CN103599755A - 苯乙醇胺a分子印迹膜及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苯乙醇胺A分子印迹膜及其制备方法。该方法包括如下步骤：苯乙醇胺A和甲基丙烯酸经混合后进行预聚合；向所述预聚合后的体系中加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和2,2’-偶氮二异丁腈得到聚合体系，向所述聚合体系中浸入PVDF膜，然后将浸泡后的所述PVDF膜置于氮气环境下进行聚合反应，聚合反应结束后，用甲醇洗涤PVDF膜即得。本发明具有如下有益效果：本发明提供的苯乙醇胺A分子印迹膜兼具分子印迹和膜分离技术两方面的优点：（1）苯乙醇胺A分子印迹膜上特异性的空间位点和功能基团可对待测物实现特异性识别；（2）相比传统的分子印迹微球材料，本发明的分子印迹膜材料具有更稳定，形态规整，可以直接应用，不需要装柱等繁琐的制备过程。

Description

苯乙醇胺A分子印迹膜及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种苯乙醇胺A分子印迹膜及其制备方法与应用。

背景技术

苯乙醇胺A是一种人工合成的化学物质。克仑巴胺是福莫特罗的同分异构体，其是美国礼来公司合成莱克多巴胺的副产物，具有同瘦肉精和莱克多巴胺相同的作用和效果，属于β2激动剂的一种，具有营养再分配作用。分子式为C₁₉H₂₄N₂O₄，化学结构式为2-[4-(4-硝基苯基)丁基-2-羟基氨基]-1-甲氧基苯乙醇。2009～2010年，有不法分子销售一种称之为克伦巴胺（克伦巴安）的产品，宣传其为天然活性物质，具有提高肉猪的免疫力和抵抗力，促进生长速度，提高养猪效益，且药检无兴奋剂阳性和假阳性。后经国家饲料质量监督检验测试中心鉴定其为一种莱克多巴胺的结构类似物，由于此化合物具有苯乙醇胺的结构，将其命名为苯乙醇胺A。农业部发布1486号公告（2010年）和1519号公告（2011年），将苯乙醇胺A列为饲料和动物饮水中的违禁添加物。

目前，对于苯乙醇胺A的检测主要有液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。样品前处理中净化材料主要是混合阳离子固相萃取，但其选择性较差。特别是在液相色谱-串联质谱检测过程中样品基质干扰较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种苯乙醇胺A分子印迹膜及其制备方法与应用，本发明以苯乙醇胺A为模板分子，疏水性PVDF微孔滤膜作支撑，以甲基丙烯酸为功能单体，EGDMA为交联剂，合成了对苯乙醇胺A具体特异性识别的分子印迹膜，本发明制备的苯乙醇胺A分子印迹膜对克伦特罗等8种苯乙醇胺A结构类似物具有吸附性能。

本发明所提供的一种苯乙醇胺A分子印迹膜的制备方法，包括如下步骤：

苯乙醇胺A和甲基丙烯酸（MAA）经混合后进行预聚合；向所述预聚合后的体系中加入二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）和2,2’-偶氮二异丁腈（AIBN）得到聚合体系，向所述聚合体系中浸入PVDF膜，然后将浸泡后的所述PVDF膜置于氮气环境下进行聚合反应，所述聚合反应结束后，即得所述苯乙醇胺A分子印迹膜。

上述的制备方法中，所述聚合反应结束后，可用甲醇洗涤所述PVDF膜，直至紫外检测无信号为止。

上述的制备方法中，所述苯乙醇胺A、所述甲基丙烯酸、所述二甲基丙烯酸乙二醇酯与所述2,2’-偶氮二异丁腈的质量比可为1：6：30：1.2。

上述的制备方法中，所述方法还包括对所述PVDF膜进行表面修饰和活化的步骤；

所述表面修饰的步骤如下：将所述PVDF膜浸入NaOH水溶液中；然后取出所述PVDF膜浸入至丙烯酸和过硫酸钾的水溶液中，在氮气环境下进行反应得到经表面修饰的PVDF膜；

所述活化的步骤如下：将所述经表面修饰的PVDF膜依次浸入水、乙腈和2,2’-偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，然后取出挥发至干即得到经活化后的PVDF膜。

上述的制备方法中，所述预聚合的溶剂为氯仿；所述二甲基丙烯酸乙二醇酯和所述2,2’-偶氮二异丁腈用甲醇进行溶解；

所述预聚合的温度可为25℃～30℃，时间可为0.5～1.0小时。

上述的制备方法中，所述聚合反应的温度可为50℃～70℃，时间可为12～24小时。

本发明进一步提供了由上述方法制备得到的苯乙醇胺A分子印迹膜。

本发明还提供了上述苯乙醇胺A分子印迹膜在吸附苯乙醇胺A和苯乙醇胺A的结构类似物中的应用；所述苯乙醇胺A的结构类似物可为莱克多巴胺、溴布特罗、氯丙那林、溴氯布罗、沙美特罗或克伦特罗；在该应用中，具体可在乙腈中进行吸附。

