CN105403694A - 一种用于探测百草枯分子的PS@SiO2人工抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征在于：所述的人工抗体中洗脱位于SiO₂壳层中的印记分子，SiO₂壳层的内部形成具有与印记分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，其人工抗体具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对其选择性识别和探测，本发明包括如下两个步骤：首先合成了单分散的、表面携带羧基功能单体的PS微球。然后其表面的羧基与百草枯分子通过静电相互作用，再在其表面包覆一层可控壳厚的SiO₂壳层，洗脱百草枯，形成了识别和检测百草枯分子的人工抗体，其纳米壳层厚度可控，壳层的刚性强，比表面积大，形成识别位点的空间结构稳定、有效位点多、选择性好、对目标分子识别效率高。

Description

一种用于探测百草枯分子的PSSiO2人工抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及材料科学领域，特别是涉及探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法。

背景技术

农药在农业病、虫、草害防治和保证农作物高产增收方面发挥着巨大作用的同时也对生态坏境和人类健康造成了严重威胁，引起各国政府和国际社会的高度关注。据统计全世界每年由食品质量引发的病例大约在15亿次，并导致大约3百万人死亡，尤其是农药在农牧产品和食品中的残留，对人体具有慢性毒性、“三致”（致癌、致畸、致突变）效应和环境激素效应。剧毒农药在农产品中的残留直接造成中毒的事件也时有发生。农药残留对我国食品安全构成了长期的严重威胁，近年来，公众对农产品和食品的安全感明显下降，农牧产品和食品中农药残留问题多次引发国际贸易争端，严重影响我国农产品和食品在国际市场的竞争力。因此，农药残留的快速痕量检测是目前国家亟待解决的挑战性难题，也是国际社会普遍关心的重要研究领域，急需先进的传感材料和快速、灵敏和可靠的分析检测技术解决农牧产品和食品中农药残留痕量检测所面临的挑战。

农药作为对生态环境和食品的重要污染源之一，日益受到各国政府和公众的关注。其分析技术研究也引起了各国研究机构的高度重视，新的分析方法，特别是多种类型农药的多残留分析方法、同类型农药的多残留分析方法以及新的单个农药在多种试样中的分析方法都取得了重要进展（Greulich,K.;Alder,L.Anal.Bioanal.Chem.2008,391,183.）。目前，主要的农药残留检测方法为气相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析法、毛细管电泳、气-质联用分析法和液-质联用分析法等。这些方法灵敏度高，但是所需仪器昂贵，样品前处理复杂、耗时长（Grimalt,S.;Pozo,óscarJ.;Sancho,J.V.;Hernández,F.Anal.Chem. 2007,79,2833.；García-Reyes,J.F.;Hernando,M.D.;Ferrer,C.;Molina-Díaz,A.;Fernández-Alba,A.R.Anal.Chem. 2007,79,7308.；Hernéndez,F.;Portolés,T.;Pitarch,E.;López.F.J.Anal.Chem. 2007,79,9494.）。近年来，利用生物免疫传感器快速检测农药残留取得一定的进步（Ramon-Azcon,J.;Kunikata,R.;Sanchez,F.J.;Marco,M.P.;Shiku,H.;Yasukawa,T.;Matsue,T.Biosens.Bioelectron. 2009, 24,1592.）。如利用农药与特异性抗体结合反应特性研制免疫传感器，可用于对相应农药残留进行快速定量定性检测。免疫传感器利用的是抗体和抗原之间的免疫化学反应，抗体可与其独特的抗原高度专一地可逆结合，其间有静电力、氢键、疏水作用和范德华力，将抗体固定在固相载体上，可从复杂的基质中富集抗原目标物，达到测定目标物浓度的目的。为了提高化学生物传感器对目标分析物的选择性和专一性，普遍使用抗体、酶、多肽和核酸作为分子识别元素。然而，生物敏感材料如抗体、酶、特异蛋白和DNA等生物分子性质不稳定，受环境影响大，价格极为昂贵。使用生物敏感材料制作的生物纳米传感器比较脆弱，使用寿命短，在苛刻条件下可能失去敏感特性。因此，使用人工合成的仿生敏感材料（人工抗体）来代替生物敏感材料是化学/生物传感器未来应用的关键。

分子印记技术是通过模板分子（目标分子）与功能单体以共价键或非共价键相互作用，将模板分子固定在交联的聚合物网络中，模板分子的除去，留下与模板分子的形状和功能相匹配的孔洞，从而在合成材料中创造出具有高亲和力和高选择性的分子识别位点（人工抗体）（Wulff,G.Chem.Rev.,2002,102,1.；Wulff,G.Angew.Chem.Int.Ed.1995,34,1812.；Haupt,K.;Mosbach,K..Chem.Rev. 2000,100,2495.；Zimmerman,S.C.;Lemcoff,N.G.Chem.Commun. 2004,5.）。这是一种人工合成的具有高亲和力和高选择性分子识别人工抗体材料的有效手段。分子印记材料具有物理和化学稳定性高、成本低、制备容易和可重复使用等优点，因此，在化学与生物传感器、分离技术、催化、药物输送等领域有着广泛的应用前景（Katz,A.;Davis,M.E.Nature, 2000,403,286.；Bass,J.D.;Katz,A.Chem.Mater. 2003,15,2757.；Zimmerman,S.C.;Wendland,M.S.;Rakow,N.A.;Suslick,K.S.Nature 2002,418,399.；Mertz,E.;Zimmerman,S.C.J.Am.Chem.Soc. 2003,125,3424.）。近年来，Hayden使用分子印记的石英微重力天平可检测病毒和分辩血型（Dichet,F.E.;Hayden,D.;Bindeus,R.Anal.Bioanal.Chem. 2004,318,1929.；Hayden,O.;Mann,K.J.;Krassnig,S.;Dickert,F.L.Angew.Chem.Int.Ed. 2006,45,2626.）。Nesterov报道了分子印记的半导体发光聚合物传感器对TNT的检测（Li,J.H.;Kendig,C.E.;Nesterov,E.E.J.Am.Chem.Soc. 2007,129,15911.）。基于仿生分子印记的化学生物传感器正在吸引化学家们的强烈研究兴趣。

