CN102580693B - 植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的制备及应用 - Google Patents

Abstract

植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的制备及应用，采用悬浮聚合法，按照模板分子、功能单体和交联剂摩尔比为1:3-6:15-30混合，加入氧化还原引发剂过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺，然后在10℃-30℃下边搅拌边滴加于3%-8%的聚乙烯醇400水溶液中，所得聚合物微球经漂洗、过筛、洗脱和干燥等一系列处理后，湿法填充于玻璃层析柱中，经甲醇和丙酮依次润洗后用于植物中贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素等间苯三酚类物质的选择性吸附和高效富集，所制备的层析柱较已有的层析柱具有特异性强、制备简便、成本低廉、所需仪器和反应条件容易实现等特点。

Description

植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的制备及应用

技术领域

本发明涉及化工分离技术领域，具体是间苯三酚类分子印迹聚合物的制备及利用该聚合物为柱层析填料进行植物中贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素等物质的分离和纯化。

背景技术

间苯三酚类物质广泛存在于植物中，该类物质具有抗抑郁、抗菌、抗肿瘤、抗阿尔茨海默病和促进学习记忆等药理活性，它们的稳定性较差，对光、热和氧气非常敏感，常温下存放几天就可被完全氧化。在贯叶连翘中该类物质主要为贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素，前者在全草中的含量为2%-4.5%，后者的含量仅为0.2%-1.9%。二者的结构非常相似，加贯叶金丝桃素仅比贯叶金丝桃素多一个甲基，且与后者具有类似的药理活性。

由于其化学不稳定性，该类物质对提取条件较为敏感，常用的回流和索氏提取法都很难满足其提取的要求。与传统的热浸法相比，超声波提取法具有提取时间短、提取率高、无需加热，避免高温对所提取成分的破坏以及提取设备便于推广等优点。其他的提取方法，如超临界萃取等方法虽然也取得了良好的效果，但提取的成本较高，难以在实际生产中推广使用。

该类物质的分离方法主要有以下几种方法。第一种方法是采用薄层色谱法进行粗提物的分离，常采用的固定相为薄层层析硅胶GF254，展开剂为不同比例混合溶剂。该方法虽然较为简便，但所得产物的纯度较低。其次是基于硅胶柱的柱层析和制备色谱法，一般采用的流动相为不同比例的混合溶剂，粗提物经过分离和精制后其纯度可达到98%以上。再者是采用加速溶剂萃取和高速逆流色谱法。上述方法均能得到一定纯度的目标化合物，但分离过程复杂，缺乏特异性，有机溶剂用量较大，所需时间和成本较高。

分子印迹技术作为一种能够获得在空间和结合位点上与某种分子完全匹配的聚合物的制备技术，具有构效的预定性、识别的特异性和广泛的实用性。而且由于分子印迹聚合物对目标分子具有高度的选择性识别作用，较生物性抗体具有稳定性和重复性好、耐极端环境能力强、制备过程简便、成本低廉，因此将印迹聚合物用于待测物质的亲和识别和富集较其他方法具有极大的优势，目前已展示出诱人的前景。

参考文献的报道，采用氧化还原引发剂低温引发制备间苯三酚类分子印迹聚合物微球，所制备的微球经漂洗、过筛、洗脱和干燥等一系列处理后，再通过紫外分光光度法对其进行评价分析即可制备出具有高效识别性能的聚合物材料。而后采用湿法进行亲和识别柱的装填和预处理，提取物经浓缩后上样，即可简便快速地分离和纯化出含量和纯度较高的间苯三酚类化合物。

发明内容

本发明的目的在于克服现有分离纯化方法的不足，提出一种间苯三酚类分子印迹聚合物的制备方法，本发明还包含所述的聚合物在植物中间苯三酚类物质分离纯化上的应用。

植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的制备及应用，其步骤如下：

1）先将聚乙烯醇400加入蒸馏水中，加热至95℃使其溶解，形成浓度为3%-8%聚乙烯醇400溶液（优选的为4%-6%），冷却至室温，然后转至三口烧瓶中；

2）将模板分子溶解于致孔剂中，加入功能单体，得到混合溶液；所述的模板分子为常山酮，致孔剂为乙腈，功能单体为甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一种或两种的组合；所述的模板分子和功能单体的摩尔比为1:4-8，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为2.5mmol/L-5mmol/L； 

