CN114984242A - 通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物制备技术领域，具体为一种通过泛素‑蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，包括通过泛素‑蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物以及一种包载槲皮素的Uio‑66纳米颗粒的制作方法，通过泛素‑蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物包括槲皮素、姜黄素、芹菜素、乳胞素、表没食子儿茶素没食子酸酯、金雀异黄素等受限于水溶性差，生物利用度低难发挥其作用的天然化学成分，本发明所涉及的纳米载药系统QUE@Uio‑66NPs，可利用纳米颗粒自身的EPR效应被动靶向到肿瘤细胞并在这里发挥作用，发挥其多重药理作用抗肿瘤，这种充分抑制肿瘤细胞内蛋白质降解途径，导致细胞内蛋白质稳态失衡，最终诱导细胞凋亡的抗肿瘤方式是创新性的。

Description

通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，具体为一种通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法。
背景技术
众所周知，肿瘤疾病是全球第二大死亡原因，目前尚无完全治愈方法。手术切除往往只针对良性肿瘤和早期的恶性肿瘤，对高转移性恶性肿瘤和血液肿瘤没有作用。针对肿瘤快速分裂的特性，选用干扰DNA复制的化学药物易产生毒副作用，进一步损伤机体，且易诱导肿瘤细胞产生耐药性，最后无药可医。放射治疗同样不具有选择性，在杀伤肿瘤细胞时对放射部位周围正常细胞造成损伤，且成本较高，不适用于广泛的肿瘤治疗。因此，鉴于肿瘤治疗的复杂性，多靶点联合治疗成为肿瘤治疗的热门。
随着细胞生理学逐渐发展，越来越多的分子机制被研究清楚，针对细胞的生理机制和信号通路之间的相互关系筛选相应药物成为肿瘤治疗发展的方向。泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。蛋白酶体在肿瘤发生的许多过程中起着关键作用，如细胞周期调节、细胞凋亡、血管生成、受体下调、细胞内运输、细胞信号转导以及对环境刺激的响应。目前，蛋白酶体抑制剂已经被证明可以抑制肿瘤生长，且相应的药物也已经问世并应用于临床。但效果不佳，原因可能是细胞内存在另一种机制可以代偿性弥补被抑制的蛋白质降解，恢复蛋白质稳态。这种机制就是自噬。自噬是一种进化保守的代谢途径，使真核细胞能够降解并回收细胞组分进行再利用，它与泛素-蛋白酶体系统相辅相成共同调控细胞内的蛋白质稳态。因此，同时抑制两种蛋白质回收降解系统，导致肿瘤细胞内蛋白质稳态失调，进一步导致凋亡可能是一种有希望的治疗方式。
槲皮素是一种天然黄酮类化合物，分子式C15H10O7，化学名3,3',4',5,7-五羟基黄酮。国内外多项研究证明，槲皮素具有广泛的抗肿瘤作用。前期实验证明，槲皮素可以抑制蛋白酶体的三种催化活性，发挥其抗肿瘤活性。但槲皮素水溶性差，稳定性差，生物利用度低，是限制其药用价值的主要障碍。纳米载药系统传递槲皮素等药物方面表现出了强大的优势，包括高包封效率、延长循环时间、提高生物利用度，同时因为纳米颗粒的独特的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR效应)使得抗肿瘤药物可以富集于肿瘤部位。
在种类繁多的纳米载体中，金属有机框架材料(MOFs)具有尺寸可控、比表面积大、载药量高、生物相容性高等优点，其中，由Zr2+作为金属基，对苯二甲酸作为有机骨架，2008年由奥斯陆大学Cavka课题组合成的Uio-66，具有较出众的水热稳定性和化学稳定性。比表面积一般在1200m2/g左右。之前的研究工作已经证明Uio-66的生物安全性较好，细胞毒性很小，是良好的生物载药材料。因此，本专利以槲皮素作为蛋白酶体抑制剂，以金属有机框架Uio-66为纳米载药系统，制备了一种粒径合适、形态均一、单分散性好的包载槲皮素的Uio-66纳米颗粒(QUE@Uio-66 NPs)，同时配合传统自噬抑制剂氯喹(CQ)通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤，并进行体内体外效果评价。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法包括通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物以及一种包载槲皮素的Uio-66纳米颗粒的制作方法，所述通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物包括槲皮素、姜黄素、芹菜素、乳胞素、表没食子儿茶素没食子酸酯、金雀异黄素等受限于水溶性差，生物利用度低难发挥其作用的天然化学成分，所述一种包载槲皮素的Uio-66纳米颗粒的制作方法包括以下步骤：
