CN108072719A - 一种富集分离糖肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学等领域。本发明提供一种富集分离糖肽的方法,该方法是将响应性聚合物糖肽富集与蛋白酶解物接触,采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽,并对样品进行质谱分析,所述响应性聚合物响应性聚合物糖肽富集材料是利用表面引发‑原子转移自由基聚合反应机制,将异丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料表面经过共聚所得,所述基底材料的粒径是0.2‑50μm,孔径为
Description
技术领域
本发明涉及材料分析化学和有机化学领域,尤其涉及一种富集分离糖肽的方法。
背景技术
可逆的蛋白质糖基化在细胞生命活动中具有重要的调控作用,因此在分子水平研究蛋白质糖基化对揭示其在生命过程的调节机制意义重大。以质谱为基础的蛋白组学方法是鉴定蛋白糖基化的常规方法。但是在质谱分析前,需要对低丰度的糖肽/糖蛋白进行选择性的富集,以提高糖肽在质谱中信号强度和鉴定数目。已有的糖肽富集方法主要有凝集素法、肼化学法、硼酸法以及亲水作用色谱法等。但是这些方法都存在一定的局限性:凝集素亲和作用色谱存在糖基化覆盖率低的问题[Kubota,et al.Anal.Chem.2008];肼化学对糖肽的选择性高,但是在洗脱过程中破坏糖链[Zhang,H.;et al.Nat.Biotechnol.2003.];硼酸化学法和亲水作用色谱法在抓取糖肽时存在一定的非特异性吸附,选择性有待提高。因此,为了实现复杂生物样品中大规模富集糖肽的目的,亟需一种简单高效,在保证糖肽覆盖率的同时又能有效排除非糖肽干扰的新型富集方法。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供一种具有高选择性、高吸附量、操作简单和重复性好的富集分离糖肽的方法,能对低化学计量的糖肽进行选择性富集和分离。
本发明的技术方案如下:
一种富集分离糖肽的方法,该方法是将响应性聚合物糖肽富集材料与蛋白酶解物接触,采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽,并对样品进行质谱分析,所述响应性聚合物糖肽富集材料为:
其中x=0.1~0.9(x和1-x用于代表其下方对应单体数量之间的相互关系,/代表单体间顺序连接聚合);n=102~106;R为氨基酸、单糖、二糖、二肽、氨基酸数为2~4的寡肽和两性离子化合物。所述响应性聚合物糖肽富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制,将异丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料(Matrix)表面经过共聚所得;所述基底材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合;所述基底材料的粒径是0.2-50μm,孔径为
上述方案中,采用柱固相萃取模式(SPE),具体步骤如下:
1)在SPE模式下,首先将响应性聚合物材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者SPE小柱上,采用洗脱液冲洗材料,之后用上样液平衡材料,然后将溶解在上样液中的样品加载到材料上,之后采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽,最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽;在dSPE下,将富集材料放在离心管中,采用洗脱液冲洗材料,然后用上样液平衡材料,之后把材料与溶解在上样液中的样品混合,孵化时间10-120分钟,离心弃上清液,沉淀部分用冲洗液冲洗需要振荡3-10分钟,离心取上清液,浓缩即为非糖肽,沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽需要震荡5-30分钟,浓缩即为糖肽。
2)上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液,有机溶剂的比例为70-85%,pH在1-5范围内,缓冲盐的浓度为0-50mM,酸水溶液中酸的浓度为0.1%-5%
