CN114034673B - 基于碳点的分子印迹比率荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于碳点的分子印迹比率荧光探针及其制备方法与应用。所述分子印迹比率荧光探针是由蓝色碳点、红色碳点、莫能菌素、3‑氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯聚合得到的一种核壳结构聚合物，红色碳点利用二氧化硅层包覆，得到RCDs@SiO2，莫能菌素、3‑氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯等合成印迹层接枝在RCDs@SiO2外层，蓝色碳点镶嵌在印迹层，得到分子印迹比率荧光探针。本发明将片段印迹技术与基于碳点的双发射比率荧光技术相结合，以廉价的片段结构(莫能菌素)作为目标分子(雪卡毒素)的虚拟模板，节约了成本，绿色环保，操作简便，可实现对雪卡毒素的特异性吸附和高灵敏快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及荧光传感检测技术领域，具体地说，涉及一种基于碳点的分子印迹比率荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
雪卡毒素是由水体中有毒微藻产生的一类海洋生物毒素，毒性非常强，其中太平洋雪卡毒素-3C(Pacific Ciguatoxin-3C，P-CTX-3C)的毒性相当于河豚毒素的100倍。雪卡毒素易于在珊瑚礁鱼类体内富集，通过食物链传递引发人体中毒甚至死亡。现有雪卡毒素的检测方法以酶联免疫法和LC/MS/MS法为主。酶联免疫法虽然选择性很高，但受限于抗体的交叉反应和生物材料的性质，稳定性不高；LC/MS/MS法作为确证法，虽灵敏度高、准确性高，但需要昂贵的仪器，且样品预处理复杂繁琐，成本极高，不适用于实际监测中的日常应用。因此，亟需开发一种高效灵敏、操作简便的快速检测方法，用于监测中珊瑚礁鱼类中的雪卡毒素。
荧光传感检测法因具有高灵敏性、操作便捷、响应快速等优点，而被广泛应用于食品安全、生物分析等领域。比率型荧光传感器因利用两种不同发射波长荧光强度的比值变化对目标分析物进行分析测定，可实现自我校正，克服外部环境、背景噪音和底物浓度等带来的影响，从而比单波长荧光分析法更准确灵敏，近年迅速成为传感领域的研究热点。现有的比率型荧光传感器大多以有机荧光染料或含有重金属元素的半导体量子点为信号源，其中有机荧光分子易光漂白，发射光谱宽、易重叠；而半导体量子点虽然光化学稳定性好，不易被光解或漂白，但是其制备方法繁琐，价格昂贵，而且易对环境造成二次污染。因此，仍然需要寻找新型环保、荧光性能优异的荧光材料，更简便地构建更高性能的比率荧光传感器和传感方法。碳点(Carbon dots，CDs)作为一种新型“明星”荧光碳纳米材料，因其出色的生物相容性，优异的抗光漂白性，多色荧光发射以及易于合成和表面修饰而备受关注。
荧光传感检测法的选择性和响应时间与识别元件密切相关。分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)作为一种与模板分子空间结构和结合位点完全匹配的聚合物材料，可对目标物特异性吸附和分离，被称为“人工抗体”，并且易于制备、成本低、环境耐受性好，成为构筑荧光传感器的理想识别元件而得到广泛应用。分子印迹荧光传感器结合了MIPs的高选择性和荧光检测的高灵敏性，对复杂基质条件下的痕量样品分离检测具有得天独厚的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于碳点的分子印迹比率荧光探针及其制备方法。
本发明的另一目的是提供所述基于碳点的分子印迹比率荧光探针在高选择性检测雪卡毒素中的应用。
