CN102539587B - 常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

常山酮分子印迹固相萃取柱的制备方法和应用，涉及分析化学领域。该分子印迹固相萃取柱是以常山酮为模板分子，将模板分子溶解于致孔剂中，加入功能单体于低温下进行预聚合。而后按照模板分子:功能单体:交联剂为1:3-6:15-30的摩尔比混合，采用悬浮聚合法低温引发聚合制备分子印迹聚合物微球，所得微球经漂洗、过筛、洗脱和干燥等一系列处理后，湿法填充于固相萃取柱空柱管中，而后经丙酮和甲醇依次润洗后可用于动物源性食品中残留常山酮的选择性吸附、富集和纯化。本发明所制备的常山酮分子印迹固相萃取柱较已有的固相萃取柱具有特异性强、制备简便、识别性能好、成本低廉、所需仪器和反应条件容易实现等特点。

Description

常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体是常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法及其在动物性食品中残留分析时样品的纯化和富集。

背景技术

常山酮是从我国中药常山中提取出的常山碱的衍生物，是一种广谱抗寄生虫药，对鸡的柔嫰、毒害、堆型、变位、巨型和布氏艾美耳球虫均有效，对球虫的子孢子、第一代和第二代裂殖体均有明显的抑杀作用；对大多数革兰氏阳性菌也有效，且无交叉耐药性。常山酮氢溴酸盐作为一种饲料添加剂广泛用于防治家禽的球虫病。在我国，氢溴酸常山酮被允许以3 mg/kg的浓度添加在饲料里，其休药期为4天。为了避免常山酮的残留，许多国家建立了其残留检测方法并对其残留限量作了规定。我国农业部235公告中规定常山酮在牛肌肉、皮/脂、肝和肾组织中的最高残留限量分别为10μg/kg、25μg/kg、30μg/kg和30μg/kg，在鸡/火鸡的肌肉、皮/脂和肝组织中的最高残留限量分别为100μg/kg、100μg/kg和130μg/kg。

常山酮在动物组织中的残留对人类健康和环境生态均有潜在的危害。美国农业部食品安全监督署已将该药列入国家残留检测计划，定期对其残留进行监控。目前，常山酮残留的检测方法中的仪器方法主要为高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法，其检测能力虽然较强，但检测方法和样品的前处理繁琐、费时、费力、影响因素众多。基于各类生物性抗体的免疫分析技术需要制备结合抗原和有特异性识别作用的抗体，制备过程较为复杂，同时分析过程中的稳定性较差，精密度较低。 

    固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是近年来迅速发展起来的专门用于样品纯化和浓缩的一项技术，被广泛应用于多种复杂样品的前处理过程中。与液液萃取相比，SPE可以更有效地将分析物与干扰物分离，减少样品前处理过程，使操作更加简便、高效、省时、省力。SPE处理的效果很大程度上依赖于其填料的种类，已有的填料包括活性炭、硅胶和氧化铝等，这些传统填料中吸附剂与目标分子之间主要依靠一些非特异性的分子间作用力而进行相关物质的吸附。分子印迹技术作为一种能够获得在空间和结合位点上与某种分子完全匹配的聚合物制备技术，具有构效的预定性、识别的特异性和广泛的实用性。基于分子印迹聚合物的固相萃取柱既具有对靶分子的特异性识别作用，又具有较好的稳定性，能够耐极端环境，制备简便，成本廉价。将分子印迹聚合物用于待测物质的选择性吸附和富集较其他方法具有更为明显的优势，已经展现出诱人的开发和应用前景。

本发明采用氧化还原引发剂低温引发制备常山酮的分子印迹聚合物微球，所制备的微球经漂洗、过筛、干燥和洗脱等一系列处理后，再通过紫外分光光度法对其进行评价分析即可得到高效识别性能的聚合物材料。

发明内容

本发明的目的在于克服现有固相萃取方法的不足，提出一种常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法及其在动物性食品中常山酮残留分析中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其步骤如下：

1）先将聚乙烯醇400加入蒸馏水中，加热至95℃使其溶解，形成浓度为3%-8%聚乙烯醇400溶液（优选为4%-6%），冷却至室温，然后转至三口烧瓶中；

2）将模板分子溶解于致孔剂中，加入功能单体，得到混合溶液；所述的模板分子为常山酮，致孔剂为乙腈，功能单体为甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一种或两种的组合；所述的模板分子和功能单体的摩尔比为1:3-6，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为2.5mmol/L-5mmol/L； 

