CN106000363B - 一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，更具体地涉及一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法。具体步骤如下：（1）将功能单体4‑氰基苯硼酸与叠氮基修饰的硅胶溶于溶剂中，磁力搅拌混合均匀；（2）加入适量催化剂并在80℃温度下，恒温反应10‑70小时。反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用10%EDTA水溶液，水，甲醇等溶剂进行冲洗。洗涤后产物干燥，即得本发明的亲水性的苯硼酸亲和材料。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地涉及一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法。
背景技术
糖蛋白作为一类重要的翻译后修饰蛋白，在信号转导、免疫及肿瘤发生等生物学过程中发挥着重要的作用。因此，糖蛋白和糖肽的发现与鉴定在疾病的诊断和蛋白质组学领域意义重大。目前，用于N 连接糖肽富集的主要方法有凝集素、酰肼、亲水作用色谱、硼酸亲和色谱等。对于具有1,2- 顺式二醇化学结构的糖型，苯硼酸可以与其形成可逆的五元或者六元环的酯，同时苯硼酸具有亲水性，能够与糖肽选择性结合。硼酸材料对糖肽的富集选择性集亲和和亲水作用力为一体，不仅能够避免糖链结构遭到破坏，而且所富集的产物与质谱兼容，对于研究糖蛋白糖基化位点信息及糖型结构归属较为方便。因此，苯硼酸在糖肽的选择性富集领域受到了人们的关注。而由苯硼酸为键合相开发的亲和材料也在糖蛋白或糖肽选择性富集中起到了越来越重要的作用。
点击化学指的是一类转化率高，产率高，操作简便，绿色环保的化学反应，广泛的应用在生物，药物等领域。我们课题组曾经将点击化学(Click Chemistry)用于合成硅胶基质的色谱固定相，相应的文章发表在国际知名期刊上（Journal of Chromatography A2009, 1216: 257-263；Chemical Communications 2007, 2491-2493；ChemicalCommunications 2006, 4512-4514；Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011，399，3359-3365; Talanta, 78 (2009) 916-921; Journal of separation science, 33:9 (2010) 1224-1230; Analytical Method, 2012，4, 1244-1251）。这些方法采用的均是铜催化的点击化学反应，虽然得到较高的反应效率，但是反应过程中引入铜这个重金属，会给色谱分离带来影响，因此有必要加以改进。无铜催化的点击化学以其高转化率，高产率，以及避免铜的引入，引起了研究人员的重视。以亚铁盐催化的叠氮基和氰基生成四唑环的点击化学方法就是一种无铜催化的点击化学反应（Angew. Chem. 2007, 119, 8592 –8596），相比较而言，合成转化率高，且没有铜离子的引入，是一种理想的化学反应。然而这种方法目前没有引入到色谱填料制备中，而且用于苯硼酸亲水硅胶材料的制备也未见报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种亲水性的基于无铜催化的苯硼酸硅胶材料的制备方法，具体步骤如下：
（1）将功能单体4-氰基苯硼酸与叠氮基硅胶溶于溶剂中，磁力搅拌混合均匀；
（2）加入适量催化剂并在80℃温度下，恒温反应10-70小时。反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用10%EDTA水溶液，水，甲醇等溶剂进行冲洗。洗涤后产物干燥，即得本发明的苯硼酸亲水材料。
在本发明的一个实施方案中，步骤1中所述的材料为叠氮基硅胶材料，为实验室自制，制备和表征方法均参照文献（Chem Comun, 2006, 43: 4512）；溶剂为二甲基甲酰胺与甲醇的混合物。
在本发明的另一个实施方案中，所述二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为10: 1～3，优选为9:1。
在本发明的又一个实施方案中，4-氰基苯硼酸、叠氮基硅胶材料与溶剂的重量比为1：1～5：10～100，优选为1：2：60。
在本发明再一个实施方案中，步骤（2）中所述催化剂为醋酸亚铁，4-氰基苯硼酸与催化剂的重量比为10：1，反应温度优选为80℃，反应时间为48小时。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1
（1）将4-氰基苯硼酸（0.5 g）溶解于叠氮基硅胶（1g）的二甲基甲酰胺与甲醇（9:1）混悬溶液30 mL中，并于室温下进行磁力搅拌。
（2）混悬均匀后，加入醋酸亚铁（0.05 g）并在80℃下搅拌48小时。反应完成以后，用砂芯漏斗抽滤，分别用10%EDTA水溶液（500 ml），水（1000 ml），甲醇（100 ml）。洗涤后产物于真空干燥箱中干燥，即得苯硼酸亲和硅胶材料。
