CN110183594A - 基于sba-15的黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子印迹聚合物领域，公开了一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其农作物检测方面应用。以合成的SBA‑15为载体，利用MPS对SAB‑15进行后功能化，再以6‑苯基‑4‑甲基‑2‑色满酮为替代模板，合成了AFs表面印迹聚合物SBA‑15@MIPs。实验表明：SBA‑15@MIPs对AFs的吸附速率较快，5min可以达到吸附平衡。SBA‑15@MIPs的吸附量较大（6.71μg mL‑1），将其用作吸附剂制备表面印迹固相萃取柱，与高效液相色谱结合，对食品中黄曲霉毒素进行萃取和分离，得到了一种快速、高效、廉价的黄曲霉毒素样品前处理方法，有利于开发农作物毒素检测样品前处理，解决当前前处理方法成本高，耗时长的问题。

Description

基于SBA-15的黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其应用
技术领域
本发明属于分子印迹聚合物领域，涉及一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其农作物检测方面应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)对粮食作物的污染的是危害食品安全的重要因素之一，受到了人们广泛的关注。AFs属于真菌毒素的一种，是黄曲霉菌感染农作物后产生的有毒代谢产物，对人体中的一些生物系统和器官具有严重的的毒害和致癌作用作用。黄曲霉菌代谢产生的AFs会被留在农产品当中，若农产品被加工成食品，人类食用后会对人体造成损害；若农产品被加工成饲料喂养牲畜，AFs会在牲畜体内聚集，当人们使用肉类产品仍会受到AFs的危害。AFs种类较多，不同种类AFs的结构有一些差别，其中黄曲霉毒素G2，G1，B2和B1(AFG2，AFG1，AFB2和AFB1)结构类似，是AFs中对人体的毒害最大的四种。
AFs具有很好的稳定性，通过普通的光照等方法不能将农作物中的AFs分解。由于AFs对农作物的污染范围大、种类多，分布广阔，各个国家的地区的农作物都会受到AFs的污染，如花生、玉米、大豆、小麦、木耳、各种水果等。因此，世界各国和地区制定了食品中AFs的限量标准。
由于AFs对食品的严重的污染性和对人类健康的严重威胁，因此AFs的检测方法的开发越来越受到世界各国的科学工作者们关注。目前，针对AFs的检测有许多中方法，使用色谱法、光谱法、免疫法、生物传感器等都可以对AFs进行检测。但是实际样品的前处理过程是制约检测的灵敏度的重要因素。前处理过程既要富集目标物质，也要排除杂质的干扰，防止杂质的存在对检测的灵敏度造成影响。因此，如何建立一种快速、高效的AFs样品的前处理方法成为研究热点之一。
在检测四种AFs时，使用了多种样品前处理方法。第一种，样品前处理使用免疫亲和柱；第二种，样品前处理使用固相萃取法；第三种，样品前处理使用免疫亲和柱；第四种为酶联免疫吸附筛查法；第五种为薄层色谱法。而这五种前处理技术也是技术较为成熟的处理AFs的方法。
液液萃取法是利用有机试剂对AFs不同的溶解能力萃取AFs。因此，液液萃取法需要用到大量的有机试剂，如甲醇、乙腈等，导致前处理的成本较高，并会对环境造成危害。而且液液萃取法使用有机试剂将AFs从样品中萃取出来需耗费大量的时间。同时，由于实际样品中基质比较复杂，能够溶于有机试剂中的杂质较多，在使用液液萃取法萃取AFs的同时，有可能将其他杂质同AFs一起萃取到有机试剂中，从而影响检测结果的准确性。
固相萃取法通过吸附剂对样品中目标物和杂质的保留能力的不同，可以分离目标物和杂质。通常是将硅胶、C18等固定相装入固相萃取小柱中，制成固相萃取柱，利用柱填料对AFs的吸附能力将AFs富集到柱填料上，选取AFs的不良溶剂洗去杂质，最后用AFs的良溶剂洗脱AFs。使用固相萃取柱对AFs进行前处理可以一步完成样品的富集与净化。使用固相萃取柱对实际样品进行前处理具有以下优点：操作简便，节省试剂，重现性好，价格较低。但固定相对AFs没有特异性吸附能力，容易将其他杂质吸附到固定相上，会影响含有AFs样品的检测结果。