浙江省农业科学院齐沛沛等人公开了发明专利（CN201210208302.9）“一种克百威分子印记微球及其制备和应用”，将模板分子和功能单体溶解到含交联剂和引发剂的致孔剂溶液中得到反应混合液，进行超声脱气、通氮气除氧后在密封状态下进行聚合反应，反应完全之后，进行离心分离，得到白色粉末状聚合物，依次采用甲醇乙酸混合液、甲醇为提取溶剂进行索氏抽提，真空干燥后除去溶剂，得到克百威分子印记微球。该发明还公开了由该制备方法制备得到的克百威分子印记微球及其应用。该发明得到的克百威分子印记微球对农产品中的克百威具有特异选择性，能够快速、灵敏、准确、高效地对农产品农药残留进行检测，还可以作为固相萃取填料。国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所刘静等人公开了发明专利（CN201210368919.7）“一种制备水质检测用对硫磷分子印记聚合物的方法”,该方法以对硫磷为模板分子，通过紫外光引发聚合制备适合水环境中有机磷检测的对硫磷分子印记聚合物。采用该发明制备的对硫磷分子印记聚合物，聚合时间短，吸附性能好；以制备的对硫磷分子印记聚合物为固相萃取柱填料，采用固相萃取-气相色谱法能快速有效地分析水中有机磷农药，其分离效果好，杂质干扰少，检出限低，灵敏度、精密度高，回收效果好，可满足水中痕量有机磷检测要求。中国农业大学潘灿平等人公开了发明专利（CN200910238781.7）“一种分子印记聚合物及其制备方法与应用”，该分子印记聚合物是按照如下方法制备的，将聚合反应单体、交联剂、致孔剂、引发剂和印记分子二乙基(3-甲基脲)(苯基)甲基磷酸酯混合，在热引发或光引发条件下进行原位聚合反应，得到含有二乙基（3-甲基脲）（苯基）甲基磷酸酯的聚合物；清洗上述聚合物直至检测不到印记分子；然后用有机溶剂清洗至中性，真空下干燥，即制得本发明的分子印记聚合物。该发明还公开了该分子印记聚合物在分离纯化、测定样本中的有机磷类杀虫剂方面的应用，该聚合物的应用避免了目标分析物模板泄露对后续吸附实验的影响，可同时对多种目标分子进行检测，加宽了目标分子的检测范围。江苏大学陈冠华等人公开了发明专利（CN201110177262.1）“一种杀虫脒分子印记固相萃取柱的制备方法和应用”，该发明以杀虫脒为模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，乙腈为致孔剂，采用本体聚合法合成分子印记聚合物。将分子印记聚合物颗粒均匀填充于固相萃取柱内，得到杀虫脒分子印记固相萃取柱；以乙腈为上样溶剂、乙腈-丙酮为淋洗溶剂、甲醇-乙酸为洗脱溶剂，实现了蜂蜜样品中杀虫脒的分离、富集。与以往的普通萃取法等相关技术相比，富集、净化效率高，并且杀虫脒分子印记固相萃取小柱可以重复使用，成本低，可望成为蜂蜜样品中杀虫脒残留前处理的必备手段。安徽农业大学汤锋等人公开了发明专利(CN200810246208.6)“取代脲类农药分子印记固相萃取小柱的制备方法”，该发明将模板分子取代脲类农药、功能单体甲基丙烯酸和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，按模板分子∶功能单体∶交联剂摩尔比为1∶28∶20，通过悬浮聚合而成取代脲类农药分子印记聚合物微球；再称量取代脲类农药分子印记聚合物微球，填充于聚丙烯固相萃取小柱空管内，制得取代脲类农药分子印记固相萃取小柱。该发明制得的取代脲类农药分子印记固相萃取小柱用于检测食品和环境中取代脲类农药残留样品提取溶液的选择性纯化、富集。与普通液-液萃取法、C18固相萃取法相比，该发明具有简单、快速、净化效率高等特点。

分子印记材料要真正应用到实际样品中痕量农药残留组分选择性的分离、快速的富集，并以敏感的光学信号输出，分子印记材料应该具备对目标分子具有高亲和力，快速结合动力学，能够后功能化以及一致材料形态等要求。在信号输出方面领域研究中东北林业大学陈立钢等人公开了发明专利（CN201410006545.3）“一种分子印记―荧光量子点双功能复合微球的制备及在氨基甲酸酯类农药残留分析中的应用”，该发明的目的是要解决现有氨基甲酸酯类农药残留分析中前处理步骤繁琐，大量消耗有机溶剂，分析时间长，成本高和对操作人员危害大的问题。步骤：一、合成掺杂型量子点ZnS:Mn；二、制备分子印记―荧光量子点双功能复合微球；一种分子印记―荧光量子点双功能复合微球在氨基甲酸酯类农药残留分析中的应用方法步骤：一、混合；二、检测。优点：测定的加标回收率为94%~99%；降低分析成本50%~70%。本发明适用于一种分子印记―荧光量子点双功能复合微球的制备及应用方法。天津科技大学王硕等人公开了发明专利（CN201410446636.9）“一种上转换荧光分子印记聚合物及其制备方法”，该发明提供一种上转换荧光分子印记聚合物及其制备方法，涉及新型高分子富集材料领域，将上转换荧光纳米颗粒NaYF₄:Yb³⁺，Er³⁺作为一种新型载体，与分子印记技术相结合，具体涉及一种对氨基甲酸酯类农药速灭威分子具有良好的吸附和分离功能的上转换荧光纳米分子印记聚合物及其制备方法，合成出的产物比表面积较大，使其传质速率和吸附量较以往材料有很大的提高。该发明成本低廉，合成过程简单，反应条件易于控制。制备的上转换荧光纳米分子印记聚合物对目标物具有高灵敏高选择性的特点，重现性好，有良好的应用前景。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所王静等人公开了发明专利（CN201310598535.9）“磁性分子印记聚合物-荧光分析方法”，该发明要解决现有快速检测方法中小分子天然抗体难以制备的问题。方法：一、制备包覆聚乙二醇及油酸的磁性纳米粒子；二、制备三嗪类农药磁性分子印记聚合物；三、采用荧光分光光度计测定荧光信号。本发明用磁性分子印记仿生材料，替代了一般快速检测方法中常用但难以制备的天然抗体，借助农药分子与荧光探针对磁性印记的竞争结合，从技术上实现了三嗪类小分子农药的非免疫法快速检测。济南大学葛慎光等人公开了发明专利（CN200910018139.8）“检测痕量农药残留物的分子印记化学发光传感器及其应用”，该发明涉及农药残留物检测技术领域，更具体地说是一种检测痕量农药残留物的分子印记化学发光传感器，还涉及采用所述的分子印记技术化学发光传感器测农产品样本中痕量农药残留的方法。(1)选择功能单体；(2)按摩尔比为0.1~1∶1~10∶5~25∶20~60∶0.05~0.15∶20~50的比例将残留农药的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和硅源混合均匀制成MIPs溶胶；(3)制备量子点材料溶液；(4)利用层层自组装表面修饰技术，将MIPs溶胶和量子点材料修饰到微孔板表面上，制作化学发光传感器。本发明的有益效果：对农药残留物的检测具有高特异性、高灵敏度、快速检测，成本低，重复性好，便于现场检测。中国科学院电子学研究所夏善红等人公开了发明专利（CN200910242771.0）“一种识别残留农药的光寻址分子印记阵列传感器”，一种识别残留农药的光寻址分子印记阵列传感器由光寻址分子印记阵列芯片和光寻址电位传感器的测量池组成。其中基于MEMS技术的阵列芯片为硅基微结构阵列，芯片的阵列敏感区表面采用溶胶-凝胶分子印记的方法修饰正硅酸乙酯，可识别各种残留有机磷、氨基甲酸酯等农药的分子印记敏感膜；测量池由有机玻璃制成，包括上盖、测量池底座和密封胶圈。阵列芯片作为工作电极可互换地安装在测量池底座的内侧；红外LED发光二极管阵列被直接用密封胶镶嵌在底座的外侧，与阵列芯片的位置对应；上盖的内侧与工作电极阵列芯片对应得位置固定着铜基电镀Pt薄膜作为对电极，并有进出口管道；圆形上盖与测量池底座周围有螺纹，通过密封胶圈密封成测量池。