本发明构思如下：分子印迹技术是利用目标物质的一个结构片段作为替代模板合成的分子印迹聚合物，而合成的聚合物对该目标物质及其类似物质均具有识别性能的技术。当以检测对象雪卡毒素标准品作为模板分子，每毫克需约38000元，而雪卡毒素的片段结构莫能菌素100克仅需约26元，可见以莫能菌素作为模板分子能够大大降低成本。本发明将分子印迹技术与基于碳点的双发射比率荧光技术相结合，实现对雪卡毒素的特异性吸附和高灵敏快速检测。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于碳点的分子印迹比率荧光探针，所述分子印迹比率荧光探针是由蓝色碳点、红色碳点、莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯聚合得到的一种核壳结构聚合物，所述红色碳点利用二氧化硅层进行包覆，得到RCDs@SiO2，所述莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯等合成印迹层接枝在RCDs@SiO2外层，所述蓝色碳点镶嵌在印迹层，洗脱莫能菌素后得到分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2。
第二方面，本发明提供所述基于碳点的分子印迹比率荧光探针的制备方法，利用二氧化硅层对红色碳点进行包覆，得到RCDs@SiO2；然后在RCDs@SiO2表面以莫能菌素为片段-虚拟模板分子，3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂聚合上分子印迹层，将蓝色碳点镶嵌在分子印迹层中，形成核壳结构的球形材料。
所述方法包括以下步骤：
A、蓝色碳点BCDs的制备；
B、红色碳点RCDs的制备；
C、利用二氧化硅层包覆红色碳点RCDs制备RCDs@SiO2；
D、将RCDs@SiO2、蓝色碳点BCDs、莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯混合发生聚合反应，并从反应产物中脱除莫能菌素，得到基于碳点的分子印迹比率荧光探针，记为MIPs@BCDs/RCDs@SiO2。
其中，步骤A利用无水柠檬酸作为碳源，采用一步水热法制备蓝色碳点BCDs，制备方法包括：向反应瓶中加入5～15mL 3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，通氮气脱气5～15min并加热至100～300℃；另将0.1～1.0g无水柠檬酸溶解于1～4mL无水乙醇中得到无水柠檬酸溶液；在100～300℃搅拌条件下将无水柠檬酸溶液加入装有所述3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷的反应瓶中，并持续反应0.5～2min，所得粗产物经离心，取上清液，上清液过滤后用有机溶剂洗涤，最后将0.5～2mL纯化产物分散在5～15mL无水乙醇中，即得蓝色碳点BCDs；
步骤B利用桂花树叶作为碳源，采用乙醇浸提法制备红色碳点RCDs，制备方法包括：用去离子水洗涤新鲜桂花叶，蒸发去离子水至干，研磨得到叶子粉末；称取0.5～2g叶子粉末加入40～80mL无水乙醇中，于室温避光条件下剧烈搅拌20～60h，得到红色碳点的粗产品；所得粗产品离心后取上清液，上清液过滤后得到初步纯化的裸红色碳点；取20～40mL初步纯化的裸红色碳点与5～15mL 25％氨水混合，在室温下避光密封搅拌10～30h，得到表面掺杂氮的红色碳点，4000～6000rpm离心5～15min，离心后取上清液，过滤除去未反应物质，干燥后，即得红色碳点RCDs粉末；
步骤C采用改进的
法，用二氧化硅层包覆红色碳点RCDs制备RCDs@SiO2，制备方法包括：取10～30mg红色碳点RCDs粉末超声分散于5～15mL无水乙醇中，在室温搅拌条件下，将0.5～2mL正硅酸乙酯以连续液滴的方式滴入到红色碳点溶液中，搅拌20～40min后，加入25％氨水100～300μL，室温下搅拌10～30h；所得产物经离心，取上清液，并依次用乙醇和超纯水洗涤以去除未反应物质，干燥后，即得RCDs@SiO2；
步骤D采用改进的溶胶-凝胶法制备分子印迹比率荧光探针，制备方法包括：取10～30mg RCDs@SiO2和0.1～1mL蓝色碳点BCDs分散于10～30mL无水乙醇中，加入10～30mg莫能菌素和100～160μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下避光剧烈搅拌0.5～2h，得到混合液；然后，将正硅酸乙酯200～300μL和25％氨水100～200μL在剧烈搅拌下以连续液滴的方式加入所述混合液中，密封，室温下避光搅拌10～30h，超声后，离心取沉淀，用无水乙醇反复洗涤沉淀，以脱除莫能菌素，收集的成品干燥后，即得。