3）将步骤2）的混合溶液用超声清洗仪超声5min，混合均匀，放入4℃冰箱孵育24h，得到预聚合体系；

4）将步骤3）的预聚合体系置于冰水浴中，加入交联剂和引发剂，然后用超声清洗仪超声5min，通入氮气5min，并在氮气气氛或真空状态下密封；所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，作为优选该交联剂是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，加入量为功能单体摩尔量的5倍，所述的引发剂是等摩尔比的过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺，加入量为功能单体摩尔量的0.2倍； 

5）将步骤4）的反应体系在搅拌和氮气保护下慢慢滴加到步骤1）的三口烧瓶中引发聚合，引发温度为10℃-30℃，聚合时间为6h-36h（优选的引发温度为18℃-25℃，聚合时间为12h-24h）使其形成乳白色的微悬浮乳液，即为印迹聚合物；

6）将步骤5）中的印迹聚合物在丙酮中用湿筛法过分级筛，除去极少数粒径较大和较小的微球，选取直径为50μm-70μm的颗粒，用定量滤纸包好，用体积比为7:3的甲醇盐酸混合溶剂索氏萃取，期间定时对提取液进行紫外扫描，直到无模板分子特征吸收时停止萃取；然后将萃取后的聚合物微球60℃烘干至恒重，得到对常山酮具有识别能力的分子印迹聚合物；

7）称取步骤6）所制备的分子印迹聚合物100mg-200mg，用湿法装填固相萃取柱，依次用丙酮和甲醇润洗，而后装锡箔袋中备用。

有益效果

本发明所提供的分子印迹固相萃取柱可用于动物可食性组织中常山酮的选择性吸附和富集，较适合基层检验单位或现场处理样品时使用。与普通的固相萃取柱相比，分子印迹固相萃取柱具有制备过程简单易行、特异性和重复性好、分离效率和回收率高、吸附容量大、生产成本低、稳定性好、精密度高等特点。

具体实施方式

以下实施例可使本专业技术人员全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

（一）．常山酮分子印迹聚合物的制备

称取6g聚乙烯醇400加入150mL双蒸水中，于90℃-95℃热水中溶解，冷却至室温，然后转入至250mL三口烧瓶中。准确称取模板分子（常山酮）0.5mmol溶解于150mL乙腈中，再加入功能单体甲基丙烯酸2mmol，使其充分溶解后超声处理5min，然后置于4℃冰箱24h使其生成稳定的复合物即完成预聚合。随后加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯10 mmol，引发剂过氧化苯甲酰0.4mmol，N，N-二甲基苯胺0.4mmol，超声处理5min（除去氧气）后慢慢滴到400rpm转速搅拌下且加热温度为20℃的上述三口瓶，引发聚合18h后形成乳白色的微悬浮乳液。所得微悬浮乳液在丙酮中用湿筛法过分级筛，除去极少数粒径较大和较小的微球，选择粒径为50μm-70μm的颗粒，用定量滤纸包好，用体积比为7:3的甲醇盐酸混合溶剂索氏萃取，期间定时对提取液进行紫外扫描，直到无模板分子特征吸收时停止萃取，萃取时间为48h。随后60℃烘干至恒重，即得到对常山酮具有识别能力的分子印迹聚合物。非模板分子印迹聚合物的制备，即不加模板分子，不进行预聚合，其他操作步骤同上。

（二）．将模板分子的乙腈溶液作为吸附液，在25℃下，准确称取10份50mg的模板分子印迹聚合物，测定它们对不同浓度模板分子的吸附量，以吸附量对模板分子浓度作图，绘制等温吸附曲线。为了比较模板分子印迹聚合物的吸附性能，同时测定非模板分子印迹聚合物的等温吸附曲线，将获得的数据用于式（1）的Scatchard分析。由Scatchard曲线的斜率和截距可求得分子印迹聚合物的Q_max、K_D。结果表明模板分子印迹聚合物存在两类吸附位点，一类是具有高结合能和高选择性的结合位点，另一类是具有低结合能和低选择性的结合位点（其K_D1=123.2×10^-2  μmol/L，Q_max1=7653.8μmol/g；K_D2=2.4×10^-2 μmol/L，Q_max2=336.4μmol/g）。而非模板分子印迹聚合物仅有低结合能和低选择性的结合位点（K_D=2.2×10^-3 μmol/L，Q_max=187.6μmol/g）；