但是，目前通过传统方法制得的印记聚合物在分子识别和信号输出实际应用中面临许多需要克服的难点，概括起来可分为以下几个方面：（1）由于分子印记聚合物的交联密度高，处于交联网络内部的模板分子无法完全除去（Markowitz,M.A.;Kust,P.R.;Deng,G.;Schoen,P.E.;Gaber,B.P.Langmuir 2000,16,.1759.；Rao,M.S.;Dave,B.C.J.Am.Chem.Soc. 1998,120,13270.）；（2）由于有效位点的数量小，对目标分子的亲和力小；（3）目标分子很难扩散进入网络内部的印记点，所以对目标分子的结合动力学慢；（4）分子印记聚合物通常是无规则形状的材料，与传感器件的兼容性差。（5）目标分析物进入识别位点自身无法以敏感信号输出，因此，传统方法合成出来的分子印记聚合物常常表现高选择性、低的结合容量和差的位点可接近性、慢的结合动力学以及目标分析物进入识别位点自身无法以敏感信号输出缺点，鉴于此合成高选择性、结合容量高、位点容易接近、结合动力学速度快和高敏感信号输出的并具有规则形貌的分子印记聚合物材料一直是人们追求的目标（Hayden,O.;Mann,K.J.;Krassnig,S.;Dickert,F.L.Angew.Chem.Int.Ed. 2006,45,2626.；Schmidt,R.H.;Mosbach,K.;Haupt,K.Adv.Mater. 2004,16,719.）。一些化学和材料科学家已经发展出几种新的印记技术来改进传统印记材料的分子识别特性，例如，表面印记，薄膜印记和单分子树枝状印记等（Yilmaz,E.;Haupt,K.;Mosbach,K.Angew.Chem.Int.Ed. 2000,39,2115.；Titirici,M.M.;Hall,A.J.;Sellergren,B.Chem.Mater. 2003,15,822.）。宁波大学史西志等公开了发明专利（CN201410512346.X）“一种拟除虫菊酯类农药分子印记膜的制备方法”，其特点包括以下步骤：首先将LDPE膜分别用无水乙醇、丙酮和蒸馏水超声波清洗，真空干燥，置于等离子体处理仪的反应室中，通入氩气后，对其进行表面活化处理；然后将活化处理后的LDPE膜置于分子印记接枝溶液中，在氮气保护条件下进行接枝；接枝反应结束后，将分子印记膜取出，用有机溶剂洗脱除去模板分子，直到通过GC-ECD检测不到模板分子为止；最后将除去模板分子的分子印记膜真空干燥，优点是对拟除虫菊酯类农药残留具有较高的选择透过性，可应用于水产品等复杂生物样品中拟除虫菊酯类农药的选择性分离和高效富集，具有较大的应用价值。重庆大学法焕宝等公开了发明专利（CN201210563254.5）“用于有机磷农药检测的分子印记复合膜及其应用”，其以有机磷类农药作为模板分子，以金属卟啉作为功能单体制备分子印记复合膜。该发明提供的分子印记复合膜制备方法简单，所述的分子印记复合膜中形成的三维空穴是具有专一识别性的，只能与具有特定结构的模板分子结合，因此，该发明的分子印记复合膜对于相应的模板分子具有较高的选择性，可用于有机磷农药的快速检测。陈娇娇科研小组的发明专利（CN201310594941.8）公开了“核-壳结构L-肉碱分子印记微球及其制备方法”。它采用了下述步骤：（1）制备纳米SiO₂微球；（2）SiO₂微球的表面活化；（3）SiO₂微球表面苄基化，SiO₂微球加入到二甲苯溶液中加入一定量的4-（氯甲基）苯基三氯硅烷和三乙胺，搅拌反应，得到苄基化SiO₂微球（SiO₂-Cl）；（4）SiO₂微球表面进行可逆加成-断裂链转移聚合反应（ReversibleAddition-FragmentationChainTransferPolymerization，RAFT），苯基溴化镁的四氢呋喃溶液（0.1M）和超干四氢呋喃加入到三口烧瓶中，滴加适量二硫化碳，通氮气反应，反应产物依次用四氢呋喃、甲醇、丙酮洗涤后于60℃烘箱中干燥24h，最终得到RAFT试剂的SiO₂微球（SiO₂-RAFT）；（5）核-壳结构L-肉碱分子印记微球的制备，L-肉碱（模板分子）和功能单体甲基丙烯酸甲酯（Methylmethacrylate，MAA）、SiO₂-RAFT微球、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯（Ethyleneglycoldimethacrylate，EGDMA）混合，通氮气除氧，逐滴加入含引发剂偶氮二异丁腈（Azodiisobutyronitrile，AIBN）的甲醇溶液，搅拌反应，洗涤干燥。（6）印记模板分子的洗脱。该纳米微球通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合结合表面分子印记技术制备得到，可实现对L-肉碱的选择识别性。但是结合位点大多位于材料的表面或接近表面，比表面积有限，表面接枝不完全，有效的识别位点也很少，且反应过程不易控制。而可控壳厚的核壳结构的分子印记聚合物报道尚少，在核壳中都具有识别位点的分子印记聚合物，大部分是位于壳层，这样可以增加结合容量，且提高识别效率。但是这些通过共价键将模板分子键合到固体表面也存在一些问题，主要表现在一是需要通过复杂的化学反应将模板分子键合到固体表面，反应条件复杂，而反应效率又直接影响印记材料表面印记位点的多少，因此通过这种方式产生的表面印记聚合物往往表现出低的结合容量（Bossi,A.;Piletsky,S.A.;Piletska,E.V.;Turner,A.P.F.Anal.Chem. 2001,73,5281.）；另一方面良好的修饰反应不多，目前文献报道的主要是基于生成热逆键—异氰酸酯（Ki,C.D.;Oh,C.;Oh,S-G,Chang,J.Y.J.Am.Chem.Soc. 2002,124,14838.）和醛基—氨基作用（Yang,H.H.;Zhang,S.Q.;Zhuang,Z.X.;Wang,X.R.J.Am.Chem.Soc. 2005,127,1378.；Li,Y.;Yang,H.H.;You,Q.H.;Zhuang,Z.X.;Wang,X.R.Anal.Chem., 2006,78,317.）。鉴于上述原因，传统材料表面分子印记技术并没有得以在实际应用中推广。