本发明还提供了上述苯乙醇胺A分子印迹膜在检测猪肉样品中苯乙醇胺A或所述苯乙醇胺A的结构类似物含量中的应用。

本发明具有如下有益效果：本发明提供的苯乙醇胺A分子印迹膜（MIM）兼具分子印迹和膜分离技术两方面的优点：

（1）苯乙醇胺A分子印迹膜上特异性的空间位点和功能基团可对待测物实现特异性识别；

（2）相比传统的分子印迹微球材料，本发明的分子印迹膜材料具有更稳定，形态规整，可以直接应用，不需要装柱等繁琐的制备过程。

附图说明

图1为本发明制备苯乙醇胺A分子印迹膜的原理图。

图2为未接枝PVDF膜与实施例1中制备的表面修饰与活化的PVDF膜的热重曲线。

图3为空白PVDF膜的红外吸收光谱图。

图4为实施例1制备的苯乙醇胺A分子印迹膜的红外吸收光谱图。

图5为空白PVDF膜的扫描电镜图片。

图6为实施例1制备的苯乙醇胺A分子印迹膜的扫描电镜图片。

图7为实施例1制备的苯乙醇胺A分子印迹膜和实施例2中制备的无模板分子的分子印迹膜对苯乙醇胺A的静态吸附曲线。

图8为实施例1制备的苯乙醇胺A分子印迹膜对苯乙醇胺A的动态吸附曲线。

图9为实施例6中实际样品中β₂激动剂的液相色谱-质谱图，其中图9（1）、图9（2）、图9（3）、图9（4）、图9（5）、图9（6）、图9（7）和图9（8）分别为沙丁胺醇、莱克多巴胺、溴布特罗、氯丙那林、克伦巴胺、溴氯布罗、沙美特罗和克伦特罗的液相色谱-质谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、苯乙醇胺A分子印迹膜的制备

（1）PVDF膜的表面修饰与活化

PVDF膜的表面修饰：将PVDF膜浸入3wt%的NaOH水溶液中于60℃下处理12h，吸走表面多余的水溶液，接着浸入在10wt%丙烯酸和1wt%引发剂过硫酸钾的水溶液中，经氮气脱氧后，在70℃恒温反应5h。

将表面修饰的PVDF膜活化：先将处理好的PVDF膜浸在超纯水中1h，取出后浸入乙腈中0.5h，再在0.15mol/L的新制AIBN的乙腈溶液中浸泡20min，取出后挥干乙腈立即浸入下述步骤中的分子印迹混合溶液中。

（2）苯乙醇胺A分子印迹膜的制备

称取0.0104g苯乙醇胺A（作为模板分子），加入21μL功能单体MAA，用120μL甲醇充分溶解后加入600μL氯仿，密封后预聚合1h，25℃，加入235.6μL EGDMA、0.012g AIBN，待完全溶解后加入步骤（1）处理好的PVDF膜，超声除氧密封浸2h后将膜片放入氮气环境下恒温65℃反应24h。反应后用甲醇溶液反复洗涤膜片，用紫外检测无信号为止，即得到苯乙醇胺A分子印迹膜，之后保存在二次水中。

实施例2、苯乙醇胺A分子印迹膜的制备方法的优化

按照实施例1中的步骤制备苯乙醇胺A分子印迹膜，其中模板分子苯乙醇胺A、单体MAA、交联剂EGDMA和引发剂AIBN的配比如表1中所示。

其中吸附试验所用到的标准苯乙醇胺A乙腈溶液的浓度为5mg/L，250ml吸附，1ml洗脱，每一数据均进行三次平行测定，RSD≤5.5%。通过不同比例间以及印迹与非印迹材料对苯乙醇胺A吸附量的对比，最终选择的三者之间的质量比是1：6：30。

表1分子印迹膜合成比例的选择

实施例3、实施例1制备的苯乙醇胺A分子印迹膜的表征

（1）热重分析

为了确定对PVDF膜表面的修饰作用，采用热重分析法对修饰（实施例1中制备的表面修饰与活化PVDF膜）和未修饰的PVDF膜进行了表征，结果如图2所示。从图2中可以看出，通过热重实验，得到质量保留百分率与温度的关系，接枝后的PVDF膜先于未接枝的PVDF膜开始失重，并且接枝后的PVDF膜失重温度低于未接枝的PVDF膜。由于PVDF膜具有耐热、稳定性好等特点，所以未接枝的PVDF膜失重温度要高于接枝后的PVDF膜，证明经过接枝处理的PVDF膜表面修饰上了亲水羧基。