前述的方法，步骤A中所述有机溶剂为石油醚或正戊烷，或者其它极性比石油醚更小的有机溶剂。
前述的方法，步骤A中离心条件为：8000-12000rpm离心30min。
前述的方法，步骤B和C中干燥温度为30～50℃(优选40℃)。
前述的方法，步骤D中干燥温度为40～80℃(优选60℃)。
前述的方法，步骤D中超声功率优选为100W，频率优选为40KHZ。
优选地，所述基于碳点的分子印迹比率荧光探针按如下方法制备：
步骤A利用无水柠檬酸作为碳源，采用一步水热法制备蓝色碳点BCDs，制备方法包括：向反应瓶中加入10mL 3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，通氮气脱气10min并加热至200℃；另将0.5g无水柠檬酸(超声溶解)溶解于3mL无水乙醇中得到无水柠檬酸溶液；在200℃搅拌条件下将无水柠檬酸溶液加入装有所述3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷的反应瓶中，并持续反应1min，所得粗产物经离心，取上清液，上清液过滤后用石油醚洗涤，最后将1mL纯化产物分散在9mL无水乙醇中，即得蓝色碳点BCDs；
步骤B利用桂花树叶作为碳源，采用乙醇浸提法制备红色碳点RCDs，制备方法包括：用去离子水洗涤新鲜桂花叶，蒸发去离子水至干，研磨得到叶子粉末；称取1g叶子粉末加入60mL无水乙醇中，于室温避光条件下剧烈搅拌48h，得到红色碳点的粗产品；所得粗产品离心后取上清液，上清液过滤后得到初步纯化的裸红色碳点；取30mL初步纯化的裸红色碳点与10mL 25％氨水混合，在室温下避光密封搅拌24h，得到表面掺杂氮的红色碳点，5000rpm离心10min，离心后取上清液，过滤除去未反应物质，干燥后，即得红色碳点RCDs粉末；
步骤C采用改进的
法，用二氧化硅层包覆红色碳点RCDs制备RCDs@SiO2，制备方法包括：取20mg红色碳点RCDs粉末超声分散于10mL无水乙醇中，在室温搅拌条件下，将1mL正硅酸乙酯以连续液滴的方式滴入到红色碳点溶液中，搅拌30min后，加入25％氨水200μL，室温下搅拌24h；所得产物经离心，取上清液，并依次用乙醇和超纯水洗涤以去除未反应物质，干燥后，即得RCDs@SiO2；
步骤D采用改进的溶胶-凝胶法制备分子印迹比率荧光探针，制备方法包括：取20mg RCDs@SiO2和0.5mL蓝色碳点BCDs分散于20mL无水乙醇中，加入20mg莫能菌素和140μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下避光剧烈搅拌1h，得到混合液；然后，将正硅酸乙酯260μL和25％氨水150μL在剧烈搅拌下以连续液滴的方式加入所述混合液中，密封，室温下避光搅拌24h，超声(超声功率为100W，频率为40KHZ)后，离心取沉淀，用无水乙醇反复洗涤沉淀，以脱除莫能菌素，收集的成品干燥后，即得。
第三方面，本发明提供所述基于碳点的分子印迹比率荧光探针的以下任一应用：
1)用于雪卡毒素的分离富集；
2)用于雪卡毒素的定性及定量检测；
3)用于制备雪卡毒素检测试剂或试剂盒。
本发明中，所述雪卡毒素为P-CTX-3C。
第四方面，本发明提供雪卡毒素的检测方法，所述方法包括：将所述基于碳点的分子印迹比率荧光探针加入样品溶液中，室温振荡反应后，利用荧光光谱仪进行检测。
优选地，检测条件为：激发和发射扫描狭缝均设置为5～20nm(优选10nm)，激发光波长范围设置为320-400nm，扫描发射波长范围400-800nm。
前述的检测方法，样品溶液中雪卡毒素P-CTX-3C的线性检测范围在0.001-1.0ng/mL，检出限为3.3×10-4ng/mL。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明采用分子印迹技术合成基于碳点的双发射比率荧光探针，合成方法简单，荧光性能优异。以低毒廉价的片段结构(莫能菌素)作为昂贵高毒目标分子(雪卡毒素)的虚拟模板，大大节约了成本，绿色环保。
(二)本发明以不同颜色荧光的碳点实现双发射，构建比率荧光传感器，打破了构建双发射需要两种发射材料的常规模式，操作更简便，可大大提高工作效率。
(三)本发明合成碳点以柠檬酸和桂花树叶作为碳源，均为普通试剂或材料，原料来源更广泛，价格低廉。