近年来，纳米材料的制备技术发展为解决分子印记材料所面临的困难带来了新的机遇。纳米结构的分子印记材料与传统的印记材料相比具有下列明显的优势：（1）由于巨大的比表面积，模板分子几乎都处于纳米结构的表面或者表面附近，使得模板分子能够几乎完全除去；（2）模板分子的完全除去，能够产生高密度的有效印记点，因此对目标分子具有高的亲和力；（3）分子印记点都处于纳米结构的表面或者表面附近，扩散阻力小，因此结合动力学快；（4）纳米结构的分子印记材料具有规整的形状，在实际应用中可以组装到传感器上（Gao,D.M.;Zhang,Z.P.;Wu,M.H.J.Am.Chem.Soc. 2007,129,7859.）；（5）由于纳米结构的分子印记表面容易进行化学修饰和功能化；（6）同时金属纳米结构表面可使信号增强10⁶-10¹⁵倍，便于痕量物质检测。南昌大学梁汝萍等人公开了发明专利（CN201310319972.2）“基于磁性分子印记聚合物放大效应的SPR传感器构建及应用”，该发明先以毒死蜱为模板分子，利用多巴胺的自聚合性能，合成对毒死蜱具有识别作用的磁性分子印记聚合物。洗脱毒死蜱后，含有印记空腔的磁性分子印记聚合物具有良好的超顺磁性和高选择性，利用固定在金片表面的乙酰胆碱酯酶与毒死蜱之间的特异性相互作用，构建了基于磁性分子印记聚合物放大效应的农药残留物识别检测传感界面；与传统的农残检测技术相比，该发明构建的基于磁性分子印记聚合物放大效应的表面等离子体共振传感器对毒死蜱的检测灵敏度高和选择性好，具有很好的应用前景。中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所高志贤等人公开了发明专利（CN201310580918.3）“用于孔雀石绿SPR检测的胶体金放大分子印记膜的制备”，该发明基于分子印记与表面等离子体共振传感联用技术，首先利用粘附剂将引发剂固定在SPR芯片表面，再浸入预聚合液中热引发聚合，为了放大检测信号，在预聚合液中加入MUA修饰的胶体金，在SPR芯片表面原位合成分子印记膜，并以此作为识别元件，通过胶体金将信号放大，建立一种新型的孔雀石绿SPR检测方法，该方法具有良好的灵敏度、特异性和稳定性。用分子印记膜替代抗体或酶等生物材料作为传感器的识别元件，显著降低了检测成本，提高了传感器的贮存期和稳定性，在农药、兽药残留的检测应用中具有很大的潜力。

目前，有几个研究小组在重要的国际期刊上报道了他们在纳米结构分子印记技术上的研究结果，例如青岛海洋研究所的研究人员较早的开展了分子研究纳米材料合成及其在蛋白质分析中的研究（Li,Y.;Yang,H.H.;You,Q.H.;Zhuang,Z.X.;Wang,X.R.Anal.Chem. 2006,78,317.）。Haupt教授近来报道了分子印记的纳米线阵列用于药物的检测（Vandevelde,F.;Belmont,A.S.;Pantigny,J.;Haupt,K.Adv.Mater. 2007,19,3717.）。最近，发明者所在研究小组利用表面分子自组装、功能单体引导和纳米模板等方法，设计和制备出对TNT分子具有高选择性、高容量摄取能力的纳米线、纳米管阵列（Xie,C.G.;Liu,B.H.;Wang,Z.Y.;Gao,D.M.;Guan,G.J.;Zhang,Z.P.Anal.Chem.2008,80,437.；Xie,C.G.;Zhang,Z.P.;Wang,D.P.;Guan,G.J.;Gao,D.M.;Liu,J.H.Anal.Chem. 2006,78,8339.），壳层印记的芯-壳型纳米粒子（Gao,D.M.;Zhang,Z.P.;Wu,M.H.J.Am.Chem.Soc. 2007,129,7859.）和分子印记的单孔空心聚合物微球等（Guan,G.J.;Zhang,Z.P.;Wang,Z.Y.;Liu,B.H.;Gao,D.M.;Xie,C.G.Adv.Mater. 2007,19,2370.），实现了对目标分析物的高容量和高选择性结合。但是，基于表面纳米仿生人工抗体研究及其在痕量农药残留检测中应用的文献几乎未见报道。因此，深入开展纳米人工抗体的制备、探索分子识别特性、研究高灵敏信号输出规律和传感器应用方面的基础研究，对于发展高选择性、高度集成化和微型化的化学生物传感器件具有重要的实际和理论意义，并在痕量物质探测、环境监控等领域具有十分广泛的应用前景。

百草枯是一种快速灭生性除草剂，具有触杀作用和一定内吸作用。能迅速被植物绿色组织吸收，使其枯死。百草枯对人毒性极大，且无特效解毒药，口服中毒死亡率可达90%以上，随着除草剂的广泛应用，百草枯中毒现象日渐普遍，并已成为继急性有机磷中毒之后的常见农药中毒，且中毒人数呈逐年上升的趋势。高灵敏度的仪器分析法和快速有效的免疫分析法正逐渐被应用于百草枯残留的检测，目前已有的测定方法可概括为三类：活生物体分析法、仪器分析法、免疫化学分析法。这些测定方法虽然检测速度快，结果准确度高，检测过程操作简单。但是它们的前处理过程复杂，操作繁琐，而且需要昂贵的仪器设备和训练有素的操作人员，完成一次分析费时和费用高，不能满足大量样品的快速检测需要。综上所述，寻找一种快速和便捷的检测百草枯的方法是很有必要的。为了减少农药残留百草枯分子对人体的伤害，利用百草枯分子印记的PSSiO₂人工抗体对痕量百草枯进行选择性识别和检测，这种方法具有选择性好，灵敏度高，成本低，方便简单的优点。