（2）红外光谱表征

为了确定分子印迹聚合物已经键合到PVDF膜上，利用红外光谱对空白PVDF膜、以苯乙醇胺A为模板合成的分子印迹膜（MIM）进行了表征，结果分别如图3和图4所示。

从图中可以看出，在1200cm^-1左右和1151cm^-1处有-C-F的红外吸收，MIM在1721cm^-1附近有-C=O的红外吸收，在3000cm^-1附近有O-H和C-H伸缩振动吸收峰，而空白PVDF膜则没有其他红外吸收峰，说明模板分子苯乙醇胺A和功能单体、交联剂等已经键合到PVDF膜上。

（3）扫描电镜分析

通过扫描电镜对空白PVDF膜和苯乙醇胺A-MIM的微观结构进行了表征，结果分别如图5和图6所示。

由图可得知，吸附有印迹聚合物的PVDF微孔滤膜密实程度远高于空白的PVDF膜，并且印迹过的PVDF膜纤维比较粗。这是因为在印迹聚合物膜上形成了完整的分子印迹结构。

考虑印迹条件和已知原料的结构特点，苯乙醇胺A分子印迹膜的合成原理如图1所示，图中表示在PVDF膜表面修饰了带有羧基的丙烯酸分子作为功能单体，加入模板分子苯乙醇胺A后，模板分子与膜表面的功能单体丙烯酸以及后加入的功能单体甲基丙烯酸通过氢键预聚合，后在N2环境下热聚合成分子印迹膜材料，用5%氨水-甲醇洗去模板后形成具有空腔结构的分子印迹膜，可用于苯乙醇胺A及其类似物的吸附。

实施例4、苯乙醇胺A分子印迹膜的吸附性能的研究

（1）苯乙醇胺A分子印迹膜的静态吸附性能

配制由0.1～0.5mg/L四种不同浓度的苯乙醇胺A的乙腈溶液，分别用MIM和NIM在室温下吸附15min。用乙腈淋洗后，5%氨水-甲醇洗涤模板，测定洗脱液中苯乙醇胺A的信号值，计算膜片上苯乙醇胺A的吸附率。

其中吸附率是指分子印迹膜或非分子印迹膜对溶液中目标分析物吸附量占溶液中目标分析物总量的比例。

将MIM和NIM放入250mL上述配制的溶液中进行吸附，结果如图7所示，结果表明所合成的分子印迹膜材料对模板分子苯乙醇胺A具有较好的吸附作用，MIM的吸附性能优于NIM的吸附性能。从图中可以看出，当浓度高于4μg/L时，吸附效率下降，达到饱和吸附。

（2）苯乙醇胺A分子印迹膜的动态吸附性能

配制5mg/L250mL的标准苯乙醇胺A的乙腈溶液，放入实施例1中合成的分子印迹膜，在摇床上分别摇5min、10min、15min和20min，后用乙腈淋洗，1mL5%氨水-甲醇洗脱，吹干用1mL水定容，用毛细管电泳在300nm处检测。

结果如图8所示，图8表明，分子印迹膜在吸附15min后，经淋洗、洗脱，分子印迹膜对模板分子苯乙醇胺A的吸附效果达到最大吸附，吸附率为99%，对0.5μg/L浓度的溶液，吸附倍数为248倍。吸附时间大于15min分子印迹膜的吸附率有所降低。

实施例5、苯乙醇胺A分子印迹膜对模板分子类似物的吸附研究

配制8种β₂受体激动剂各0.5μg/L100mL，用所合成的分子印迹膜材料对包括模板分子苯乙醇胺A在内的8种β₂受体激动剂进行富集实验，实验过程同实施例4。结果如表2所示，结果表明合成的分子印迹膜材料对模板分子苯乙醇胺A及其结构类似物具有一定的富集能力，除此之外，对于分子结构较小的β₂受体激动剂也有一定的富集能力，而对于分子结构较大并且具有较多烷基等非极性基团的β₂受体激动剂，所合成的分子印迹膜材料对其的富集能力较弱，说明在分子印迹材料中所形成的刚性空腔，能吸附与模板分子结构类似的β₂受体激动剂及分子结构较小的β₂受体激动剂。