(四)本发明将片段印迹技术与基于碳点的双发射比率荧光技术相结合，实现对雪卡毒素的特异性吸附和高灵敏快速检测，检测效果稳定，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中红色碳点RCDs与蓝色碳点BCDs的荧光光谱图。
图2为本发明较佳实施例中RCDs@SiO2的扫描电镜图。
图3为本发明较佳实施例中分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2的扫描电镜图。
图4为本发明较佳实施例中所述片段印迹比率型荧光探针对不同浓度P-CTX-3C的荧光响应谱图(a)和标准曲线(b)。
图5为本发明较佳实施例中所述片段印迹比率型荧光探针对不同结构类似物的选择性吸附图。
图6为本发明较佳实施例中所述片段印迹比率型荧光探针对不同氨基酸与金属离子的抗干扰性能图。
具体实施方式
本发明提供一种用于检测珊瑚礁鱼中雪卡毒素的分子印迹比率荧光探针，所述分子印迹比率荧光探针是由蓝色碳点、红色碳点、莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯聚合得到一种核壳结构聚合物，所述红色碳点利用二氧化硅层进行包覆，得到RCDs@SiO2，所述的莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯等合成印迹层接枝在RCDs@SiO2外层，所述蓝色碳点镶嵌在印迹层，洗脱莫能菌素后得到片段印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2。
本发明提供一种检测珊瑚礁鱼中雪卡毒素的分子印迹比率荧光探针的制备方法。所述方法包括：利用二氧化硅层对红色碳点进行包覆，得到RCDs@SiO2；然后在RCDs@SiO2表面以莫能菌素为片段-虚拟模板分子，3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂聚合上分子印迹层，将蓝色碳点镶嵌在分子印迹层中，形成核壳结构的球形材料。
所述分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2的制备方法主要包括以下步骤：
步骤一：蓝色碳点(BCDs)的制备；
步骤二：红色碳点(RCDs)的制备；
步骤三：利用二氧化硅层包覆RCDs制备RCDs@SiO2；
步骤四：在RCDs@SiO2表面聚合上分子印迹层，将蓝色碳点镶嵌在分子印迹层中，构建片段印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2。具体地，将RCDs@SiO2、BCDs与莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯混合，形成具有识别位点的分子印迹比率荧光探针(MIPs@BCDs/RCDs@SiO2)；其中，分子印迹聚合物是以莫能菌素为模板分子，使莫能菌素与聚合单体和交联剂在引发剂(氨水)存在的条件下发生聚合反应，然后从反应产物中脱除模板分子而形成的。
所述红色碳点位于内核作为荧光参比信号，所述蓝色碳点位于外层分子印迹层中，作为荧光响应信号。
优选地，步骤D中所述聚合单体可以是3-氨丙基三乙氧基硅烷。
所述交联剂可以是正硅酸乙酯。
进一步地，步骤一利用无水柠檬酸作为碳源，采用一步水热法制备蓝色碳点，具体为：向三颈烧瓶中加入10mL 3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，通氮气脱气10min并加热至200℃。另将0.5g无水柠檬酸超声溶解于3mL无水乙醇中，在200℃对AEAPMS的剧烈搅拌下，将无水柠檬酸溶液快速注入三颈烧瓶中，并持续反应1min。然后，将制备的粗产物离心30min，所得上清液过滤多次，用石油醚洗涤3次。最后，将1mL纯化产物分散在9mL无水乙醇中，4℃避光保存。
进一步地，步骤二利用桂花树叶作为碳源，采用乙醇浸提法制备红色碳点，具体为：用去离子水洗涤采摘的新鲜桂花叶，蒸发去离子水至干，研磨，得到粗细均匀的叶子粉末。称取1g叶子粉末加X60 mL无水乙醇溶液中，并于室温避光条件下剧烈搅拌48h，以提取红色碳点的粗产品。将所得粗产品离心过滤后，取30mL初步纯化的裸红色碳点与10mL 25％氨水于100mL烧杯中混合，在室温下避光密封搅拌24h，得到表面掺杂氮的红色碳点，5000rpm离心10min，过滤多次以除去未反应物质。所得的掺氮红色碳点在可见光下呈现浅绿透明的颜色，将其转移至玻璃培养皿中，40℃干燥8h后得到绿色粉末状样品，4℃避光保存。