农药残留分子印记的芯-壳型人工抗体的制备方法一直也是材料科学领域研究的热点。通过制备零维纳米粒子表面的包覆，可以改变核的表面特性，增加粒子的稳定性和介质中的分散性，提高材料的综合应用，使之更有利于作为高分子合金、复合材料、涂料、粘合剂等的改性剂，也可以扩大其应用价值，使在医学、环保、精细化工等领域获得更广泛的应用。这种芯-壳型结构的复合微球的制备方法既有物理法也有化学法，物理法主要有带相反电荷微球之间的凝聚法、层层自组装法；化学法主要有传统乳液聚合法、细乳液聚合法、分散聚合法、悬浮聚合法等。

东北林业大学陈立钢等人公开了发明专利（CN201310378769.2）“一种碳纳米管基磁性有机磷分子印记聚合物及其制备方法和应用”，该发明的聚合物包含碳纳米管、FeCl₃·6H₂O、交联剂和功能单体。方法：一、将碳纳米管活化；二、加FeCl₃·6H₂O处理后收集磁性物质；三、分散后加入正硅酸四乙酯；四、分散后收集磁性物质；五、制备具有模板分子的磁性分子印记聚合物；六、即得该聚合物。该发明的聚合物作为吸附剂用于复杂样品中有机磷农药残留的选择性萃取分离。新疆生产建设兵团公安局陈建虎等人公开了发明专利（CN201210167693.4）“一种磁性有机磷农药分子印记纳米微球制备方法及其应用”，首先以胶体沉淀法制备Fe₃O₄磁性颗粒，再用硅烷偶联剂γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷对其表面进行包覆制得Fe₃O₄SiO₂纳米微球，然后以此纳米微球为磁性中心采用悬浮聚合法制备以有机磷农药为模板分子的磁性分子印记聚合物微球。该发明的优点：制备得到的分子印记磁性纳米微球粒径均一、大小可控，结构均匀，制备方法更灵活，重复性好；应用范围更广泛。济南大学于京华等公开了发明专利（CN201010507579.2）“壳状分子印记聚合物的合成及其在残留杀虫剂的检测应用”，该分子印记聚合物微球的制备，包括以下步骤：介孔材料的制备；介孔材料的表面修饰；表面分子印记聚合物的合成；进一步将分子印记微球制作成球壳结构。一种检测微量杀虫剂残留物的方法，包括如下步骤：将聚合物置于制作好的柱子中制作流通池；然后将该流通池接入流路进行化学发光信号强度的检测。本发明的分子印记聚合物的特异性强，灵敏度高，可以达到将聚合物置于柱子中，然后接入流路，进行化学发光信号强度的检测可达到μg级；完成一个基本检测过程仅需3-5分钟的时间。

芯-壳型结构的PSSiO₂聚合物微球的应用广泛，这种复合聚合物微球的制备方法也是越来越多样。芯-壳型结构的PSSiO₂复合微球的应用广泛，这种复合微球的制备方法也是越来越多样。ElhamEffati科研小组报道了通过蒸馏沉淀聚合法合成了单分散的聚合物微球（PowderTechnology,2013,246,473-477）；AndrezadeSousa科研小组报道了介孔PSSiO₂复合微球用于药物运输（J.MaterSci,2010,45,1478-1486），通过TEOS水解，在PS聚合物微球表面上包覆SiO₂；G.V.RamaRao科研小组中报道了PSSiO₂复合微球作为分子过滤器的薄膜(Chem.Mater. 2002, 14,5075-5080)。虽然上述制备出来的PSSiO₂复合微球用途广泛，可以作为药物运输，光子设备，分子过滤的薄膜。但是上述制备的PSSiO₂复合微球不具有人工抗体特性，无法识别和检测目标分子，而且上述制备的PSSiO₂复合微球分散性较差，没有识别功能。此外，这种芯-壳型结构的复合微球，壳层的厚度对复合物的性能影响较大。可控壳厚的对百草枯分子具有敏感分子识别的分子印记聚合物可以作为分子识别的载体的替代品，具有更好的实用性和更广阔的应用前景。ElhamEffati科研小组虽然在文章提到重复聚合步骤增加壳层的厚度，但是操作过程繁琐。所以合成一种可控壳厚，分散均匀芯-壳结构对百草枯分子具有识别功能的分子印记（人工抗体）复合微球具有重大意义。

在本发明中，我们报道了一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，所合成的人工抗体中的聚苯乙烯（Polystyrene，PS）微球表面包覆纳米SiO₂壳层，形成芯-壳结构，其特征在于：所述的人工抗体中洗脱位于SiO₂壳层中的印记分子，SiO₂壳层的内部形成具有与印记分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印记分子的人工抗体具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对被目标分析物分子选择性识别和探测。

发明内容

发明目的：针对目前现有技术存在的不足之处，本发明首次合成了带有可控壳厚的对百草枯分子具有敏感分子识别的PSSiO₂人工抗体的化学制备方法。所述方法为化学合成法，首先制备的单分散表面携带羧基的PS微球，以PS微球作为核，然后再进行化学反应在其表面包覆上SiO₂，形成芯-壳型结构，壳层中去除印记分子后，具有对农药百草枯分子选择性识别和检测的PSSiO₂人工抗体复合微球。

本发明的技术方案是：一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，所合成的人工抗体中的聚苯乙烯（Polystyrene，PS）微球表面包覆纳米SiO₂壳层，形成芯-壳结构，其特征在于：所述的人工抗体中洗脱位于SiO₂壳层中的印记分子，SiO₂壳层的内部形成具有与印记分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印记分子的人工抗体具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对目标分析物分子选择性识别和探测，本发明的制备过程包括如下两个步骤：

1.1第一步是PS微球的合成：首先，将8mL~12mL苯乙烯、0.5mL~1.5mL丙烯酸和80mL~100mL去离子水分别加入到250mL带有磨口塞的锥形瓶中，超声分散5min~10min后，形成混合乳液，然后，用精度为万分之一电子天平称取0.0500g~0.0800g的引发剂加入到上述混合乳液中，通入10min~15min的高纯氮气，去除混合乳液中的氧气后，将锥形瓶密封后放置在可程序升温摇床中，聚合时设置程序升温至70℃，在摇床中以300rpm条件下聚合反应12h~15h，最后，在80℃和300rpm条件下熟化2h~3h，将所得到聚合反应产物分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别在上述离心洗涤后的聚合反应产物中加入40mL去离子水，超声分散得到了单分散的、圆球形的表面带有功能基团PS微球悬浮液；

