热搅拌，过滤回收固体，固体经洗涤，干燥得UiO-66-NH2@GMA；
（2）表面印迹聚合物的制备
将UiO-66-NH2@GMA超声分散于无水乙醇中，加入槲皮素和丙烯酰胺；然后将乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入上述混合物中，加热搅拌反应，经真空过滤，洗涤，烘干。
2.如权利要求1所述的槲皮素表面印迹聚合物，其特征在于，槲皮素：丙烯酰胺：乙二醇二甲基丙烯酸酯物质的量之比=1：7：15；引发剂偶氮二异丁腈用量为丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯质量和的2%，载体材料UiO-66-NH2@GMA的添加量为0.8 g，反应温度为88℃，反应时间5h。
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