第一步：将称取一定量槲皮素溶解于乙醇，与Uio-66按照一定质量比混合，超声分散均匀后置于4℃环境下振荡20-30小时；
第二步：将上述分散系离心，弃去多余乙醇，再用乙醇洗三遍，真空冻干机中冷冻干燥；
第三步：将上述冻干粉末称取一定量，分散于5％葡萄糖中，获得QUE@Uio-66 NPs制剂，能用于细胞试验也能用于静脉注射；
第四步：将一定量氯喹溶解于二甲基亚砜中，在保证二甲基亚砜含量不超过1％的情况下，可加以细胞培养基进行细胞试验，获得细胞用氯喹；
第五步：将一定量氯喹溶解于二甲基亚砜中，然后加入无菌无酶水，PEG300，使其比例为5:55:40，混合均匀制得静脉注射用氯喹；
第六步：在进行试验时，将QUE@Uio-66 NPs与氯喹制剂同时施用于细胞或肿瘤动物模型；
为了保证本发明的准确度，本发明改进有，所述第一步中的振荡时间为24小时；
所述第六步中的试验包括以下几个步骤：
准备实验器材：
(1)实验材料，细胞株:4T1小鼠乳腺癌细胞；
(2)实验仪器，细胞培养箱，多功能酶标仪；
(3)实验试剂，细胞培养基及胎牛血清(FBS)，0.25％肤酶、青链霉素CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，AnnexinⅤ-fitc细胞凋亡检测试剂盒，蛋白酶体活性检测试剂盒，相关抗体。
槲皮素和氯喹；
Uio-66；
实验Balb/c小鼠；
下面试验例中氯喹溶液、Que@Uio-66溶液均为培养基溶液,培养基溶于DMSO/5％葡萄糖的质量百分比不大于0.5％。
第一步，细胞活力检测：按照1×104细胞数量铺设96孔板于黑色96孔板，待12小时后细胞贴壁后按实验设计给与药物处理，QUE@Uio-66 NPs配制成25、50、100、200、500μg/mL的梯度浓度，另一组在QUE@Uio-66 NPs的基础上添加30μM的CQ，同时设置对照组，24小时后，取出细胞培养板在室温平衡10分钟，96孔板每孔加入100μl CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解，室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定，使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测；
第二步，细胞凋亡检测：按照1×105细胞数量铺设6孔板，待12小时后细胞贴壁后按实验设计给与药物处理，其中Uio-66和QUE@Uio-66 NPs均为500μg/ml，CQ均为30μM，同时设置对照组。24小时后，取其培养液保留于EP管中，消化2分钟，再用其原来的培养液中止消化；
第三步，蛋白酶体活力测定：铺2×106个细胞于6孔板，待12小时贴壁后分别加入药物处理。QUE@Uio-66 NPs的剂量为200μg/ml,CQ的剂量为30μM，24小时后收集细胞，弃去培养基，用PBS洗一次，放在冰上，使用500μL的0.5％NP-40将细胞裂解，混匀，取裂解液于EP管中，13000rpm，4℃离心10-15分钟，去上清放于冰上备用；
第四步，自噬体和自噬溶酶体电镜观察：将1×105细胞接种于6孔板，待其12小时贴壁后加入药物处理，QUE@Uio-66 NPs为200μg/ml,CQ是30μM，12小时后，弃去培养基，PBS清洗一次，用2.5％戊二醛和2％多聚甲醛混合固定液固定，4℃固定12h以上，封口后送往清华大学制作超薄切片，农科院原子能所电镜观察拍照。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，具备以下有益效果：