免疫亲和萃取法是利用生物学中抗原与抗体能够特异性识别的原理，以抗原抗体中的一方作为配基亲和吸附AFs。但是，免疫亲和柱的存放条件较为严格，需要低温进行保存，而在使用免疫亲和柱是需要在常温下使用，这就限制了免疫亲和柱的使用。而且使用免疫亲和柱检测实际样品花费较大。
酶联免疫吸附筛查法是利用酶的颜色反应对AFs进行筛查。但是酶联免疫吸附筛查法检测AFs无法做到准确定量，若检测出样品中含有AFs，还需使用其他方法进行准确定量。
现行的AFs样品前处理方法都有各自的缺点，因此，需要研发一种价格低廉、适用范围广、灵敏度高的AFs的前处理方法。
目前，使用分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)MIPs作为吸附剂，制备分子印迹固相萃取(Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction，MIPSE)柱用于样品前处理的技术受到人们的关注。使用MIPSE柱不仅操作简单，且萃取和分离能够一步完成，还具有对目标物质进行特异性吸附的能力。因此分子印迹与固相萃取相结合能够一步完成对目标分子的萃取、富集，操作简便且可以自动化处理批量样品，节省前处理时间，减少操作产生的误差，节省大量有机试剂，对环境保护有益，而且经济适用，节约检测成本，可大规模应用于食品安全、环境保护、农药残留和爆炸物检测等多个方面。
虽然分子印迹与固相萃取相结合的方法能够有效的萃取目标分子，但传统的分子印迹聚合物也存在一些缺点：不易将模板分子完全洗脱；传质速率较低；聚合物形状不规则；吸附量较低等(Wang Y,Yang Y,Lan X,et al.Bisphenol A sensing based onsurface molecularly imprinted,ordered mesoporous silica[J],ElectrochimicaActa,2011,56(5):2105-2109.；Hongliang H,Xiaoli G,Liying S,et al.Molecularlyimprinted polymers based on SBA-15for selective solid-phase extraction ofbaicalein from plasma samples[J],Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015,407(2):509-519.)，而表面印迹技术能够很好地弥补以上缺点。表面分子印迹技术常用的方法是将具有作用位点的印记聚合物接枝或包覆在载体材料表面，这样使得作用位点暴露在表面分子印迹聚合物的近表面、表面，增加传质速率和效率。相比于传统印迹技术，表面印迹聚合反应发生在载体表面，使能够对目标分子特异性识别的结合位点更多的暴露在吸附材料的表面，具有更大的比表面积，传质速率更高，有利于模板的洗脱和再次结合。
表面印迹聚合物需要合适的载体，载体的选择影响着表面印迹聚合物的吸附性能(Hu X,Xie L,Guo J,et al.Hydrophilic gallic acid–imprinted polymers overmagnetic mesoporous silica microspheres with excellent molecular recognitionability in aqueous fruit juices[J],Food Chemistry,2015,179:206-212.)。为了达到所需的形态结构，合适的粒径和孔径，载体材料的选择显得尤为重要。因此选择新型的、比表面积大、吸附能力强的载体材料，并将其应用于毒素的分析变得更有意义。常用的载体材料具备多孔性、表面可修饰等特点，目前研究较多的有氧化石墨烯、磁性四氧化三铁、碳纳米管和金属有机骨架等。其中金属有机骨架材料作为一种新型纳米材料，因其具有高稳定性、结构易于调控、易功能化、合成条件温和，引起了广泛的关注和研究。目前未见利用SBA-15做为载体制备表面分子印迹聚合物用于小麦毒素的检测。