进一步地，步骤三采用改进的
法，用二氧化硅层包覆步骤二中制备的红色碳点，具体为：称取20mg红色碳点粉末超声分散于10mL无水乙醇中，在搅拌的条件下，在室温下将1mL正硅酸乙酯以连续液滴的方式滴入到混合溶液中，搅拌30min后，加入200μL氨水(25％氨水)溶液，室温下搅拌24h。最后，所得物质以离心、乙醇和超纯水洗涤以去除未反应物质，得到RCDs@SiO2，40℃烘干备用。
进一步地，步骤四采用改进的溶胶-凝胶法制备片段印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2，具体为：称取20mg步骤三制备的RCDs@SiO2和0.5mL步骤一制备的蓝色碳点均匀分散于20mL无水乙醇中，加入20mg莫能菌素和140μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下避光剧烈搅拌1h进行预聚合。然后，将260μL正硅酸乙酯和150μL氨水(25％氨水)在剧烈搅拌下以连续液滴的方式加入到溶液中，用分子膜将烧杯密封并在室温下以锡纸包裹进行避光搅拌24h，超声离心，以乙醇反复洗涤粗产品，彻底洗脱莫能菌素，收集表面均匀分布有识别位点的MIPs@BCDs/RCDs@SiO2，收集的成品置于60℃真空干燥箱中过夜干燥，在避光4℃条件下保存备用。制备所得片段分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2用于检测珊瑚礁鱼中雪卡毒素。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2的制备
参考图1～图6，本发明提供一种用于检测珊瑚礁鱼中雪卡毒素的分子印迹比率荧光探针，所述分子印迹比率荧光探针是由蓝色碳点、红色碳点、莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯聚合得到的一种核壳结构聚合物，所述红色碳点利用二氧化硅层进行包覆，得到RCDs@SiO2，所述莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯等合成印迹层接枝在RCDs@SiO2外层，所述蓝色碳点镶嵌在印迹层，洗脱莫能菌素后得到片段印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2。
所述红色碳点位于内核作为荧光参比信号，所述蓝色碳点位于外层分子印迹层中，作为荧光响应信号。所合成的聚合物能适时、快速、准确地识别和检测珊瑚礁鱼中的雪卡毒素。
本实施例提供一种检测珊瑚礁鱼中雪卡毒素的分子印迹比率荧光探针的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一：蓝色碳点(BCDs)的制备；
步骤二：红色碳点(RCDs)的制备；
步骤三：利用二氧化硅层包覆RCDs制备RCDs@SiO2；
步骤四：在RCDs@SiO2表面聚合上分子印迹层，将蓝色碳点镶嵌在分子印迹层中，构建片段印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2。
步骤一利用无水柠檬酸作为碳源，采用一步水热法制备蓝色碳点，具体为：向三颈烧瓶中加入10mL 3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，通氮气脱气10min并加热至200℃。另将0.5g无水柠檬酸超声溶解于3mL无水乙醇中，在200℃对AEAPMS的剧烈搅拌下，将无水柠檬酸溶液快速注入三颈烧瓶中，并持续反应1min。然后，将制备的粗产物离心30min，所得上清液过滤多次，用石油醚洗涤三次。最后将1mL纯化产物分散在9mL无水乙醇中，4℃避光保存。所制备的蓝色碳点的粒径为2.0～3.8nm，在365nm紫外灯下呈现蓝色荧光，荧光光谱图见图1。