本发明所涉及的纳米载药系统QUE@Uio-66 NPs，可利用纳米颗粒自身的EPR效应被动靶向到肿瘤细胞并在这里发挥作用，且纳米负载的方式可以大大提高槲皮素的生物利用度，发挥其多重药理作用抗肿瘤。而且，这种充分抑制肿瘤细胞内蛋白质降解途径，导致细胞内蛋白质稳态失衡，最终诱导细胞凋亡的抗肿瘤方式是创新性的。最后，利用槲皮素和氯喹这种天然药物活性成分作为抗肿瘤药物较传统化疗药物具有靶点多，毒性低等特点。
附图说明
图1显示了QUE@Uio-66 NPs的透射电镜图和扫描电镜图；
图2显示了不同剂量QUE@Uio-66 NPs和QUE@Uio-66 NPs+CQ处理后4T1的相对细胞活性；
图3显示了QUE@Uio-66 NPs+CQ对4T1细胞诱导细胞凋亡的作用；
图4显示了QUE@Uio-66 NPs对细胞蛋白酶体活力的抑制作用；
图5显示了QUE@Uio-66 NPs+CQ对自噬通路影响的直接观察；
图6显示了QUE@Uio-66 NPs+CQ对自噬的启动和晚期抑制情况；
图7显示了QUE@Uio-66 NPs+CQ对肿瘤大小的抑制；
图8显示了QUE@Uio-66 NPs+CQ对肿瘤生长的长期抑制情况；
图9显示了在组织病理上观察QUE@Uio-66 NPs+CQ对肿瘤的治疗情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-9，通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法包括通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物以及一种包载槲皮素的Uio-66纳米颗粒的制作方法，所述通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物包括槲皮素、姜黄素、芹菜素、乳胞素、表没食子儿茶素没食子酸酯、金雀异黄素等受限于水溶性差，生物利用度低难发挥其作用的天然化学成分，所述一种包载槲皮素的Uio-66纳米颗粒的制作方法包括以下步骤：
第一步：将称取一定量槲皮素溶解于乙醇，与Uio-66按照一定质量比混合，超声分散均匀后置于4℃环境下振荡20-30小时；
第二步：将上述分散系离心，弃去多余乙醇，再用乙醇洗三遍，真空冻干机中冷冻干燥；
第三步：将上述冻干粉末称取一定量，分散于5％葡萄糖中，获得QUE@Uio-66 NPs制剂，能用于细胞试验也能用于静脉注射；
第四步：将一定量氯喹溶解于二甲基亚砜中，在保证二甲基亚砜含量不超过1％的情况下，可加以细胞培养基进行细胞试验，获得细胞用氯喹；
第五步：将一定量氯喹溶解于二甲基亚砜中，然后加入无菌无酶水，PEG300，使其比例为5:55:40，混合均匀制得静脉注射用氯喹；
第六步：在进行试验时，将QUE@Uio-66 NPs与氯喹制剂同时施用于细胞或肿瘤动物模型；
为了保证本发明的准确度，本发明改进有，所述第一步中的振荡时间为24小时；
所述第六步中的试验包括以下几个步骤：
准备实验器材：
(1)实验材料，细胞株:4T1小鼠乳腺癌细胞；
(2)实验仪器，细胞培养箱，多功能酶标仪；
(3)实验试剂，细胞培养基及胎牛血清(FBS)，0.25％肤酶、青链霉素CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，AnnexinⅤ-fitc细胞凋亡检测试剂盒，蛋白酶体活性检测试剂盒，相关抗体。
槲皮素和氯喹；
Uio-66；
实验Balb/c小鼠；
下面试验例中氯喹溶液、Que@Uio-66溶液均为培养基溶液,培养基溶于DMSO/5％葡萄糖的质量百分比不大于0.5％。
第一步，细胞活力检测；
第二步，细胞凋亡检测；
第三步，蛋白酶体活力测定；
第四步，自噬体和自噬溶酶体电镜观察；
综上所述，称取100mg的槲皮素倒入10ml乙醇中，超声振荡溶解，加入100mg Uio-66，然后恒温摇床中4℃振荡10h，取出后在离心机里以100000rpm离心20min，弃去上清液，再用乙醇分散，离心，如此洗涤三次，弃去上清后冷冻干燥成粉末。制得QUE@Uio-66。图1为该纳米颗粒的透射电镜和扫描电镜图，可见该纳米颗粒为六边形，形状均匀，大小均一，尺寸在250nm左右。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明。下面实施例中采用的实验材料及仪器如下:
(1)实验材料，细胞株:4T1小鼠乳腺癌细胞；
(2)实验仪器，细胞培养箱，多功能酶标仪；
(3)实验试剂，细胞培养基及胎牛血清(FBS)，0.25％肤酶、青链霉素CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，AnnexinⅤ-fitc细胞凋亡检测试剂盒，蛋白酶体活性检测试剂盒，相关抗体。