发明内容
针对小麦等农作物中真菌毒素的样品前处理，本发明目的在于研发出一种快速、灵敏且价格低廉的黄曲霉毒素表面印迹聚合物，替代免疫亲和柱，实现小麦等农作物黄曲霉毒素的检测。
为实现本发明目的，技术方案如下：
考虑到AFs毒性极大，价格昂贵，本发明选择6-苯基-4-甲基-2-色满酮为替代模板，SBA-15为表面印迹聚合物的载体，在SBA-15表面合成一层分子印迹聚合物，从而制备成AFs表面印迹聚合物SBA-15@MIPs。
具体通过如下方法制备而成：
(1)SBA-15接枝MPS
SBA-15分散在干燥的甲苯中，加入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(Methacryloxy Propyl Trimethoxyl Silane，MPS)，在N2气氛下搅拌反应，经洗涤，干燥，得到SBA-15-MPS。
(2)SBA-15@MIPs的合成
称取模板分子6-甲基-4苯基-2-色满酮，SBA-15-MPS，加入单体α-甲基丙烯酸(α-MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA)，再加入偶氮二异丁腈(AIBN)，超声反应；然后加入乙醇，搅拌，加热反应，反应完成后经洗涤，干燥，得目标物。
优选条件：模板分子6-甲基-4苯基-2-色满酮与α-MAA和EGDMA用量的比例(摩尔比)为：1:4:30，反应温度85℃。
将本发明合成的表面印迹聚合物SBA-15@MIPs作为自制柱填料，应用于样品中毒素的分离与分析，对小麦样品进行前处理实验，分析发现，本发明自制柱均可以良好的选择性吸附黄曲霉毒素，在选择性和吸附能力方面，本发明自制柱对黄曲霉毒素的效果表现更好。SBA-15@MIPs对黄曲霉毒素的吸附量达到6.71μg mL-1)和吸附速率5min内达到吸附平衡，较快的传质速度有利于固相萃取柱对样品的处理。
对比本发明自制柱、免疫亲和柱和商品固相萃取柱对小麦中黄曲霉毒素的处理效果，结果表明：本发明自制柱对含有黄曲霉毒素的实际样品具有更好的处理效果。
通过实验对方法进行评价：线性范围是0.5μg kg-1-100μg kg-1，R2＝0.9990-0.9993，对黄曲霉毒素G2，G1，B2和B1的检出限分别为0.05μg kg-1，0.03μg kg-1，0.05μg kg-1和0.05μg kg-1；定量限分别为0.3μg kg-1，0.1μg kg-1，0.3μg kg-1和0.2μg kg-1。黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的加标回收率分别为98.9％-119.7％，相对标准偏差范围为3.07％-5.76％。
本发明创新点：首先对SBA-15进行修饰，将MPS接枝到SBA-15的表面，使SBA-15裸露较多的碳碳双键。在引发剂作用下，SBA-15表面的碳碳双键与单体和交联剂的碳碳双键进行聚合反应，在SBA-15的表面合成一层分子印迹聚合物，从而制备成AFs表面印迹聚合物SBA-15@MIPs。聚合物不是简单的包裹在载体表面，接枝的方法能够使载体与聚合物更加牢固的结合，不易使聚合物层从载体表面脱落，能更好的用于实际样品富集；该表面印迹聚合物比表面积高、传质速率快，洗脱速率较快、重复使用性好；结合表面分子印迹与固相萃取，制备表面印迹固相萃取柱用于AFs的样品前处理，替代AFs免疫亲和柱。
另外，以6-苯基-4-甲基-2-色满酮为替代模板，降低成本，排除模板泄漏，提高检测结果的准确性。结合高效液相-荧光检测器，为小麦中黄曲霉毒素的分离、分析与检测提供了一种新的低成本、低耗时以及高灵敏的检测方法。
附图说明