淋洗液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液,有机溶液的比例为55-80%,pH=1-5,缓冲盐的浓度为0-50mM,酸水溶液中酸的浓度为0.1%-5%。
洗脱液组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液,有机溶剂比例为0-50%,pH值在0-3或10-14范围内,缓冲盐的浓度为0-500mM。
3)采用5-10倍材料体积的洗脱液冲洗萃取柱;
4)采用5-100倍材料体积的上样液平衡萃取柱;
5)采用5-20倍材料体积的上样液溶解的蛋白酶解液上样;
6)采用5-100倍材料体积的淋洗液洗脱非糖肽;
3)采用5-50倍材料体积的洗脱得糖肽,上述整个过程在22℃进行。
上述方案中,采用分散固相萃取模式(dSPE),具体步骤如下:
1)先采用冲洗液冲洗材料,然后用上样液平衡响应性聚合物材料,将材料和蛋白酶解液混合,孵化1-120分钟,离心,弃上清液,收集沉淀;
2)采用pH=1-5的淋洗液对沉淀振荡清洗3-10分钟,离心,上清液浓缩即为非糖肽,收集沉淀;
3)将清洗后的沉淀采用pH 0-3或10-14的洗脱液振荡洗涤5-30分钟,有机溶液与沉淀的体积比是5:1-100:1,过滤或者分散固相萃取分离,离心,收集上清液,浓缩,得到糖肽,上述整个过程在22℃进行。
上述方案中,上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液,有机溶剂的比例为70-85%,pH在1-5范围内,缓冲盐的浓度为0-50mM,酸水溶液中酸的浓度为0.1%-5%。
淋洗液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液,有机溶液的比例为55-80%,pH=1-5,缓冲盐的浓度为0-50mM,酸水溶液中酸的浓度为0.1%-5%。
洗脱液组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液,有机溶剂比例为0-50%,pH值在0-3或10-14范围内,缓冲盐的浓度为0-500mM。
本发明具有如下有益效果:
1.本发明制备的响应性聚合物糖肽富集材料在分离富集糖肽时表现出了高选择性和高通量等特点,可以实现非糖肽和糖肽的有效分离;
2.本发明制备的响应性聚合物糖肽富集材料既可以方便的装填成不同长度,不同内径的柱子,又可以直接添加于离心管,操作简单,易于重复,特别适合微量生物样品中糖肽的分离富集;
3.本发明富集得到的糖肽可直接用于电喷雾-质谱分析(ESI-MS)或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD–TOF MS),提高了质谱的检测限和灵敏度。
该方法通过对富集过程pH,温度,有机相浓度等条件的控制,实现了复杂混合物(高非糖肽掺入比)中糖肽高选择性、高重复性和高通量富集,显著提高了糖蛋白中糖基化位点的鉴定数目。
附图说明
图1为响应性聚合物表面对多种糖肽选择性吸附的QCM-D曲线。
图2为不同pH条件下聚合物表面对甘露糖、N-乙酰基葡萄糖和唾液酸三种单糖的吸附引起的△F变化示意图。
图3为不同乙腈梯度条件下聚合物表面对甘露糖、N-乙酰基葡萄糖和唾液酸三种单糖的吸附引起的△F变化示意图。
图4为采用SPE模式经聚合物修饰硅球材料富集后,牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽质谱信号示意图。
图5为采用SPE模式经聚合物修饰硅球材料富集后,牛胎球蛋白酶解产物中的糖肽质谱信号示意图。
图6为采用SPE模式经硅球材料富集后,牛胎球蛋白酶解产物中糖肽质谱信号示意图。
图7为采用离心模式,经聚合物修饰基底材料富集后牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽质谱信号示意图。
图8为采用离心模式,经聚合物修饰基底材料富集后牛胎球蛋白酶解产物中的糖肽质谱信号示意图。
具体实施方式
为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明,这些实施例仅用于说明本发明,而本发明不仅限于以下实施例。
实施例中所用原料及设备:
HPLC柱色谱填料硅胶(氨基修饰)由上海月旭公司购得。溴化亚铜(CuBr,99.999%),溴代异丁酰溴,有机碱,联吡啶类配体,异丙基丙烯酰胺,硫脲单体和几种测试用糖都购自Sigma-Aldrich公司。所用水为去离子水,其他试剂如甲醇,乙腈等均使用市售色谱级。异丙基丙烯酰胺在使用前用正己烷重结晶三次,放置在真空干燥器中备用。石英微天平(QCM)吸附数据由Q-Sense E4system检测获得。质谱分析结果由MALD-TOF MS获得。
本发明以下实施例所使用的响应性聚合物糖肽富集材料的结构式为:
制备方法:冰盐浴环境中,在圆底烧瓶中加入10g经过氨基表面修饰的硅球材料与30~100mL干燥甲苯,同时加入2~10mL干燥的三乙胺。充分搅拌下缓慢滴加3mL溴代异丁酰溴,约30~90min滴加完成。滴加完成后撤去冰盐浴,继续搅拌反应8~48小时。抽滤得到大量白色固体粉末,分多次用氯仿洗涤;真空干燥后得到溴代修饰的硅胶产品。
在三口烧瓶中依次加入0.813g(7.2mmol)异丙基丙烯酰胺,0.45g(1.8mmol)硫脲功能单体(物质摩尔比为4:1),1.5g溴化处理后的基底材料,同时加入50mL H2O和50mL DMF(N,N′-二甲基甲酰胺)作溶剂,超声10~40min;在搅拌下通入氮气,待单体充分溶解之后,在氮气保护下加入催化剂溴化铜0.032g,随后反应体系抽真空-充氮气,除去反应体系中残余的氧气;将0.3g 2,2-联吡啶加入到之前充分除去气体的封闭反应器中,将烧瓶的温度控制在60℃静置反应1~15小时;反应结束后用DMF和去离子水依次洗涤聚合物接枝的基底材料,30℃真空干燥后得到响应性聚合物糖肽富集材料,置于干燥器中备用。使用相同的方法可以制备不同颗粒尺寸(包括硅胶粒径,孔径)的聚合物接枝的硅胶样品,用作糖肽富集和分离柱的填充材料。
实施例1
图1为响应性聚合物表面对多种糖选择性吸附的QCM-D曲线(从上往下依次对应葡萄糖胺、甘露糖、木糖、唾液酸、麦芽糖、唾液酸酰基乳糖和麦芽六糖)。
首先将聚合物接枝到QCM-D芯片表面,对几种糖进行吸附实验。条件为控温20℃,载液为水,流速为0.100mL/min。图1表明该聚合物表面对不同类型的糖的吸附量有很大的差异,可以根据吸附量的差异区分糖类化合物,该聚合物材料对几种糖的吸附量随时间变化依次增加,规律为单糖<二糖<多糖,碱性糖<中性糖<酸性糖,该聚合物有望被开发用于单糖的选择性富集和分离。
实施例2
图2为不同pH条件下聚合物表面对甘露糖、N-乙酰基葡萄糖和唾液酸三种单糖的吸附引起的△F变化示意图。
将聚合物接枝到QCM-D芯片表面,在不同pH条件下对甘露糖、N-乙酰基葡萄糖和唾液酸三种单糖进行吸附实验。条件为控温20℃,载液为水加入不同比例的盐酸及氢氧化钠,流速为0.100mL/min。图2表明,在该聚合物表面,唾液酸的吸附明显对pH值有响应,而其他两种中性单糖受此影响较小,说明该聚合物材料表面和酸性糖之间具有静电作用,在强酸和强碱性条件下,酸性糖容易被洗脱下来,而中性糖和该聚合物表面没有静电作用,因此不受pH影响,该聚合物材料有望被开发用于单糖的选择性富集和分离。
实施例3
图3为不同乙腈梯度条件下聚合物表面对甘露糖、N-乙酰基葡萄糖和唾液酸三种单糖的吸附引起的△F变化示意图。
首先将聚合物接枝到QCM-D芯片表面,在不同乙腈梯度条件下对甘露糖、N-乙酰基葡萄糖和唾液酸三种单糖进行吸附实验。条件为控温20℃,载液为水和乙腈按照不同比例混合,流速为0.100mL/min。图3表明,在该聚合物表面,唾液酸的吸附受载液中乙腈梯度影响较大,唾液酸的吸附量随着乙腈比例的降低而降低,说明材料具有亲水性,其他两种中性单糖受此影响较小,响应性聚合物材料有望被开发用于糖肽的选择性富集和分离。
富集应用实例
实施例4
本发明可在固相萃取(SPE)模式或者离心模式下进行,具有操作简单,通量高和重复性好等优点。
蛋白酶解溶液的制备:1.0mg的牛胎球蛋白溶解在1mL碳酸氢铵溶液中(50mM,pH8.0),按照胰蛋白酶与胎球蛋白的质量比1:40(w/w)的比例加入胰蛋白酶进行酶解,37℃反应12小时,得蛋白酶解液进行下述实验操作。
将1mg响应性聚合物糖肽富集材料装入凝胶吸头中,首先用40μL的体积浓度40%乙腈/1%甲酸的水溶液(pH=2.3)冲洗材料两次,然后用40μL的体积浓度70%乙腈/0.1%甲酸的水溶液(pH=2.78)平衡材料四次;将去盐重溶于20μL上样液的蛋白酶解液5μL(5μg)上样后,用40μL含有70%乙腈/0.1%甲酸的水溶液(pH 2.78)溶液洗脱两次;最后用20μL40%乙腈/1%甲酸的水溶液(pH 2.3)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