槲皮素和氯喹；
Uio-66；
实验Balb/c小鼠；
下面试验例中氯喹溶液、Que@Uio-66溶液均为培养基溶液,培养基溶于DMSO/5％葡萄糖的质量百分比不大于0.5％；
(1)细胞活力检测：按照1×104细胞数量铺设96孔板于黑色96孔板，待12小时后细胞贴壁后按实验设计给与药物处理。QUE@Uio-66 NPs配制成25、50、100、200、500μg/mL的梯度浓度。另一组在QUE@Uio-66 NPs的基础上添加30μM的CQ。同时设置对照组。24小时后，取出细胞培养板在室温平衡10分钟，96孔板每孔加入100μl CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解。室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定。使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。细胞活力按如下公式计算。图2为实验结果显示，随着QUE@Uio-66 NPs浓度的增加，细胞活力跟着逐渐降低。而且，与QUE@Uio-66 NPs单处理组相比，QUE@Uio-66 NPs+CQ联合治疗组的细胞活力都显著降低。表明了QUE@Uio-66 NPs+CQ确实有协同抗肿瘤效果。
(2)细胞凋亡检测：按照1×105细胞数量铺设6孔板，待12小时后细胞贴壁后按实验设计给与药物处理。其中Uio-66和QUE@Uio-66 NPs均为500μg/ml，CQ均为30μM。同时设置对照组。24小时后，取其培养液保留于EP管中，消化2分钟，再用其原来的培养液中止消化。按照说明书加染色剂孵育，反应完成后立即上机检测。图3为实验结果，从图中可见QUE@Uio-66NPs+CQ的细胞凋亡率均高于QUE@Uio-66 NPs组和CQ组，证明联合给药可导致更多肿瘤细胞凋亡。
(3)蛋白酶体活力测定：铺2×106个细胞于6孔板，待12小时贴壁后分别加入药物处理。QUE@Uio-66 NPs的剂量为200μg/ml,CQ的剂量为30μM。24小时后收集细胞，弃去培养基，用PBS洗一次，放在冰上，使用500μL的0.5％NP-40将细胞裂解，混匀。取裂解液于EP管中，13000rpm，4℃离心10-15分钟，去上清放于冰上备用。按照说明书制备AMC标准曲线，按照说明书制备各组样品，于多功能酶标仪检测。酶标仪上在Ex/Em＝350/440nm上读取数值，并计算。整个实验重复三次。图4说明QUE@Uio-66 NPs确实能发挥出槲皮素的蛋白酶体抑制剂效果，且抑制效果非常好。CQ并没有明显的蛋白酶体抑制活性，QUE@Uio-66 NPs+CQ的组合也显示出了显著的蛋白酶体活性抑制效果。
(4)自噬体和自噬溶酶体电镜观察：将1×105细胞接种于6孔板。待其12小时贴壁后加入药物处理，QUE@Uio-66 NPs为200μg/ml,CQ是30μM。12小时后，弃去培养基，PBS清洗一次，用2.5％戊二醛和2％多聚甲醛混合固定液固定，4℃固定12h以上。封口后送往清华大学制作超薄切片，农科院原子能所电镜观察拍照。图5为实验结果，在QUE@Uio-66 NPs组中，内含有消化了的细胞器、蛋白质，呈单层膜结构的自噬溶酶体(黄色箭头)显著增加。线粒体的脊被破坏，失去功能。CQ组中可见内含细胞器，囊状物质，呈双层膜结构的自噬小体(红色箭头)，代表其自噬水平处于初级阶段。QUE@Uio-66 NPs+CQ联合组中，既存在自噬溶酶体也存在自噬小体。证明了QUE@Ui。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物以及一种包载槲皮素的Uio-66纳米颗粒的制作方法，所述通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的组合物包括槲皮素、姜黄素、芹菜素、乳胞素、表没食子儿茶素没食子酸酯、金雀异黄素等受限于水溶性差，生物利用度低难发挥其作用的天然化学成分，所述一种包载槲皮素的Uio-66纳米颗粒的制作方法包括以下步骤：
第一步：将称取一定量槲皮素溶解于乙醇，与Uio-66按照一定质量比混合，超声分散均匀后置于4℃环境下振荡20-30小时；
第二步：将上述分散系离心，弃去多余乙醇，再用乙醇洗三遍，真空冻干机中冷冻干燥；