3）将步骤2）的混合溶液用超声清洗仪超声5min，混合均匀，放入4℃冰箱孵育24h，得到预聚合体系；

4）将步骤3）的预聚合体系置于冰水浴中，加入交联剂和引发剂，用超声清洗仪超声5min，通入氮气5min，而后在氮气气氛或真空状态下密封；所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，作为优选该交联剂是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，加入量为功能单体摩尔量的5倍，所述的引发剂是等摩尔比的过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺，加入量为功能单体摩尔量的0.2倍； 

5）将步骤4）形成的混合溶液在搅拌和氮气保护下慢慢滴加到步骤1）的三口烧瓶中引发聚合，引发温度为10℃-30℃，聚合时间为6h-36h（优选引发温度为18℃-25℃，聚合时间为12h-24h），使其形成乳白色的微悬浮乳液，即为印迹聚合物微球；

6）将步骤5）中的印迹聚合物在丙酮中用湿筛法过分级筛，除去极少数粒径较大和较小的微球，选直径为50μm-70μm的颗粒，用定量滤纸包好，用体积比为7:3的甲醇盐酸混合溶剂索氏萃取，期间定时对提取液进行紫外扫描，直到无模板分子特征吸收时停止萃取；然后将萃取所得物60℃烘干至恒重，即得到对植物中间苯三酚类化合物具有特异性识别能力的分子印迹聚合物；

7）将步骤6）的分子印迹聚合物微球用湿法装填层析柱，依次用丙酮和甲醇润洗，即制备出分子印迹层析柱，备用；

8）称取植物药材粉末，加入5-10倍量的丙酮溶液，超声提取3次，每次30min，合并提取液，浓缩至含生药量0.1g/mL-1g/mL后加蒸馏水至含水量20%-50%。而后用非极性溶剂萃取1-3次，萃取溶剂总体积为生药量的10-15倍。用pH大于等于8.5的40%-60%的乙醇水溶液萃取除杂，取碱醇相，调节pH至0-4，用生药量6-8倍的非极性溶剂萃取，室温减压蒸干后即得间苯三酚类的粗提取物。所述的非极性溶剂为石油醚、乙醚、烷烃类（常为正戊烷、正己烷或正庚烷）或环烷烃类（常为环戊烷或环己烷），或它们以任意比例混合后的溶剂；

9）称取粗提取物溶解于丙酮后，将其与印迹聚合物粉末混匀成浆，缓缓上样，控制柱流速为0.5mL/min，用氯仿淋洗除去杂质，随后用体积比为7:3的甲醇乙酸混合溶液洗脱保留在柱上的间苯三酚类物质，经18℃-25℃浓缩干燥后即得高纯度的该类化合物。柱层析纯化过程中点GF254硅胶板监控分离过程，优化工艺参数，所用展开剂为体积比4.5:1的正己烷乙酸乙酯混合溶剂。

有益效果

本发明所制备的分子印迹层析柱对贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素等间苯三酚类物质具有动态的“记忆”功能，可以用于植物中该类物质的分离和纯化，与普通的硅胶柱相比，分子印迹层析柱具有特异性和和重复性好，分离效率和回收率高、吸附容量大、生产成本低等特点。较液液萃取法具有溶剂用量和基质干扰少、回收率和处理效率高、操作简便等优势。

具体实施方式

以下实施例可使本专业技术人员全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

（一）、间苯三酚类化合物分子印迹聚合物的制备

称取6g聚乙烯醇400加入150mL双蒸水中，于90℃-95℃热水中溶解，冷却至室温，然后转入至250mL三口烧瓶中。准确取模板分子（贯叶金丝桃素）0.5mmol和功能单体甲基丙烯酸2mmol，溶解于150mL丙酮中，充分溶解后超声处理5min，然后置于4℃冰箱24h使其生成稳定的复合物即完成预聚合；随后加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯10mmol，引发剂过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各0.4mmol，超声处理5min（除去氧气）后慢慢滴到400rpm转速搅拌下的加热温度为20℃的上述三口烧瓶中，引发聚合18h后形成乳白色的微悬浮乳液，即印迹聚合物微球；所得印迹聚合物颗粒在丙酮中用湿筛法过分级筛，除去极少数粒径较大和较小的微球，选择粒径为50μm-70μm的颗粒，用定量滤纸包好，用体积比为7:3的甲醇盐酸混合溶剂索氏萃取，期间定时对提取液进行紫外扫描，直到无模板分子特征吸收时停止萃取，萃取时间为48h；随后将萃取所得物60℃烘干至恒重，得到对植物中间苯三酚类化合物具有特异性识别能力的分子印迹聚合物。非模板分子印迹聚合物的制备，即不加模板分子，不进行预聚合，其余操作同上述步骤。