1.2第二步是目标分析物分子印记的PSSiO₂复合微球的合成：从上述洗净后分散在50mL的离心管中取10mL的PS微球悬浮液，移入到250mL的锥形瓶中，超声分散5min~10min，再用浓度为1molL^-1~2molL^-1强碱调节pH值至10，然后分别量取4mL~6mL的印记分子，80mL的无水乙醇，150uL~200uL的正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS），2mL的氨水移入到上述锥形瓶混合溶液中，将锥形瓶用磨口塞塞紧，并用保鲜膜包裹，再用橡皮筋缠绕包扎，最后将密封好的锥形瓶放置摇床中在室温下以300rpm震荡反应13h~15h，制得在PS微球的表面包覆了一层均匀的SiO₂外壳，形成壳层厚度可控的分子印记的芯-壳型PSSiO₂复合微球；

将所得到PSSiO₂复合微球分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别在上述离心洗涤后的复合微球中加入20mL去离子水，超声分散，分别再加入适量的乙酸，放置摇床中在室温下以300rpm震荡1h~2h，将印记分子从印记位点中洗脱至溶液中，再将洗脱后的溶液以8000rpm~10000rpm转速离心5min~10min，离心后的溶液倒去上清液，然后用无水乙醇超声、离心、洗涤3次，最后再用去离子水超声、离心、洗涤3次，得到具有选择性识别印记分子的芯-壳型PSSiO₂人工抗体。

作为对现有技术的进一步改进，所说的制备的人工抗体中苯乙烯是已经除去了阻聚剂，固体杂质和聚合物。所说的制备的人工抗体中目标分析物分子和印记分子是百草枯分子。所说的制备的人工抗体中引发剂是过硫酸铵。所说的制备的人工抗体中PS微球表面携带的功能基团为羧基。所说的制备的人工抗体中PS微球表面所携带负电的功能基团羧基与带正电的目标分析物百草枯分子通过阴阳离子对的静电引力相互作用。

相对于现有技术的有益效果：

目前分子印记技术检测残留农药分子从传统的分子印记合成材料过渡表面分子印记材料，再过渡到在分子印记材料的识别位点修饰标记荧光探针，最后到纳米结构分子印记材料，反映了分子印记技术的不断创新和变革。但是，目前通过传统方法制得的印记聚合物在分子识别和信号输出实际应用中面临许多需要克服的难点，概括起来可分为以下几个方面：（1）由于分子印记聚合物的交联密度高，处于交联网络内部的模板分子无法完全除去（Markowitz,M.A.;Kust,P.R.;Deng,G.;Schoen,P.E.;Gaber,B.P.Langmuir 2000,16,.1759.；Rao,M.S.;Dave,B.C.J.Am.Chem.Soc. 1998,120,13270.）；（2）由于有效位点的数量小，对目标分子的亲和力小；（3）目标分子很难扩散进入网络内部的印记点，所以对目标分子的结合动力学慢；（4）分子印记聚合物通常是无规则形状的材料，与传感器件的兼容性差。（5）目标分析物进入识别位点自身无法以敏感信号输出，因此，传统方法合成出来的分子印记聚合物常常表现高选择性、低的结合容量和差的位点可接近性、慢的结合动力学以及目标分析物进入识别位点自身无法以敏感信号输出特点，鉴于此合成高选择性、结合容量高、位点容易接近、结合动力学速度快和高敏感信号输出的并具有规则形貌的分子印记聚合物材料一直是人们追求的目标（Hayden,O.;Mann,K.J.;Krassnig,S.;Dickert,F.L.Angew.Chem.Int.Ed. 2006,45,2626.；Schmidt,R.H.;Mosbach,K.;Haupt,K.Adv.Mater. 2004,16,719.）。一些化学和材料科学家已经发展出几种新的印记技术来改进传统印记材料的分子识别特性，例如，表面印记，薄膜印记和单分子树枝状印记等（Yilmaz,E.;Haupt,K.;Mosbach,K.Angew.Chem.Int.Ed. 2000,39,2115.；Titirici,M.M.;Hall,A.J.;Sellergren,B.Chem.Mater. 2003,15,822.）。

表面印记通过共价键将模板分子键合到固体表面也存在一些问题，主要表现在一是需要通过复杂的化学反应将模板分子键合到固体表面，反应条件复杂，而反应效率又直接影响印记材料表面印记位点的多少，因此通过这种方式产生的表面印记聚合物往往其表现出低的结合容量（Bossi,A.;Piletsky,S.A.;Piletska,E.V.;Turner,A.P.F.Anal.Chem. 2001,73,5281.）；另一方面良好的修饰反应不多，目前文献报导的主要是基于生成热逆键—异氰酸酯（Ki,C.D.;Oh,C.;Oh,S-G,Chang,J.Y.J.Am.Chem.Soc. 2002,124,14838.）和醛基—氨基作用（Yang,H.H.;Zhang,S.Q.;Zhuang,Z.X.;Wang,X.R.J.Am.Chem.Soc. 2005,127,1378.；Li,Y.;Yang,H.H.;You,Q.H.;Zhuang,Z.X.;Wang,X.R.Anal.Chem., 2006,78,317.）。鉴于上述原因，传统材料表面分子印记技术并没有得以在实际应用中推广。

近年来，纳米材料的制备技术发展为解决分子印记材料所面临的困难带来了新的机遇。纳米结构的分子印记材料与传统的印记材料相比具有下列明显的优势：（1）由于巨大的比表面积，模板分子几乎都处于纳米结构的表面或者表面附近，使得模板分子能够几乎完全除去；（2）模板分子的完全除去，能够产生高密度的有效印记点，因此对目标分子具有高的亲和力；（3）分子印记点都处于纳米结构的表面或者表面附近，扩散阻力小，因此结合动力学快；（4）纳米结构的分子印记材料具有规整的形状，在实际应用中可以组装到传感器上（Gao,D.M.;Zhang,Z.P.;Wu,M.H.J.Am.Chem.Soc. 2007,129,7859.）；（5）由于纳米结构的分子印记表面容易进行化学修饰和功能化。

其一：相对于现有技术，本发明中在分散性好的PS微球表面包覆了一层具有识别性能的SiO₂纳米壳层，不仅增加了聚合物的比表面积，且使所有的识别位点位于纳米壳层中，这样就增加了识别位点数量，提高了识别效率，结合量和选择性。

其二：本发明所提供的方法中，可控壳厚的芯壳结构PSSiO₂复合微球的壳厚度能够通过调整TEOS的量加以控制。即带有识别性能纳米壳的厚度是可以控制的，因此，可以通过优化反应条件得到适合需要的纳米壳层的复合微球。

其三：与传统的分子印记聚合物相比较，纳米分子印记PSSiO₂复合微球具有较大的比表面积，较多的识别位点，较大的结合量，提高分子识别性能和选择性以及识别效率。

其四：合成的PS微球表面包覆了SiO₂，且PS微球表面携带羧基的优点如下：（1）合成的复合微球的壳层厚度可控，其PS微球粒径大约为400nm，较大的表面积，合成过程简单；（2）在反应过程中具有化学和热的稳定性不与有机溶剂反应；（3）表面容易嫁接有机官能团；（4）对环境无害；（5）印记壳层识别位点刚性强不易坍塌，选择性好。