                                                                                 

                   （1）

    式（1）中K_D：结合位点的平衡离解常数，C：模板分子的平衡浓度，Q_max：最大表观结合位点数。

（三）．分子印迹固相萃取柱的制备

分别称取100mg的模板分子印迹聚合物或非模板分子印迹聚合物装入3mL的固相萃取柱空柱管中，装柱匀浆液为6mL体积比为2:1的甲醇异丙醇混合液。将分子印迹聚合物放入匀浆液中超声5min制成混悬液。在装柱之前，首先把下层的筛板放入，然后用3mL-5mL甲醇对空柱管润洗，将其放到固相萃取真空装置上，封堵空余的接口，打开真空泵，徐徐加入匀浆好的印迹聚合物混悬液，边加边轻轻敲打柱体，待匀浆液快抽干前放入上层的筛板并压紧。依次用10mL丙酮和10mL甲醇冲洗柱子，最后对其标记，放入锡箔袋中密封备用。

（四）．分子印迹固相萃取柱在实际样品检测中回收率的测定

1）．鸡肉和肝脏中常山酮的提取

    称取5g空白组织，匀浆，添加常山酮标准品使其在组织中的浓度达到农业部235公告规定的最大残留限量的0.5倍、1倍和2倍，加入2mL 25mg/mL的胰蛋白酶水溶液，用10%碳酸钠水溶液调节pH至8，涡旋，用30mL乙酸乙酯溶液分3次提取（第三次再加1mL 10%碳酸钠水溶液），离心，合并上清液。用0.125mol/L pH4.9的醋酸铵溶液45mL进行液液萃取，收集水层，加入10mL正己烷振荡混匀，而后去除正己烷相以及溶入其中的乙酸乙酯。

2）．样品的净化

分子印迹固相萃取柱首先用10mL甲醇和10mL甲醇水依次润洗，0.125mol/L pH4.9的醋酸铵溶液5mL进行平衡。加入浓缩后的样品提取液的水相5mL，经10％甲醇水5mL淋洗后，用甲醇乙酸混合液（9:1，V/V）8mL洗脱。洗脱液过0.22μm的有机膜后35℃减压蒸干，残渣用1mL的流动相定容，供高效液相色谱仪测定。

3）．高效液相色谱法测定回收率

标准溶液的配制：分别配成浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和5μg/mL的标准工作液。每个浓度点做5个重复，共重复5天，做校正曲线。  

色谱条件：色谱柱Angilent Zarbax SB C18，250mm×4.6mm（i.d.），流动相乙腈-0.125mol/L乙酸铵（1:5，V/V），检测波长243nm，进样量20μL，柱温为室温，流速1mL/min。经测定，其在不同基质中的回收率见表1（每个样品平行测定3次）。

表1 分子印迹固相萃取柱在不同基质中的回收率

基质	加标浓度（μg/kg）	回收率（％）
			鸡肉	50	84.1±3.4
	100	85.6±6.4
				150	82.6±7.2
鸡肝	65	81.7±6.3
				130	80.9±8.6
	195	80.1±9.7

实施例2

（一）．常山酮分子印迹聚合物的制备

制备的基本过程同实施例1，所用聚乙烯醇400浓度为6%，所用致孔剂用量为200mL，功能单体为丙烯酰胺3mmol，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯15mmol，引发剂过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各0.6mmol，引发聚合温度25℃，聚合时间为12h，索氏萃取洗脱的时间为15h。

（二）．常山酮分子印迹聚合物的表征

表征方法同实施例1，结果显示模板分子印迹聚合物存在两类吸附位点，一类是高选择性的结合位点，另一类是低选择性的结合位点（其K_D1=2.6×10^-2 μmol/L，Q_max1=135.4μmol/g；K_D2=0.3×10^-2 μmol/L，Q_max2=83.2μmol/g）。而非模板分子印迹聚合物仅有低结合能和低选择性的结合位点（K_D=5.3×10^-3 μmol/L，Q_max=73.5μmol/g）。

（三）．分子印迹固相萃取柱的制备

称取150mg的模板分子印迹聚合物装入3mL的固相萃取柱空柱管中，根据实施例1中的装柱方法来制备分子印迹固相萃取柱，装好后依次用5mL丙酮和5mL甲醇冲洗。最后对柱子标记，放入锡箔袋中密封待用。