图1为SBA-15和SBA-15@MIPs的SEM图；A、B：SBA-15的SEM图；C、D：SBA-15@MIPs的SEM图；
图2为SBA-15和SBA-15@MIPs的EDX图；
图3为SBA-15、SBA-15-MPS和SBA-15@MIPs的红外光谱图；
图4为SBA-15和SBA-15@MIPs的XRD图；
图5为SBA-15@MIPs的等温吸附曲线；A：SBA-15@MIPs和SBA-15@NIPs的等温吸附曲线；B：SBA-15@MIPs和MIPs的吸附速率曲线；C：朗格缪尔吸附等温方程拟合曲线；D：伪二级动力学方程拟合曲线；
图6为SBA-15@MIPs固相萃取柱的重复使用性柱状图；
图7为实际样品检测HPLC-FD色谱图；A：未加标大米；B：加标大米；C：未加标花生；D：加标花生；E：为未加标小麦；F：加标小麦；G：未加标玉米；H：加标玉米。
图8自制柱和免疫亲和柱的效液相色谱对比图；A：AFs标样的高效液相色谱图；B：经AFs免疫亲和柱处理过的加标样品的高效液相色谱图；C：SBA-15@MIPs固相萃取柱处理过的加标样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实施例1
(1)SBA-15的合成
取2.0g P123，加入15mL 12.0mol L-1HCl溶液，90mL蒸馏水，40℃下搅拌3小时，加5.4g正硅酸乙酯(Tetraethyl Orthosilicate，TEOS)，搅拌20h，装入水热反应釜内在100℃下反应48h，过滤，然后用乙醇和水洗涤并干燥。550℃下煅烧5h，去除P123，得到SBA-15。
(2)SBA-15接枝MPS
0.5g SBA-15分散在50mL的干燥甲苯中，加入5mL MPS，在N2气氛下，55℃下搅拌24h，产物先用甲苯洗涤两三次，再用甲醇洗涤，干燥，得到SBA-15-MPS。
(3)SBA-15@MIPs的合成
称取模板分子6-甲基-4苯基-2-色满酮0.071484g(1.0mmol)，1g SBA-15-MPS，加入0.1012mL(4.0mmol)α-MAA，1.6992mL(30mmol)EGDMA，0.04g AIBN于50mL锥形瓶中，加入少量乙醇超声10min，然后移至250mL三口瓶中，加入适量乙醇，在机械搅拌下，85℃油浴锅中反应5h。反应完成后用乙醇和水洗涤，然后干燥。
表面分子非印迹聚合物(SBA-15@NIPs)的合成过程如SBA-15@MIPs(不加模板6-甲基-4苯基-2-色满酮)。
(4)SBA-15@MIPs的表征
取少量合成的SBA-15和SBA-15@MIPs，使用SEM进行表征，观察聚合物表面结构，对比MIPs接枝在SBA-15前后聚合物表面结构的差别。由图1可以看出：SBA-15放大后的表面布满孔道，这些孔道经MPS接上双键，可用于聚合物的接枝。由SBA-15@MIPs的SEM图可以看出：合成的SBA-15@MIPs为单个细小颗粒，由于在表面接枝了聚合物，SBA-15@MIPs和SBA-15的表面结构并不相同。对比SBA-15@MIPs和SBA-15的扫描电镜图可以说明MIPs接枝到了SBA-15的表面，成功合成了AFs表面印迹聚合物SBA-15@MIPs。
取少量合成的SBA-15和SBA-15@MIPs，使用EDX对SBA-15和SBA-15@MIPs的表面元素分布进行检测，如表1和图2所示。SBA-15表面上C，O和Si三种元素所占百分比为：61.28％,19.10％和19.62％。SBA-15@MIPs表面上C，O和Si三种元素所占质量百分比分别为：94.84％，4.66％和0.51％。可以看出，分布在SBA-15@MIPs表面上Si元素所占质量百分比远低于SBA-15表面上Si元素所占质量百分比。而分布在SBA-15@MIPs表面上C元素所占质量百分比远高于SBA-15表面上C元素所占质量百分比。SBA-15主要由含Si元素的化合物合成，因此其表面分布较多Si元素；SBA-15@MIPs表面几乎不含有Si元素，因为SBA-15@MIPs表面是聚合物层，因此SBA-15@MIPs表面元素的分布主要是其表面聚合物层中元素的分布。而聚合物主要由甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯合成，因此其表面分布有较多的C元素。通过对比SBA-15@MIPs和SBA-15的表面元素分布图，可以得知MIPs已经成功接枝到了SBA-15的表面，成功合成了AFs表面印迹聚合物SBA-15@MIPs。