附图说明

图1是本发明所制备的PSSiO₂复合微球具有对目标分子选择性识别和检测的示意图。

图2是本发明所制备的表面携带羧基的PS微球的SEM图。

图3是本发明所制备的PS微球的红外光谱图。

图4是本发明所制备的PS微球表面包覆SiO₂纳米壳层复合微球的SEM图（A）、TEM图（B）、PSSiO₂复合微球表面能谱图（C）和PSSiO₂复合微球表面元素的百分含量图（D）。

图5是本发明所制备的百草枯农药分子印记和非印记PSSiO₂等温吸附曲线图。

图6是本发明所制备的百草枯农药分子印记与非印记分子PSSiO₂的动力学曲线。

根据附图进一步解释具体实施方式

图1是本发明所制备的PSSiO₂复合微球具有对目标分子选择性识别和检测的示意图。具体过程如下：1~2过程表示的是苯乙烯、丙烯酸分散在水中，加入引发剂，在氮气气氛下聚合反应制备得到表面携带羧基的聚苯乙烯微球；2~3过程表示的是表面携带羧基功能单体的PS微球，其表面的羧基与百草枯分子通过静电相互作用，包覆在PS微球的表面，再在其表面包覆一层可控壳厚的SiO₂壳层，形成了表面印记目标分子的PSSiO₂人工抗体复合微球；3~4过程表示的是洗脱目标分子和再结合目标分子的可逆过程，形成了识别和检测目标分子的人工抗体。

图2是本发明所制备的表面携带羧基的PS微球的SEM图。本实验是通过无皂乳液合成法合成了PS微球，反应是在摇床中进行，反应较均匀，通过扫描电子显微镜（SEM）观察，可以看出合成的PS微球大小比较一致，粒径大概在400nm左右，且表面比较光滑。

图3是本发明所制备的PS微球的红外光谱图。图中位于699cm^-1、756cm^-1的峰为聚苯乙烯苯环上氢原子的面外变形振动（δC-H）吸收峰，位于1452cm^-1、1494cm^-1、1602cm^-1的峰为聚苯乙烯苯环的环振动（νC-C）吸收峰，位于3025cm^-1的峰为聚苯乙烯苯环上C-H的伸缩振动（νC-H）吸收峰，位于2851cm^-1、2921cm^-1的峰为聚苯乙烯碳链上饱和C-H的伸缩振动（νC-H）吸收峰。从图中可以看到红外光谱图在1820cm^-1～1570cm^-1内出现了比较明显的吸收峰，在这区间出现吸收峰，说明PS微球表面含有羧基，因为在红外检测中羧基的吸收峰就是在1820cm^-1～1570cm^-1出现。由此说明，所制备的PS微球表面富含羧基。

图4是本发明所制备的PS微球表面包覆SiO₂纳米壳层复合微球的SEM图（A）、TEM图（B）、PSSiO₂复合微球表面能谱图（C）和PSSiO₂复合微球表面元素的百分含量图（D）。图4（A）SEM显示本发明所制备的的PSSiO₂复合微球的表面凹凸不平，有突起的部分，而未包覆SiO₂的PS微球表面光滑平整。图4（B）TEM图显示加入TEOS水解后包覆在PS微球表面的SiO₂是典型的PSSiO₂的芯-壳结构，在PS微球的表面形成了SiO₂薄壳层，由于两者密度不同，二氧化硅密度大于聚苯乙烯的密度，所以在TEM中壳层SiO₂比核PS粒子颜色深。再通过对微球的成分分析（C），所合成的微球含碳量非常高（D），主要是因为聚苯乙烯碳链中碳含量高。合成的微球中的含氧量约是硅量的两倍，是因为TEOS水解产生的SiO₂，所以可以判断PS微球表面包覆了SiO₂壳层。

图5是本发明所制备的百草枯农药分子印记和非印记PSSiO₂等温吸附曲线图。图5是两种分子印记材料的饱和等温吸附曲线：(a)印记分子PSSiO₂复合物微球；(b)非印记分子PSSiO₂复合物微球。可见，印记PSSiO₂复合物微球具有更高的饱和吸附量，是非印记分子复合物微球的近3.5倍。

图6是本发明所制备的百草枯农药分子印记与非印记分子PSSiO₂的动力学曲线。图6是两种分子印记材料的动力学曲线。(a)印记分子PSSiO₂复合物微球；(b)非印记分子PSSiO₂复合物微球。可见，印记PSSiO₂复合物微球具有更快的吸附动力学曲线，是非印记分子复合物微球的近67倍。

具体实施方式

一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，所合成的人工抗体中的聚苯乙烯（Polystyrene，PS）微球表面包覆纳米SiO₂壳层，形成芯-壳结构，其特征在于：所述的人工抗体中洗脱位于SiO₂壳层中的印记分子，SiO₂壳层的内部形成具有与印记分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印记分子的人工抗体具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对目标分析物分子选择性识别和探测，本发明的制备过程包括如下两个步骤：

第一步是PS微球的合成：首先，将8mL~12mL苯乙烯、0.5mL~1.5mL丙烯酸和80mL~100mL去离子水分别加入到250mL带有磨口塞的锥形瓶中，超声分散5min~10min后，形成混合乳液，然后，用精度为万分之一电子天平称取0.0500g~0.0800g的引发剂加入到上述混合乳液中，通入10min~15min的高纯氮气，去除混合乳液中的氧气后，将锥形瓶密封后放置在可程序升温摇床中，聚合时设置程序升温至70℃，在摇床中以300rpm条件下聚合反应12h~15h，最后，在80℃和300rpm条件下熟化2h~3h，将所得到聚合反应产物分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别将上述离心洗涤后的聚合反应产物中加入40mL去离子水，超声分散得到了单分散的、圆球形的表面带有功能基团PS微球悬浮液；

第二步是目标分析物分子印记的PSSiO₂复合微球的合成：从上述洗净后分散在50mL的离心管中取10mL的PS微球悬浮液，移入到250mL的锥形瓶中，超声分散5min~10min，再用浓度为1molL^-1~2molL^-1强碱调节pH值至10，然后分别量取4mL~6mL的印记分子，80mL的无水乙醇，150uL~200uL的正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS），2mL的氨水移入到上述锥形瓶混合溶液中，将锥形瓶用磨口塞塞紧，并用保鲜膜包裹，再用橡皮筋缠绕包扎，最后将密封好的锥形瓶放置摇床中在室温下以300rpm震荡反应13h~15h，制得在PS微球的表面包覆了一层均匀的SiO₂外壳，形成壳层厚度可控的分子印记的芯-壳型PSSiO₂复合微球；