（二）、间苯三酚类化合物分子印迹聚合物的表征

将模板分子的丙酮溶液作为吸附液，准确称取10份50mg的模板分子印迹聚合物，于25℃下测定它们对不同浓度的模板分子的吸附量，以吸附量对模板分子浓度作图，绘制等温吸附曲线。为了表征模板分子印迹聚合物的吸附性能，同时测定非模板分子印迹聚合物的等温吸附曲线，将获得的数据用于式（1）的Scatchard分析。由Scatchard曲线的斜率和截距可求得分子印迹聚合物的Q_max和K_D。表征结果表明模板分子印迹聚合物存在两类吸附位点，一类是具有高结合能和高选择性的结合位点，另一类是具有低结合能和低选择性的结合位点（其K_D1=1.5μmol/L，Q_max1=8765.3μmol/g；K_D2=3.5×10^-2 μmol/L，Q_max2=503.7μmol/g）。而非模板分子印迹聚合物仅有低结合能和低选择性的结合位点（K_D=2.3×10^-3 μmol/L，Q_max=251.6μmol/g）；                                          

                                                                        

                          （1）

    式（1）中K_D：结合位点的平衡离解常数，C：模板分子的平衡浓度，Q_max：最大表观结合位点数。

（三）、分子印迹层析柱的制备

称取500mg的模板分子印迹聚合物装入空柱管中，装柱匀浆液为5mL体积比为2:1的甲醇异丙醇混合液，将印迹聚合物放入匀浆液中超声5min制成混悬液。在装柱之前，首先把下层的筛板放入，然后用3mL-5mL甲醇对空柱管润洗，徐徐加入匀浆好的印迹聚合物混悬液，而后放入上层的筛板并压紧。依次用10mL甲醇和10mL丙酮冲洗，待用。

（四）、柱层析分离纯化中药粗提物中的间苯三酚类化合物

称取2g粗提物，用1mL甲醇润湿后上样，控制流速0.5mL/min，用10mL氯仿淋洗，15mL体积比为7:3的甲醇乙酸混合溶液洗脱，洗脱液低温减压蒸干后得间苯三酚类化合物共计102.3μg，其中贯叶金丝桃素65.3μg，加贯叶金丝桃素26.2μg，其余为间苯三酚类其他化合物。

本发明的效果为，该印迹层析柱对间苯三酚类化合物具有专一性选择性，其经50mL体积比为9:1的甲醇乙酸混合液和50mL丙酮依次再生后，可连续使用多次。

实施例2

（一）、间苯三酚类化合物分子印迹聚合物的制备

制备的基本过程同实施例1，所用的聚乙烯醇400浓度为6%，所用致孔剂用量为200mL，功能单体为丙烯酰胺3mmol，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯15mmol，引发剂过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各0.6mmol，引发聚合温度25℃，聚合时间为12h，聚合物索氏萃取洗脱时间为18h。

（二）、间苯三酚类化合物分子印迹聚合物的表征

表征方法同实施例1，结果显示模板分子印迹聚合物存在两类吸附位点，一类是高选择性的结合位点，另一类是低选择性的结合位点（其K_D1=4.2×10^-2 μmol/L，Q_max1=158.2μmol/g；K_D2=1.3×10^-2 μmol/L，Q_max2=83.9μmol/g）。而非模板分子印迹聚合物仅有低结合能和低选择性的结合位点（K_D=3.6×10^-3 μmol/L，Q_max=77.5μmol/g）。

（三）、分子印迹层析柱的制备

制备的基本过程同实施例1，所用的聚合物的量为750mg，润洗溶剂为15mL甲醇和15mL丙酮。

（四）、柱层析分离纯化中药粗提物中的间苯三酚类化合物

基本过程同实施例1，所用的粗提物的量为3.5g，氯仿15mL，洗脱溶剂18mL，洗脱液经低温减压干燥后得间苯三酚类化合物共计156.1μg，其中贯叶金丝桃素93.8μg，加贯叶金丝桃素33.6μg，其余为间苯三酚类其他化合物。