表1 SBA-15和SBA-15@MIPs表面元素分布
取少量合成的SBA-15、SBA-15-MPS和SBA-15@MIPs，使用ATR-FT-IR进行表征，分析谱图，对比MIPs接枝在SBA-15前后聚合物所含官能团的差异。确定SBA-15已成功接枝MPS且MIPs已接枝在SBA-15表面。图3显示了SBA-15、SBA-15@MPS和SBA-15@MIPs的ATR-FT-IR光谱：1052cm-1处吸收峰为Si-O-Si的不对称伸缩振动，806cm-1处为Si-O-Si对称伸缩振动，而443cm-1处为Si-O-Si弯曲振动，这说明实验成功合成介孔二氧化硅SBA-15[77]。从SBA-15@MIPs的ATR-FT-IR光谱可以看出，在1739cm-1、1453cm-1、1388cm-1和1250cm-1处的吸附峰分别属于EGDMA的C＝O、CH2、CH3和OH基团。在1739cm-1处，SBA-15@MIPs和SBA-15@MPS都有吸收峰，而SBA-15在此处没有吸收峰，SBA-15@MIPs的吸收峰来自于MPS、α-MAA和EGDMA，SBA-15@MPS的吸收峰来自于MPS，说明α-MAA和EGDMA在SBA-15表面进行了聚合反应。而且，SBA-15和SBA-15@MPS的特征吸收峰也出现在SBA-15@MIPs的ATR-FT-IR光谱图中。结果表明，在引发剂的作用下，单体α-MAA和交联剂EGDMA在SBA-15表面进行聚合反应，MIPs接枝到了SBA-15的表面，成功合成AFs表面印迹聚合物SBA-15@MIPs。
取少量合成的SBA-15和SBA-15@MIPs，使用XRD进行表征，分析谱图，对比MIPs接枝在SBA-15前后聚合物的差别。通过XRD对SBA-15和SBA-15@MIPs进行表征，如图4所示。可以看出，在23.5°处，SBA-15和SBA-15@MIPs都有X射线衍射峰，说明SBA-15和SBA-15@MIPs具有部分相同结构，即SBA-15。并且，在23.5°处，SBA-15的X射线衍射光强度为1150，要高于SBA-15@MIPs的X射线衍射光强度910。造成这一现象的原因可能是由于MIPs接枝到SBA-15表面上之后，影响了X射线的衍射，从而使SBA-15和SBA-15@MIPs的X射线衍射光强度不同，证明了AFs表面印迹聚合物SBA-15@MIPs的成功合成。
通过等温吸附实验和吸附速率实验对SBA-15@MIPs的吸附性能进行检测，如图5的A图所示：使用1μg mL-1至40μg mL-1的AFs溶液进行等温吸附实验。结果表明，随着AFs初始浓度的增加，SBA-15@MIPs和SBA-15@NIPs对AFs的吸附量逐渐增加。在40μg mL-1的浓度下，SBA-15@MIPs和SBA-15@NIPs对AFs的吸附量分为20.4μg mg-1和12.2μg mg-1。显然，SBA-15@MIPs对AFs的吸附量比SBA-15@NIPs大得多，表明SBA-15@MIPs对AFs具有较好的吸附能力。AFs在SBA-15@NIPs上的弱吸附是由于与非印迹聚合物和介孔二氧化硅SBA-15的非特异性相互作用所致。不同于SBA-15@NIPs对AFs的非特异性吸附，SBA-15@MIPs对AFs的吸附是通过SBA-15@MIPs表面的特异性识别位点产生。SBA-15@MIPs表面的特异性识别位点的尺寸和几何结构与AFs的尺寸和几何结构是互补，而且特异性识别位点表面会与AFs的官能团形成氢键作用。