将所得到PSSiO₂复合微球分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别在上述离心洗涤后的复合微球中加入20mL去离子水，超声分散，分别再加入适量的乙酸，放置摇床中在室温下以300rpm震荡1h~2h，将印记分子从印记位点中洗脱至溶液中，再将洗脱后的溶液以8000rpm~10000rpm转速离心5min~10min，离心后的溶液倒去上清液，然后用无水乙醇超声、离心、洗涤3次，最后再用去离子水超声、离心、洗涤3次，得到具有选择性识别印记分子的芯-壳型PSSiO₂人工抗体。

实施例：根据无皂乳液反应，采用两步反应可得到纳米复合微球。

首先，将10mL纯化后的苯乙烯、1mL丙烯酸和90mL去离子水分别加入到250mL带有磨口塞的锥形瓶中，超声分散8min后，形成混合乳液，然后，用精度为万分之一电子天平称取0.0650g的引发剂加入到上述混合乳液中，通入15min的高纯氮气，去除混合乳液中的氧气后，将锥形瓶密封后放置在可程序升温摇床中，聚合时设置程序升温至70℃，在摇床中以300rpm条件下聚合反应14h，最后，在80℃和300rpm条件下熟化2h，将所得到聚合反应产物分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别在上述离心洗涤后的聚合反应产物中加入40mL去离子水，超声分散得到了单分散的、圆球形的表面带有功能基团PS微球悬浮液；

最后，从上述洗净后分散在50mL的离心管中取10mL的PS微球悬浮液，移入到250mL的锥形瓶中，超声分散8min，再用浓度为1.5molL^-1强碱调节pH值至10，然后分别量取5mL的印记分子，80mL的无水乙醇，180uL的正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS），2mL的氨水移入到上述锥形瓶混合溶液中，将锥形瓶用磨口塞塞紧，并用保鲜膜包裹，再用橡皮筋缠绕包扎，最后将密封好的锥形瓶放置摇床中在室温下以300rpm震荡反应14h，制得在PS微球的表面包覆了一层均匀的SiO₂外壳，形成壳层厚度可控的分子印记的芯-壳型PSSiO₂复合微球；

将所得到PSSiO₂复合微球分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别在上述离心洗涤后的复合微球中加入20mL去离子水，超声分散，分别再加入适量的乙酸，放置摇床中在室温下以300rpm震荡1h~2h，将印记分子从印记位点中洗脱至溶液中，再将洗脱后的溶液以8000rpm~10000rpm转速离心5min~10min，离心后的溶液倒去上清液，然后用无水乙醇超声、离心、洗涤3次，最后再用去离子水超声、离心、洗涤3次，得到具有选择性识别印记分子的芯-壳型PSSiO₂人工抗体。

Claims (8)

1.一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，所合成的人工抗体中的聚苯乙烯（Polystyrene，PS）微球表面包覆纳米SiO₂壳层，形成芯-壳结构，其特征在于：所述的人工抗体中洗脱位于SiO₂壳层中的印记分子，SiO₂壳层的内部形成具有与印记分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印记分子的人工抗体具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对目标分析物分子选择性识别和探测，本发明的制备过程包括如下两个步骤：

1.1第一步是PS微球的合成：首先，将8mL~12mL苯乙烯、0.5mL~1.5mL丙烯酸和80mL~100mL去离子水分别加入到250mL带有磨口塞的锥形瓶中，超声分散5min~10min后，形成混合乳液，然后，用精度为万分之一电子天平称取0.0500g~0.0800g的引发剂加入到上述混合乳液中，通入10min~15min的高纯氮气，去除混合乳液中的氧气后，将锥形瓶密封后放置在可程序升温摇床中，聚合时设置程序升温至70℃，在摇床中以300rpm条件下聚合反应12h~15h，最后，在80℃和300rpm条件下熟化2h~3h，将所得到聚合反应产物分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别在上述离心洗涤后的聚合反应产物中加入40mL去离子水，超声分散得到了单分散的、圆球形的表面带有功能基团PS微球悬浮液；

1.2第二步是目标分析物分子印记的PSSiO₂复合微球的合成：从上述洗净后分散在50mL的离心管中取10mL的PS微球悬浮液，移入到250mL的锥形瓶中，超声分散5min~10min，再用浓度为1molL^-1~2molL^-1强碱调节pH值至10，然后分别量取4mL~6mL的印记分子，80mL的无水乙醇，150uL~200uL的正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS），2mL的氨水移入到上述锥形瓶混合溶液中，将锥形瓶用磨口塞塞紧，并用保鲜膜包裹，再用橡皮筋缠绕包扎，最后将密封好的锥形瓶放置摇床中在室温下以300rpm震荡反应13h~15h，制得在PS微球的表面包覆了一层均匀的SiO₂外壳，形成壳层厚度可控的分子印记的芯-壳型PSSiO₂复合微球；

将所得到PSSiO₂复合微球分别均分至三支50mL离心管中，离心去除未反应底物、再用工业乙醇超声分散，如此反复3次，最后分别在上述离心洗涤后的复合微球中加入20mL去离子水，超声分散，分别再加入适量的乙酸，放置摇床中在室温下以300rpm震荡1h~2h，将印记分子从印记位点中洗脱至溶液中，再将洗脱后的溶液以8000rpm~10000rpm转速离心5min~10min，离心后的溶液倒去上清液，然后用无水乙醇超声、离心、洗涤3次，最后再用去离子水超声、离心、洗涤3次，得到具有选择性识别印记分子的芯-壳型PSSiO₂人工抗体。

2.根据权利要求1所述的一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征是：所说的制备的人工抗体中苯乙烯是已经除去了阻聚剂，固体杂质和聚合物。

3.根据权利要求1所述的一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征是：所说的制备的人工抗体中目标分析物分子和印记分子是百草枯分子。

4.根据权利要求1所述的一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征是：所说的制备的人工抗体中引发剂是过硫酸铵。

5.根据权利要求1所述的一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征是：所说的制备的人工抗体中PS微球表面携带的功能基团为羧基。

6.根据权利要求1所述的一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征是：所说的制备的人工抗体中PS微球表面所携带负电的功能基团羧基与带正电的目标分析物百草枯分子通过阴阳离子对的静电引力相互作用。

7.根据权利要求1所述的一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征是：所说的制备的人工抗体中芯-壳型PSSiO₂复合微球的SiO₂壳层厚度可以通过调节TEOS的量来控制。

8.根据权利要求1所述的一种用于探测百草枯分子的PSSiO₂人工抗体的制备方法，其特征是：所说的制备的人工抗体中调节溶液pH值的强碱是NaOH。