步骤二利用桂花树叶作为碳源，采用乙醇浸提法制备红色碳点，具体为：用去离子水洗涤采摘的新鲜桂花叶，蒸发去离子水至干，研磨，得到粗细均匀的叶子粉末。称取1g叶子粉末加入60mL无水乙醇中，并于室温避光条件下剧烈搅拌48h，以提取红色碳点的粗产品。将所得粗产品离心过滤后，取30mL初步纯化的裸红色碳点与10mL 25％氨水于100mL烧杯中混合，在室温下避光密封搅拌24h，得到表面掺杂氮的红色碳点，5000rpm离心10min，过滤多次以除去未反应物质。所得的掺氮红色碳点在可见光下呈现浅绿透明的颜色，将其转移至玻璃培养皿中，40℃干燥8h后得到绿色粉末状样品，4℃避光保存。所制备的红色碳点的粒径为1.8～4.5nm，在365nm紫外灯下呈现红色荧光，荧光光谱图见图1。
步骤三采用改进的
法，用二氧化硅层包覆步骤二中制备的红色碳点，具体为：称取20mg红色碳点粉末超声分散于10mL无水乙醇中，在搅拌的条件下，在室温下将1mL正硅酸乙酯以连续液滴的方式滴入到混合溶液中，搅拌30min后，加入200μL氨水(25％氨水)溶液，室温下搅拌24h。最后，所得物质以离心、乙醇和超纯水洗涤以去除未反应物质，得到RCDs@SiO2，40℃烘干备用。RCDs@SiO2的扫描电镜图见图2。
进一步地，所述步骤四的具体方法为：称取20mg步骤三制备的RCDs@SiO2和0.5mL步骤一制备的蓝色碳点均匀分散于20mL无水乙醇中，加入20mg莫能菌素和140μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下避光剧烈搅拌1h进行预聚合。然后，将260μL正硅酸乙酯和150μL氨水(25％氨水)在剧烈搅拌下以连续液滴的方式加入到溶液中，用分子膜将烧杯密封并在室温下以锡纸包裹进行避光搅拌24h，超声离心，以乙醇反复洗涤粗产品，彻底洗脱莫能菌素，收集表面均匀分布有识别位点的MIPs@BCDs/RCDs@SiO2，收集的成品置于60℃真空干燥箱中过夜干燥，避光于4℃条件下保存备用。
制备的分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2的扫描电镜图见图3。
使用时，取300μL 0.1mg/mL MIPs@BCDs/RCDs@SiO2，加入到100μL不同浓度的P-CTX-3C标准溶液和样品溶液中，于25℃恒温振荡器中反应10min后取出，以5000rpm的转速离心，取吸附后的上清液，用荧光光谱仪测定其在360nm激发波长下的荧光发射光谱。根据相关荧光光谱和标准曲线进行定性和定量分析。图4为不同浓度P-CTX-3C标准溶液的荧光响应谱图，随着P-CTX-3C浓度的增加，内层RCDs在675nm处发射的荧光信号强度基本保持不变，而外层分子印迹层与P-CTX-3C结合后，导致外层BCDs在440nm处发射的荧光强度逐渐降低。根据双发射峰的荧光强度之比I440/I675建立标准曲线。
荧光光谱仪激发和发射扫描狭缝均设置为10nm，激发光波长范围设置为320-400nm，扫描发射波长范围400-800nm。
样品溶液中雪卡毒素P-CTX-3C的线性检测范围在0.001-1.0ng/mL，检出限为3.3×10-4ng/mL。
实施例2分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2的选择性
为了研究实施例1制备的分子印迹比率荧光探针的特异吸附性，本发明进一步比较分析了MIPs@BCDs/RCDs@SiO2和非印迹比率型荧光探针NIPs@BCDs/RCDs@SiO2对6种结构类似物的吸附性能。具体方法为：分别取300μL的0.1mg/mL MIPs@BCDs/RCDs@SiO2和NIPs@BCDs/RCDs@SiO2溶液，向溶液中分别加入100μL 0.1ng/mL莫能菌素、P-CTX-3C、尼日利亚霉素、鱼藤酮、离子霉素A和溶胞菌素，放入恒温振荡器中固定并振荡，设置恒温振荡器的振荡时间为10min，振荡速度为200rpm，温度为25℃，比较MIPs@BCDs/RCDs@SiO2和NIPs@BCDs/RCDs@SiO2对不同分子的吸附性能。利用荧光猝灭程度F0/F，即(I440/I675)0/(I440/Ｉ675)-1的数值来间接表达MIPs@BCDs/RCDs@SiO2和NIPs@BCDs/RCDs@SiO2对不同结构类似物的吸附效果，数值越大，荧光猝灭强度越强，吸附效果越好，结果见图5。在所有结构类似物中，MIPs@BCDs/RCDs@SiO2对莫能菌素的吸附容量最大；其次，MIPs@BCDs/RCDs@SiO2对P-CTX-3C也具有良好的吸附效果，稍次于莫能菌素。然而，NIPs@BCDs/RCDs@SiO2对6种结构类似物的吸附容量没有明显的差异，并且都比MIPs@BCDs/RCDs@SiO2低。