由图4和图5可见,牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽和糖肽可以依次从响应性聚合物糖肽富集材料上洗脱下来。相比于二氧化钛富集得到的糖肽(图6),采用本发明的响应性聚合物糖肽富集材料得到的糖肽选择性更好,糖肽的个数更多,糖肽和非糖肽能得到更好的分离,说明聚合物修饰的基底材料响应性聚合物糖肽富集材料能特异性地富集和纯化糖肽。
实施例5
调整富集的操作模式为dSPE,将1mg响应性聚合物糖肽富集材料装入离心管中,首先用40μL的体积浓度40%乙腈/1%甲酸的水溶液(pH=2.3)冲洗材料两次,然后用40μL的体积浓度70%乙腈/0.1%甲酸的水溶液(pH=2.78)平衡材料四次;5μL(5μg)牛胎球蛋白酶解液溶于20μL的70%乙腈/0.1%甲酸的水溶液(pH=2.78)并与材料混合,孵化30min,离心后收集上清液,沉淀再用70%乙腈/0.1%甲酸的水溶液(pH 2.78)孵化5min,离心后合并上清液。沉淀与20μL含有40%乙腈/1%甲酸的水溶液(pH 2.3)孵化10min,离心后收集上清液,重复此孵化和离心步骤,离心后合并上清液。各上清液直接在MALDI-TOF分析。
由图7至8可见,牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽没有被响应性聚合物糖肽富集材料保留,直接被洗脱出来(图7);糖肽可以被响应性聚合物糖肽富集材料保留,在较低pH值条件下可以洗脱出(图8),说明响应性聚合物糖肽富集材料能特异性的富集糖肽将其与非糖肽分离。
实施例6-9
调整富集材料的重量为2mg、3mg、4mg、5mg,其他条件同实施例4,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在萃取模式操作模式下只需1mg的响应性聚合物糖肽富集材料即可以有效地保留和富集5μg牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例10-12
调整牛胎球蛋白酶解液的上样量为5μg、10μg和20μg,其他条件同实施例4,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在萃取模式操作模式下1mg的响应性聚合物糖肽富集材料最多可以有效地保留和富集10μg的牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例13-15
调整实施例4中第三步洗脱溶液的pH为2.3、2.78和3,其他条件同实施例4,进行选择性富集和质谱分析。结果表明洗脱溶液pH为2.3时能将更多的糖肽从富集材料上洗脱下来,是为最佳pH值条件。
实施例16-19
调整富集材料的重量为2mg、3mg、4mg、5mg,其他条件同实施例5,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在离心操作模式下只需1mg的响应性聚合物糖肽富集材料即可以有效地保留和富集5μg的牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例20-22
调整牛胎球蛋白酶解液的上样量为5μg、10μg、20μg,其他条件同实施例5,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在离心操作模式下1mg的响应性聚合物糖肽富集材料最多可以有效地保留和富集10μg的牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例23-25
调整实施例5中第三步洗脱溶液的pH为2.3、2.78和3,其他条件同实施例5,进行选择性富集和质谱分析。结果表明洗脱溶液pH为2.3时能将更多的糖肽从富集材料上洗脱下来,是为最佳pH值条件。
综上所述,本发明的响应性聚合物糖肽富集材料对于糖肽具有很好的选择性富集性能,和常规的响应性聚合物糖肽富集材料相比,聚合物修饰基底材料富集糖肽具有更高选择性,更高糖肽回收率和更好的重复性。利用聚合物修饰基底材料对于糖肽的高效的特异性吸附能力,可以将其应用于复杂体系中糖肽的选择性分离富集,结合质谱,该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。
Claims (8)