表2分子印迹膜对β₂受体激动剂的富集

富集倍数：经分子印迹膜处理后，上样液中目标分析物的浓度与原试液中目标分析物的浓度比值。

实施例6、苯乙醇胺A分子印迹膜在检测猪肉样品中苯乙醇胺A及其结构类似物含量中的应用

（1）样品处理

猪肉样品来自超市。

酶解：准确称取2g（精确到0.01g）冷冻干燥后的猪肉样品于50mL离心管内，加入0.2mol/L乙酸铵溶液（pH=5.2）8.0mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL，漩涡混匀，于37℃下避光水浴振荡16h。

提取：酶解后放置至室温，涡旋混匀，10000r/min高速离心10min，倾出上清液于另一50mL离心管内，加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL，涡旋混匀，用高氯酸调pH至1.0±0.2，10000r/min离心10min后，将上清液转移至另一50mL离心管内。用10mol/LNaOH溶液调pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15mL，涡旋混匀，并振荡10min，5000r/min离心5min，取出上层有机相至另一50mL离心管内，再在下层水相中加入叔丁基甲醚10mL,涡旋混匀，并振荡10min，5000r/min离心5min，合并有机相，50℃下氮气吹干，用5mL乙腈溶解，备用。

净化：分子印迹膜首先用3mL甲醇和3mL水活化，乙腈溶液过膜后，水和乙腈淋洗，最后用5mL5%氨水甲醇洗脱。

（2）线性范围、精密度及检出限

利用优化好的超高效液相色谱-质谱条件，测定了β₂激动剂的标准曲线，如图9所示。

八种β₂激动剂在0.1～10ng/mL的范围内具有较好的线性关系，根据信噪比及线性范围的最低值等相关数据，确定方法的检出限，相关数据如表3所示。

表3分析方法的线性范围、检出限

（3）猪肉样品中八种β₂激动剂混标的加标回收率

在2g猪肉样品中加入β₂激动剂标准品，用MIM常温吸附后洗脱过膜，结合UPLC/MS/MS测定其吸附量，结果如表4所示，莱克多巴胺回收率为62%～88%，溴布特罗为64%～96%，氯丙那林为72%～120%，克伦巴胺为68%～116%，溴氯布罗为74%～124%，克伦特罗为76%～116%，沙美特罗为60%～64%。

表4猪肉样品中检测结果及加标回收率

Claims (10)

1.一种苯乙醇胺A分子印迹膜的制备方法，包括如下步骤：

苯乙醇胺A和甲基丙烯酸经混合后进行预聚合；向所述预聚合后的体系中加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和2,2’-偶氮二异丁腈得到聚合体系，向所述聚合体系中浸入PVDF膜，然后将浸泡后的所述PVDF膜置于氮气环境下进行聚合反应，所述聚合反应结束后，即得所述苯乙醇胺A分子印迹膜。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述苯乙醇胺A、所述甲基丙烯酸与所述二甲基丙烯酸乙二醇酯与所述2,2’-偶氮二异丁腈的质量比为1：6：30：1.2。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括对所述PVDF膜进行表面修饰和活化的步骤；

所述表面修饰的步骤如下：将所述PVDF膜浸入NaOH水溶液中；然后取出所述PVDF膜浸入至丙烯酸和过硫酸钾的水溶液中，在氮气环境下进行反应得到经表面修饰的PVDF膜；

所述活化的步骤如下：将所述经表面修饰的PVDF膜依次浸入水、乙腈和2,2’-偶氮二异丁腈的乙腈溶液中，然后取出挥发至干即得到经活化后的PVDF膜。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述预聚合的溶剂为氯仿；所述二甲基丙烯酸乙二醇酯和所述2,2’-偶氮二异丁腈用甲醇进行溶解；

所述预聚合的温度为25℃～30℃，时间为0.5～1.0小时。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述聚合反应的温度为50℃～70℃，时间为12～24小时。

6.权利要求1-5中任一项所述方法制备的苯乙醇胺A分子印迹膜。

7.权利要求6所述苯乙醇胺A分子印迹膜在吸附苯乙醇胺A中的应用。

8.权利要求6所述苯乙醇胺A分子印迹膜在吸附苯乙醇胺A的结构类似物中的应用；

所述苯乙醇胺A的结构类似物为莱克多巴胺、溴布特罗、氯丙那林、溴氯布罗、沙美特罗或克伦特罗。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：在乙腈中进行所述苯乙醇胺A或所述苯乙醇胺A的结构类似物的吸附。

10.权利要求6所述苯乙醇胺A分子印迹膜在检测猪肉样品中苯乙醇胺A或苯乙醇胺A的结构类似物含量中的应用；

所述苯乙醇胺A的结构类似物为莱克多巴胺、溴布特罗、氯丙那林、溴氯布罗、沙美特罗或克伦特罗。

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