实施例2
将实施例1制备的苯硼酸亲水硅胶材料和分散溶液甲醇以一定比例（1:1.5，v:v）混合后超声分散5 min，倒入40 mL匀浆罐中，用填装机于60 MPa将色谱填料装填于不锈钢管中（150 mm×4.6 mm），并使用丙酮作为顶替液，顶替15 min。制备出的色谱柱备用。
实施例3
以极性较强的鸟苷为分离对象，考察实施例2制备的苯硼酸亲水硅胶柱的柱效。高效液相色谱条件为：进样体积2 μL(标准品在50%甲醇水溶液的浓度为1 mg/mL)，流速1.0mL/min，检测系统为紫外检测器，波长设定为280 nm，色谱柱为实施例2所制备的苯硼酸亲水硅胶柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相为95%乙腈水溶液，柱温为30℃。测量峰面积和保留时间，并计算柱效。
另外，本发明还设定了以下对比例，具体如下：
对比例1：溶剂中不添加甲醇，其他同实施例2；
对比例2：溶剂中二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为10:0.5，其他同实施例2；
对比例3：4-氰基苯硼酸、叠氮基硅胶材料与溶剂的重量比为1：1：30，其他同实施例2；
对比例4：4-氰基苯硼酸、叠氮基硅胶材料与溶剂的重量比为1：1：10，其他同实施例2；
对比例5：催化剂为醋酸铁，其他同实施例2；
对比例6：催化剂为硫酸亚铁，其他同实施例2。
结果表明，实施例制备的苯硼酸亲水硅胶柱的色谱行为，具体柱效及相同亲水条件下鸟苷的保留时间详见表1：
表1. 实施例和对比例HPLC条件下色谱行为结果
实施例4
进行糖肽选择性富集实验，采用基质辅助激光解吸（MALDI）质谱以辣根过氧化物酶（HRP）酶解物作为分离对象，进行糖肽选择性富集，富集条件为：称量10 mg苯硼酸亲水硅胶材料（实施例1中所制备的材料），悬浮于80%ACN（乙腈）/ 0.1%甲酸溶液（1 mL）中。配成10mg/mL的悬浮液。将50 μL的悬浮液装入80%ACN（乙腈）/0.1%甲酸溶液（200 μL）中涡旋震荡5min后，6000转离心，弃除上清液（操作2次）。采用糖蛋白酶解物HRP作为对象进行亲水富集：取HRP（1mg/mL）（2 μL）与材料悬浮液混合，再加入80%ACN（乙腈）/1%甲酸溶液（200 μL）进行混合，孵化30 min后，6000转离心，弃除上清液，分别用上样缓冲液80%ACN（乙腈）/0.1%甲酸水溶液（200 μL）清洗，淋洗缓冲液50%ACN（乙腈）/ 1%甲酸溶液（200 μL）洗脱。每次加液体后震荡富集30 min后，6000转离心，取上清液保留，离心浓缩旋干备用。所得的样品冷冻浓缩干燥以后，用70% ACN/0.5%TFA（20 μL）重溶，用MALDI质谱进行分析，采用DHB作为基质。并归纳实施例和对比例从HRP中富集出的糖肽数目，考察材料的糖肽富集选择性。
具体结果如表2显示
表2 实施例和对比例的糖肽选择性富集结果
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (6)
1.一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法，具体步骤如下：
（1）将功能单体4-氰基苯硼酸与叠氮基修饰的硅胶溶于溶剂中，磁力搅拌混合均匀；
（2）加入适量催化剂并在80℃温度下，恒温反应10-70小时；所述催化剂为醋酸亚铁；
反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用10%EDTA水溶液，水，甲醇进行冲洗；洗涤后产物干燥，即得苯硼酸亲水硅胶材料。
2.根据权利要求1所述的一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中溶剂为二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为10:1~3。
3.根据权利要求2所述的一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中溶剂为二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为9:1。
4.根据权利要求1所述的一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中4-氰基苯硼酸、叠氮基修饰的硅胶与溶剂的重量比为1：1～5：10～100。
5.根据权利要求4所述的一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中4-氰基苯硼酸、叠氮基修饰的硅胶与溶剂的重量比为1：2：60。
6.根据权利要求1所述的一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法，其特征在于4-氰基苯硼酸与催化剂的重量比为10：1，反应温度为80℃，反应时间为48小时。
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