本发明的效果为，该印迹层析柱对间苯三酚类化合物具有专一性选择性，其经50mL体积比为9:1的甲醇乙酸混合液和50mL丙酮依次再生后，可连续使用多次。

实施例3

（一）、间苯三酚类化合物分子印迹聚合物的制备

制备的基本过程同实施例1，所用的聚乙烯醇400浓度为5%，所用致孔剂用量为100mL，功能单体为甲基丙烯酸酯4mmol，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯20mmol，引发剂过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各0.8mmol，引发聚合温度18℃，聚合时间为24h，聚合物索氏萃取洗脱时间为12h。

（二）、间苯三酚类化合物分子印迹聚合物的表征

表征方法同实施例1，结果显示模板分子印迹聚合物存在两类吸附位点，一类是高选择性的结合位点，另一类是低选择性的结合位点（其K_D1=3.7×10^-2 μmol/L，Q_max1=142.3μmol/g；K_D2=0.8×10^-2 μmol/L，Q_max2=71.4μmol/g）。而非模板分子印迹聚合物仅有低结合能和低选择性的结合位点（K_D=2.7×10^-3 μmol/L，Q_max=63.2μmol/g）。

（三）、分子印迹层析柱的制备

制备的基本过程同实施例1，所用的聚合物的量为1000mg，润洗溶剂为20mL甲醇和120mL丙酮。

（四）、柱层析分离纯化中药粗提物中的间苯三酚类化合物。基本过程同实施例1，所用粗提物的量为7g，氯仿17mL，洗脱溶剂20mL，洗脱液经低温减压干燥后得到间苯三酚类化合物共计232.4μg，其中贯叶金丝桃素153.5μg，加贯叶金丝桃素67.9μg，其余为间苯三酚类其他化合物。

本发明的效果为，该印迹层析柱对间苯三酚类化合物具有专一性选择性，其经50mL体积比为9:1的甲醇乙酸混合液和50mL丙酮依次再生后，可连续使用多次。

Claims (4)

1.植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：其具体操作步骤如下：

1）先将聚乙烯醇400加入蒸馏水中，加热至95℃使其溶解，形成浓度为3%-8%聚乙烯醇400溶液，冷却至室温，然后转至三口烧瓶中；

2）将模板分子溶解于致孔剂中，加入功能单体，得到混合溶液；所述的模板分子为贯叶金丝桃素，致孔剂为丙酮，功能单体为甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一种或两种的组合；所述的模板分子和功能单体的摩尔比为1:4-8，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为2.5mmol/L-5mmol/L；

3）将步骤2）的混合溶液用超声清洗仪超声5min，混合均匀，放入4℃冰箱孵育24h，得到预聚合体系；

4）将步骤3）的预聚合体系置于冰水浴中，加入交联剂和引发剂，用超声清洗仪超声5min，通入氮气5min，而后在氮气气氛或真空状态下密封；所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，加入量为功能单体摩尔量的5倍，所述的引发剂是等摩尔比的过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺，加入量为功能单体摩尔量的0.2倍； 

5）将步骤4）形成的混合溶液在搅拌和氮气保护下慢慢滴加到步骤1）的三口烧瓶中引发聚合，引发温度为10℃-30℃，聚合时间为6h-36h，使其形成乳白色的微悬浮乳液，即为印迹聚合物微球；

6）将步骤5）中的印迹聚合物在丙酮中用湿筛法过分级筛，除去极少数粒径较大和较小的微球，选直径为50μm-70μm的颗粒，用定量滤纸包好，用体积比为7:3的甲醇盐酸混合溶剂索氏萃取，期间定时对提取液进行紫外扫描，直到无模板分子特征吸收时停止萃取；然后将萃取所得物60℃烘干至恒重，即得到对植物中间苯三酚类化合物具有特异性识别能力的植物中间苯三酚类分子印迹聚合物。

2.权利要求1所述的植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述的聚乙烯醇400溶液的浓度为4%-6%。

3.权利要求1所述的植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述的引发温度为18℃-25℃，聚合时间为12h-24h。

4.权利要求1所述的植物中间苯三酚类分子印迹聚合物的应用，其特征在于：用于植物中贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素间苯三酚类物质的分离和纯化。