如图5的B图所示，用10μg mL-1AFs溶液检测SBA-15@MIPs和MIPs的吸附速率，测得SBA-15@MIPs对AFs的最大吸附量分为6.71μg mg-1。SBA-15@MIPs对AFs的吸附在5min达到吸附平衡，比SBA-15@NIPs用时短，显示了表面印迹聚合物对AFs的快速吸附能力。这是由于SBA-15@MIPs的比表面积较大，而且SBA-15@MIPs对AFs的特异性识别位点大多位于SBA-15@MIPs的表面或近表面，因此在AFs接触SBA-15@MIPs表面即被吸附，达到快速吸附效果。而MIPs对AFs的吸附在10分钟左右才达到吸附平衡，是由于其大部分识别位点位于聚合物内部，位于MIPs内部的特异性识别位点对AFs的吸附需要更长的时间。因此，MIPs对AFs的吸附要达到吸附平衡需较长的时间，SBA-15@MIPs具有比MIPs更高的吸附速率。在对含有AFs的实际样品的预处理过程中，使用SBA-15@MIPs能够节省较多的时间，有助于提高样品预处理效率，减小实验误差。
如图5的C图所示，SBA-15@MIPs对AFs的吸附符合朗格缪尔等温吸附模型，具有较高R2值(0.9935)。可以表明，对AFs的吸附过程发生在吸附剂表面，吸附剂内特定的均匀点上，对AFs的吸附近似单分子层吸附，说明SBA-15@MIPs表面的聚合物层较薄，吸附位点在表面。由于SBA-15的大比表面积，接枝在SBA-15表面的聚合物会有更多地用于吸附AFs的位点。而MIPs对AFs的吸附可能还会发生在聚合物内部，不仅吸附速度较慢，也更难洗脱。因此，相较于MIPs，SBA-15@MIPs对AFs的吸附速率更快，吸附量更大。
如图5的D图所示，SBA-15@MIPs对AFs的吸附较为符合伪二阶动力学模型，具有较高R2值(0.9999)。可以表明，SBA-15@MIPs对AFs的吸附过程中可能存在化学作用。与SBA-15@NIPs的物理吸附相比，SBA-15@MIPs的化学吸附对AFs具有更好的吸附能力。
应用例1实际样品分析
(1)实际样品的制备
大米，花生，小麦，大豆和玉米样品皆从当地超市购买。使用粉碎机将样品打成粉末，过筛(<80目)。取5.0±0.1g的样品，加20mL的乙腈/水(84:16，v/v)溶液，振摇20min，玻璃纤维滤纸过滤。取4mL过滤后的溶液，并加入46mL 1％的Tween-20PBS缓冲溶液，将AFs标准溶液加入样品中可配置不同浓度的上样溶液。
(2)自制柱净化
准确称取200mg SBA-15@MIPs用于制备分子印迹固相萃取柱。用10mL甲醇对分子印迹固相萃取柱进行活化，再用10mL蒸馏水洗去甲醇。取10mL AFs实际样品提取液上样，之后用10mL水淋洗。2mL色谱级甲醇洗脱，N2下吹干，2mL流动相溶解，用滤膜过滤，使用HPLC-FD检测溶液浓度。
(3)免疫亲和柱净化
取免疫亲和柱，等柱内液体流完后，用50mL 1ng mL-1的实际样品提取液上样，10mL水淋洗，2mL甲醇洗脱。用滤膜过滤，使用HPLC-FD检测溶液浓度。
(4)重复使用性
SBA-15@MIPs的重复使用性是影响其应用价值的关键因素之一。为检测SBA-15@MIPs的重复使用性，在同一支SBA-15@MIPs固相萃取柱上重复六次活化、上样、淋洗和洗脱步骤。如图6所示，随着重复使用次数的增加，SBA-15@MIPs固相萃取柱对AFs的回收率逐渐降低，但降低的速率较慢，而且在第六个循环的回收率仍大于95％，仍可以用于处理样品。结果表明，SBA-15@MIPs固相萃取柱对AFs的吸附/洗脱具有较高的稳定性和可重复使用性，具有较好的实用价值。
应用例2方法评价
参考国家标准对食品中AFs的限量，以样品基质液为溶剂，AFs为溶质，配置梯度浓度的AFs溶液，过SBA-15@MIPs柱，收取洗脱液进HPLC-FD检测。如表9所示，四种毒素的标准曲线线性范围为0.1μg kg-1-100μg kg-1，R2＝0.9990-0.9993，对AFG2，AFG1，AFB2和AFB1的检出限分别为0.05μg kg-1，0.03μg kg-1，0.05μg kg-1和0.05μg kg-1；定量限分别为0.3μgkg-1，0.1μg kg-1，0.3μg kg-1和0.2μg kg-1。