（四）．分子印迹固相萃取柱在实际样品检测中回收率的测定 

采用高效液相色谱法对其回收率进行了测定和计算（每个样品平行测定3次），色谱条件同实施例1（见表2）。

表2分子印迹固相萃取柱在不同基质中的回收率

基质	加标浓度（μg/kg）	回收率（％）
			鸡肉	50	81.2±4.2
	100	83.3±5.6
				150	82.8±6.5
鸡肝	65	78.6±5.1
				130	79.2±6.5
	195	81.3±7.2

实施例3

（一）．常山酮分子印迹聚合物的制备

制备的基本过程同实施例1，所用聚乙烯醇400浓度为5%，所用致孔剂用量为100mL，功能单体4-乙烯基吡啶1.5mmol，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯7.5mmol，引发剂过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各0.3mmol，引发聚合温度18℃，聚合时间为24h，索氏萃取洗脱的时间为12h。

（二）．常山酮分子印迹聚合物的表征

表征方法同实施例1，结果显示模板分子印迹聚合物存在两类吸附位点，一类是具有高结合能和高选择性的结合位点，另一类是具有低结合能和低选择性的结合位点（其K_D1=2.3×10^-2  μmol/L，Q_max1=118.2μmol/g；K_D2=0.4×10^-2 μmol/L，Q_max2=89.2μmol/g）。而非模板分子印迹聚合物仅有低结合能和低选择性的结合位点（K_D=0.3×10^-3 μmol/L，Q_max=47.3μmol/g）。

（三）．分子印迹固相萃取柱的制备

称取200mg的模板分子印迹聚合物装入3mL的固相萃取柱空柱管中，根据实施例1中的装柱方法来制备分子印迹固相萃取柱，装好后依次用8mL丙酮和8mL甲醇冲洗。最后对柱子标记，放入封口袋中密封待用。

（四）．分子印迹固相萃取柱在实际样品检测中回收率的测定，采用高效液相色谱法对其在不同基质中的回收率进行了测定（每个样品平行测定3次），色谱条件同实施例1（见表3）。

表3分子印迹固相萃取柱在不同基质中的回收率

基质	加标浓度（μg/kg）	回收率（％）
			鸡肉	50	84.5±5.4
	100	85.9±6.9
				150	88.1±4.3
鸡肝	65	81.3±6.2
				130	83.4±7.4
	195	86.7±6.9

Claims (1)

1.常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于：其具体操作步骤如下：

1）先将聚乙烯醇400加入蒸馏水中，加热至95℃使其溶解，形成浓度为4%-6%聚乙烯醇400溶液，冷却至室温，然后转至三口烧瓶中；

2）将模板分子溶解于致孔剂中，加入功能单体，得到混合溶液；所述的模板分子为常山酮，致孔剂为乙腈，功能单体为甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一种或两种的组合；所述的模板分子和功能单体的摩尔比为1:3-6，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为2.5mmol/L-5mmol/L；

3）将步骤2）的混合溶液用超声清洗仪超声5min，混合均匀，放入4℃冰箱孵育24h，得到预聚合体系；

4）将步骤3）的预聚合体系置于冰水浴中，加入交联剂和引发剂，然后用超声清洗仪超声5min，通入氮气5min，并在氮气气氛或真空状态下密封；所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，加入量为功能单体摩尔量的5倍，所述的引发剂是等摩尔比的过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺，加入量为功能单体摩尔量的0.2倍；

5）将步骤4）形成的反应体系在搅拌和氮气保护下慢慢滴加到步骤1）的三口烧瓶中引发聚合，引发温度为18℃-25℃，聚合时间为12h-24h，使其形成乳白色的微悬浮乳液，即为印迹聚合物；

6）将步骤5）中的印迹聚合物在丙酮中用湿筛法过分级筛，除去极少数粒径较大和较小的微球，选直径为50μm-70μm的颗粒，用定量滤纸包好，用体积比为7:3的甲醇盐酸混合溶剂索氏萃取，期间定时对提取液进行紫外扫描，直到无模板分子特征吸收停止萃取；然后将所得聚合物微球60℃烘干至恒重，得到对常山酮具有识别能力的分子印迹聚合物；

7）称取步骤6）所制备的分子印迹聚合物100mg-200mg，用湿法装填固相萃取柱，依次用丙酮和甲醇润洗，而后装锡箔袋中，即制备成常山酮分子印迹固相萃取小柱。