1.一种富集分离糖肽的方法,其特征在于,是将响应性聚合物糖肽富集材料与蛋白酶解物接触,采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽,所述响应性聚合物糖肽富集材料为:
其中x=0.1~0.9;n=102~106;R为氨基酸、单糖、二糖、二肽、氨基酸数为2~4的寡肽或两性离子化合物;Matrix为基底材料。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述响应性聚合物糖肽富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制,将异丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料(Matrix)表面经过共聚所得;所述基底材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合;所述基底材料的粒径是0.2-50μm,孔径为
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:将所述聚合物材料作为富集材料,采用柱固相萃取模式(SPE)和分散固相萃取模式(dSPE)富集和纯化糖肽;
在SPE模式下,首先将响应性聚合物材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者SPE小柱上,采用洗脱液冲洗材料,之后用上样液平衡材料,然后将溶解在上样液中的样品加载到富集材料上,之后采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽,最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽;
在dSPE下,将富集材料置于离心管中,采用洗脱液冲洗材料,然后用上样液平衡材料,之后把材料与溶解在上样液中的样品混合,孵化后,离心弃上清液,所剩沉淀部分用冲洗液冲洗,震荡后,离心取上清液,浓缩即为非糖肽,沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽,震荡后,离心取上清液即得糖肽。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:
上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液,有机溶剂的体积比例为70-85%,pH在1-5范围内,缓冲盐的浓度为0-50mM,酸水溶液中酸的质量浓度为0.1%-5%;
淋洗液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液,有机溶液的体积比例为55-80%,pH=1-5,缓冲盐的浓度为0-50mM,酸水溶液中酸的质量浓度为0.1%-5%;
洗脱液组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液,有机溶剂的体积比例为0-50%,pH值在0-3或10-14范围内,缓冲盐的浓度为0-500mM。
5.按照权利要求3所述方法,其特征在于,所用的蛋白酶解液应旋干去盐,重溶于上样液,样品的上样量与响应性聚合物材料量之间的体积比例为1:20-1:1000,实验操作温度为15-50摄氏度。
6.按照权利要求3和4所述方法,其特征在于,冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3-50倍,平衡材料所用的上样液体积材料体积的3-50倍,上样体积为材料体积的5-200倍,淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的5-100倍,洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5-10倍。
7.按照权利要求3所述方法,其特征在于,采用dSPE方法富集糖肽,振荡转数为100-2500rpm,样品与材料之间的孵化时间10-120分钟,孵化温度为15-50度。
8.按照权利要求3和4所述方法,其特征在于,有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇等中的一种或二种以上,缓冲盐包括但不局限于甲酸铵,乙酸铵,碳酸氢铵等,酸包括但不局限于甲酸、乙酸、三氟乙酸等中的一种或二种以上。
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