表2四种AFs检测方法的检出限、定量限和线性范围
为验证方法的可靠性，对四种AFs进行加标回收实验。根据优化好的SBA-15@MIPs固相萃取柱的固相萃取条件，设定1μg kg-1、5μg kg-1和10μg kg-1三个加标浓度，进行加标回收实验。
由表10和表11可以得知：在1μg kg-1、5μg kg-1和10μg kg-1加标浓度下，四种AFs的加标回收率为98.9％-119.7％，RSD范围为3.07％-5.76％。对四种AFs在三个浓度水平的加标回收率的相对标准偏差均小于国家标准方法中规定的15％，说明SBA-15@MIPs固相萃取柱用于食品中四种AFs的检测具有较好的回收率和准确度，可用于实际样品中四种AFs的分析检测。
表3四种AFs的加标回收率
表4四种AFs的加标回收率和精密度
应用例3实际样品检测
为进一步验证SBA-15@MIPs固相萃取柱能够应用于实际样品的分析检测，取在室温下放置一个月的小麦、大米、玉米和花生样品作为实际样品，过SBA-15@MIPs固相萃取柱，收集洗脱液，进HPLC-FD进行检测。
如图7所示：由未加标样品色谱图可以看出，样品中有少量的AFs被检测出来。大米样品检测出AFG1，AFB2；花生样品检测出AFG2；小麦样品检测出AFB2，玉米样品检测出AFG1，AFB2。说明在适宜存放条件下，多种样品都会产生AFs，而且产生的AFs的种类不尽相同，而SBA-15@MIPs柱能有效富集样品中少量的AFs。对比未加标样品和加标样品的色谱图，加标前后，相同保留时间处，四种AFs对应的色谱峰高度明显不同，加标后AFs的色谱峰增高，说明SBA-15@MIPs柱能够有效地萃取实际样品中的AFs。
应用例4自制柱与免疫亲和柱对比
为进一步验证SBA-15@MIPs固相萃取柱在食品中AFs的分析检测中的实际应用价值，将SBA-15@MIPs固相萃取柱与市面上广泛应用的AFs免疫亲和柱进行了对比。取含有相同浓度的AFs实际样品，分别过SBA-15@MIPs固相萃取柱和AFs免疫亲和柱，收集两根柱子的洗脱液，进HPLC-FD进行检测。
如图8所示：图8的A图是AFs标样的色谱图，图8的B图是经AFs免疫亲和柱处理过的加标样品的色谱图，图8的C图是SBA-15@MIPs固相萃取柱处理过的加标样品的色谱图。对比图B和图C可以发现SBA-15@MIPs固相萃取柱和AFs免疫亲和柱对实际样品中的AFs均有较好的萃取能力，两种萃取柱对AFG2和AFB2萃取能力相差无几，但相比于AFs免疫亲和柱，SBA-15@MIPs固相萃取柱对AFG1和AFB1有更好的萃取效果。而且SBA-15@MIPs固相萃取柱生产成本较低，价格低廉，应用前景广泛。

Claims (2)

1.一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物，其特征在于，具体通过如下方法制备而成：
（1）SBA-15接枝MPS
SBA-15分散在干燥的甲苯中，加入3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS），在N2气氛下搅拌反应，经洗涤，干燥，得到SBA-15-MPS；
（2）SBA-15@MIPs的合成
称取模板分子6-甲基-4苯基-2-色满酮，SBA-15-MPS，加入单体α-甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯，再加入偶氮二异丁腈，超声反应；然后加入乙醇，搅拌，加热反应，反应完成后经洗涤，干燥，得目标物。
2.如权利要求1所述的黄曲霉毒素表面印迹聚合物，其特征在于，模板分子6-甲基-4苯基-2-色满酮与α-甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯用量的摩尔比为：1:4:30，反应温度85℃。
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