为进一步探究所述分子印迹比率荧光探针对复杂基质的抗干扰效应，进一步选择了多种氨基酸与金属离子，包括谷氨酸(Glutamic acid，Glu)、门冬氨酸(Asparagine，Asp)、亮氨酸(Leucine，Leu)、赖氨酸(Lysine，Lys)、精氨酸(Arginine，Arg)、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Ag+，作为检测过程中的干扰因素。具体方法为：取300μL的0.5mg/mL MIPs@BCDs/RCDs@SiO2溶液，分别向溶液中加入0.2μmol/L Glu、Asp、Leu、Lys、Arg、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Ag+，放入恒温振荡器中固定并振荡，设置恒温振荡器的振荡时间为10min，振荡速度为200rpm，温度为25℃，在未添加和添加P-CTX-3C的条件下，考察MIPs@BCDs/RCDs@SiO2对这些氨基酸与金属离子的抗干扰能力，结果见图6。可见，以上氨基酸与金属离子则均未对荧光强度产生显著的影响，基本可以忽略不计，说明分子印迹比率型荧光探针具有强大的自我校正能力，对复杂的基质具有优良的抗干扰效应。
其中，非印迹比率型荧光探针(NIPs@BCDs/RCDs@SiO2)是在没有莫能菌素的参与下，按照实施例1相同条件下制得。
实施例3实际鱼肉样品中雪卡毒素的检测
为了验证实施例1制备的分子印迹比率荧光探针的实用性，选取3种体内可能含有P-CTX-3C的中大型珊瑚礁鱼类(鳗鱼，鲈鱼和石斑鱼)，进行前处理。前处理过程具体为：称取搅碎后的鱼肉样品5g，经冻干后充分碾碎于50mL螺旋盖聚丙烯离心管，加入15mL甲醇，涡旋混匀1min后，置于振荡器中(210rpm)提取15min后，在4℃、14000rpm离心5min。收集上清液，残渣再加入15mL甲醇，重复提取2次，合并提取液，40℃减压蒸发至干。残余物用5.0mL甲醇和4.5mL水充分溶解，将溶液加入预先用15mL乙腈、15mL甲醇和10mL水活化后的C18固相萃取柱，弃去流出液；用6.5mL 65％(v/v)甲醇-水淋洗后抽干，再用15mL乙腈洗脱；洗脱液于40℃下真空干燥至干；准确加入1mL甲醇溶液，涡旋混匀，使用0.22μm有机膜过滤。取100μL滤液，加入300μLMIPs@BCDs/RCDs@SiO2溶液中吸附10min，进行荧光分析。
为了验证本方法的准确度，以珊瑚礁鱼肉为空白样品，对3种鱼肉添加低、中、高三种不同浓度(0.025ng/mL、0.25ng/mL和0.75ng/mL)的P-CTX-3C标准溶液，进行加标回收实验。对加标后的样品进行前处理后，检测其中的P-CTX-3C，并计算检出值、回收率与相对标准偏差。将检测结果与LC/MS的结果进行对比，结果见表1。
表1 MIPs@BCDs/RCDs@SiO2对鱼肉中P-CTX-3C含量的测定结果
可以看出，本方法与LC/MS检测结果一致，回收率与相对标准偏差较好，利用本发明提供的基于碳点的分子印迹比率荧光探针MIPs@BCDs/RCDs@SiO2可有效检测珊瑚礁鱼中的雪卡毒素。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.基于碳点的分子印迹比率荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、蓝色碳点BCDs的制备；
B、红色碳点RCDs的制备；
C、利用二氧化硅层包覆红色碳点RCDs制备RCDs@SiO2；
D、将RCDs@SiO2、蓝色碳点BCDs、莫能菌素、3-氨丙基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯混合发生聚合反应，并从反应产物中脱除莫能菌素，得到基于碳点的分子印迹比率荧光探针，记为MIPs@BCDs/RCDs@SiO2；