第三步：将上述冻干粉末称取一定量，分散于5％葡萄糖中，获得QUE@Uio-66 NPs制剂，能用于细胞试验也能用于静脉注射；
第四步：将一定量氯喹溶解于二甲基亚砜中，在保证二甲基亚砜含量不超过1％的情况下，可加以细胞培养基进行细胞试验，获得细胞用氯喹；
第五步：将一定量氯喹溶解于二甲基亚砜中，然后加入无菌无酶水，PEG300，使其比例为5:55:40，混合均匀制得静脉注射用氯喹；
第六步：在进行试验时，将QUE@Uio-66 NPs与氯喹制剂同时施用于细胞或肿瘤动物模型。
2.根据权利要求1所述的通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述第一步中的振荡时间为24小时。
3.根据权利要求2所述的通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述第六步中的试验包括以下几个步骤：
准备实验器材；
第一步：细胞活力检测；
第二步：细胞凋亡检测；
第三步：蛋白酶体活力测定；
第四步：自噬体和自噬溶酶体电镜观察。
4.根据权利要求3所述的通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述细胞活力检测的过程为：按照1×104细胞数量铺设96孔板于黑色96孔板，待12小时后细胞贴壁后按实验设计给与药物处理，QUE@Uio-66 NPs配制成25、50、100、200、500μg/mL的梯度浓度，另一组在QUE@Uio-66 NPs的基础上添加30μM的CQ，同时设置对照组，24小时后，取出细胞培养板在室温平衡10分钟，96孔板每孔加入100μl CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解，室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定，使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。
5.根据权利要求4所述的通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述细胞凋亡检测的过程为：按照1×105细胞数量铺设6孔板，待12小时后细胞贴壁后按实验设计给与药物处理，其中Uio-66和QUE@Uio-66 NPs均为500μg/ml，CQ均为30μM，同时设置对照组。24小时后，取其培养液保留于EP管中，消化2分钟，再用其原来的培养液中止消化。
6.根据权利要求5所述的通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述蛋白酶体活力测定的过程为：铺2×106个细胞于6孔板，待12小时贴壁后分别加入药物处理。QUE@Uio-66 NPs的剂量为200μg/ml,CQ的剂量为30μM，24小时后收集细胞，弃去培养基，用PBS洗一次，放在冰上，使用500μL的0.5％NP-40将细胞裂解，混匀，取裂解液于EP管中，13000rpm，4℃离心10-15分钟，去上清放于冰上备用。
7.根据权利要求6所述的通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述自噬体和自噬溶酶体电镜观察的过程为：将1×105细胞接种于6孔板，待其12小时贴壁后加入药物处理，QUE@Uio-66 NPs为200μg/ml,CQ是30μM，12小时后，弃去培养基，PBS清洗一次，用2.5％戊二醛和2％多聚甲醛混合固定液固定，4℃固定12h以上，封口后送往清华大学制作超薄切片，农科院原子能所电镜观察拍照。
8.根据权利要求7所述的通过泛素-蛋白酶体途径与自噬双抑制治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述实验器材包括：
(1)实验材料，细胞株:4T1小鼠乳腺癌细胞；
(2)实验仪器，细胞培养箱，多功能酶标仪；
(3)实验试剂，细胞培养基及胎牛血清(FBS)，0.25％肤酶、青链霉素CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，Annexin Ⅴ-fitc细胞凋亡检测试剂盒，蛋白酶体活性检测试剂盒，相关抗体。
槲皮素和氯喹；
Uio-66；
实验Balb/c小鼠。
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