其中，步骤A利用无水柠檬酸作为碳源，采用一步水热法制备蓝色碳点BCDs，制备方法包括：向反应瓶中加入5～15mL的3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷，通氮气脱气5～15min并加热至100～300℃；另将0.1～1.0g无水柠檬酸溶解于1～4mL无水乙醇中得到无水柠檬酸溶液；在100～300℃搅拌条件下将无水柠檬酸溶液加入装有所述3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷的反应瓶中，并持续反应0.5～2min，所得粗产物经离心，取上清液，上清液过滤后用有机溶剂洗涤，最后将0.5～2mL纯化产物分散在5～15mL无水乙醇中，即得蓝色碳点BCDs；
步骤B利用桂花树叶作为碳源，采用乙醇浸提法制备红色碳点RCDs，制备方法包括：用去离子水洗涤新鲜桂花叶，蒸发去离子水至干，研磨得到叶子粉末；称取0.5～2g叶子粉末加入40～80mL无水乙醇中，于室温避光条件下剧烈搅拌20～60h，得到红色碳点的粗产品；所得粗产品离心后取上清液，上清液过滤后得到初步纯化的裸红色碳点；取20～40mL初步纯化的裸红色碳点与5～15mL 25％氨水混合，在室温下避光密封搅拌10～30h，得到表面掺杂氮的红色碳点，4000～6000rpm离心5～15min，离心后取上清液，过滤除去未反应物质，干燥后，即得红色碳点RCDs粉末；
步骤C采用改进的
法，用二氧化硅层包覆红色碳点RCDs制备RCDs@SiO2，制备方法包括：取10～30mg红色碳点RCDs粉末超声分散于5～15mL无水乙醇中，在室温搅拌条件下，将0.5～2mL正硅酸乙酯以连续液滴的方式滴入到红色碳点溶液中，搅拌20～40min后，加入25％氨水100～300μL，室温下搅拌10～30h；所得产物经离心，取上清液，并依次用乙醇和超纯水洗涤以去除未反应物质，干燥后，即得RCDs@SiO2；
步骤D采用改进的溶胶-凝胶法制备分子印迹比率荧光探针，制备方法包括：取10～30mg RCDs@SiO2和0.1～1mL蓝色碳点BCDs分散于10～30mL无水乙醇中，加入10～30mg莫能菌素和100～160μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下避光剧烈搅拌0.5～2h，得到混合液；然后，将正硅酸乙酯200～300μL和25％氨水100～200μL在剧烈搅拌下以连续液滴的方式加入所述混合液中，密封，室温下避光搅拌10～30h，超声后，离心取沉淀，用无水乙醇反复洗涤沉淀，以脱除莫能菌素，收集的成品干燥后，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述有机溶剂为石油醚或正戊烷，或者其它极性比石油醚更小的有机溶剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中离心条件为：8000～12000rpm离心30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B和C中干燥温度为30～50℃；步骤D中干燥温度为40～80℃；步骤D中超声功率为100W，频率为40KHz。
5.按照权利要求1-4任一项所述方法制备得到的基于碳点的分子印迹比率荧光探针。
6.权利要求5所述基于碳点的分子印迹比率荧光探针的以下任一应用：
1)用于雪卡毒素的分离富集；
2)用于雪卡毒素的定性及定量检测；
3)用于制备雪卡毒素检测试剂或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述雪卡毒素为P-CTX-3C。
8.雪卡毒素的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求5所述基于碳点的分子印迹比率荧光探针加入样品溶液中，室温振荡反应后，利用荧光光谱仪进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，检测条件为：激发和发射扫描狭缝均设置为5～20nm，激发光波长范围设置为320～400nm，扫描发射波长范围400～800nm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，样品溶液中雪卡毒素P-CTX-3C的线性检测范围在0.001～1.0ng/mL，检出限为3.3×10-4ng/mL。
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