CN101274271A - 一种糖键合硅胶固定相及其制备方法 - Google Patents

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郭志谋
张永平
雷爱文
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Abstract

本发明涉及液相色谱固定相，键合相为单糖，二糖，或寡糖(聚合度为3－10)，其结构为：其中，X为－OCH3或－OCH2CH3，Y为－OH或－NH2Ac，n＝1～10。首先在硅胶表面引入叠氮基团，制备叠氮基硅胶中间体；然后通过叠氮基与炔基的1，3－环加成反应，即click chemistry，在水溶液中20～80℃的条件下反应24～72小时，将炔基糖分子键合到叠氮基硅胶表面。本发明提供的色谱分离材料结构新颖，柱效和分离选择性高。该固定相用作液相色谱分离材料能在亲水色谱模式下对强极性化合物有很好的保留和分离的效果，特别适合用于分离和分析强极性化合物。

Description

一种糖键合硅胶固定相及其制备方法
技术领域
本发明涉及色谱固定相，具体的说是一种糖键合硅胶固定相及其制备方法；其是采用click chemistry作为键合反应方法的键合糖固定相。
背景技术
反相高效液相色谱(RP-HPLC)是目前使用最为广泛的高效分离技术。反相色谱最常用的固定相C18，是当前应用最为广泛的高效液相色谱固定相，能在反相色谱模式下分离绝大部分弱极性和中等极性有机化合物。但是，反相液相色谱主要依靠单一的疏水作用力来实现对化合物的分离，因此，其对强极性化合物(如寡糖，糖苷，强极性寡肽等)的保留很弱，甚至不保留。
为了对强极性化合物有较好的保留作用而达到分离的目的，使用极性固定相是一种很好的途径。亲水作用液相色谱模式(HILIC)是近年来发展起来的用于分离强极性化合物的色谱技术，类似于正相色谱，使用极性固定相和极性相对较小的流动相，但与正相色谱不同的是其流动相中含水(水含量一般小于40％)[Alpert，A.J.J.Chromatogr.1990，499，177-196]。亲水作用色谱用于分离强极性化合物(如寡糖，寡肽和极性药物分子等)已有文献报道[Strege，M.A.Anal.Chem.1998，70，2439-2445；Strege，M.A.et al，Anal.Chem.2000，72，4629-4633；Wang，X.D.et al，J.Chromatogr.A，2005，1083，58-62；Tolstikov，V.V.et al，Anal.Biochem.2002，301，298-307；Yoshida，T.Anal.Chem.1997，69，3038-3043；Risley，D.S.et al，Anal.Chem.2000，72，1736-1739；Dallet，P.et al，J.Chromatogr.B 2000，742，447-452；Olsen，B.A.J.Chromatogr.A 2001，913，113-122]。但是，亲水作用色谱的固定相依然是使用正相固定相，主要是直接使用硅胶，氨基，氰基等作为固定相[Guo，Y.et al，J.Chromatogr.A，2005，1074，71-80；Garbis，S.D.et al，Anal.Chem.2001，73，5358-5364]，存在着重现性差和使用寿命短的问题。目前，专门为亲水作用色谱开发的固定相刚刚起步，主要是将含甲酰胺基，羟基的聚合物键合到硅胶上作为亲水固定相，商品化的亲水作用色谱固定相种类较少[Guo，Y.et al，J.Chromatogr.A，2005，1074，71-80]。目前，对各类亲水作用固定相缺乏系统的比较研究，还没有被广泛使用和普遍接受的亲水作用色谱固定相[Guo，Y.et al，J.Chromatogr.A，2005，1074，71-80]。在硅胶表面固载糖分子作为亲水液相色谱分离材料未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种糖键合硅胶固定相及其制备方法，其为一种新型亲水液相色谱分离材料，本发明制得的色谱分离材料结构新颖，柱效和分离选择性高，在亲水色谱模式下对强极性化合物有很好的保留和分离，适合分析和分离强极性化合物。该分离材料制备方法简单可靠，用途广泛。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种糖键合硅胶固定相，其为高效液相色谱固定相，键合相为单糖、二糖、或聚合度为3～10的寡糖，其结构如下：
Figure A20071001080800051
其中，X为-OCH3或-OCH2CH3，Y为-OH或-NH2Ac，n＝1～10。所用糖可以是单一化合物，如葡萄糖，半乳糖，麦芽糖，纤维二糖，麦芽三糖，纤维十糖；也可以是寡糖混合物，如聚合度为2～7的壳寡糖，聚合度为6～10的菊粉寡糖。
所述固定相使用click chemistry作为键合方法，键合修饰有炔基的糖分子，包括如下步骤：
a.硅胶表面引入叠氮基团
在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、叠氮化钠和催化剂，硅烷偶联剂、叠氮化钠与催化剂的摩尔比为1∶1.2-3∶0.01-0.1，于60～130℃条件下反应8～24小时，然后加入经160℃加热6～18小时的微球型硅胶，每克硅胶所需硅烷偶联剂为2-8mmol；在60～130℃条件下继续反应12～24小时，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40～80℃条件下干燥6～12小时，即得(3-丙基)叠氮基硅胶；
步骤a所用硅烷偶联剂有如下结构：
Figure A20071001080800052
其中，X为-OCH3或-OCH2CH3，A为Cl-或Br-。
所用有机溶剂为乙腈、甲苯或N，N-二甲基甲酰胺，每克硅胶所需有机溶剂的量为5-30ml；催化剂为碘化钠或者碘化钾；球形硅胶是粒径和孔径均匀的全多孔硅胶小球，粒径为5～40μm，孔径为60～300A。
b.click chemistry键合糖
将上述制备的(3-丙基)叠氮基硅胶中加入体积比为1/10～10/1的水/甲醇或水/乙醇混合溶剂中，每克(3-丙基)叠氮基硅胶所需混合溶剂量为10-50ml，再加入炔基糖、催化剂，炔基糖的摩尔剂量为硅胶上叠氮基摩尔剂量的2～5倍，催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠，所用摩尔剂量分别为炔基糖摩尔剂量的1～10％和2～40％；在10～80℃条件下反应24～72小时，用砂芯漏斗过滤，依次用乙醇，水，重量浓度2-20％EDTA水溶液，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40～80℃条件下干燥6～12小时，即得键合糖固定相。
所用的炔基糖的摩尔比剂量为硅胶上叠氮的摩尔比剂量的2～5倍。所用炔基糖可以是修饰有炔基的单一糖(如葡萄糖，半乳糖，麦芽糖，纤维二糖，麦芽三糖，纤维十糖等)或修饰有炔基的寡糖混合物(如聚合度为2～7的壳寡糖，聚合度为6～10的菊粉寡糖等)。
本发明具有如下优点：
1.结构新颖。本发明首次提出以糖分子作为亲水作用液相色谱键合固定相。糖是水溶性很好的强极性分子，是一种理想的亲水作用色谱固定相。更重要的是，糖分子具有特异性的空间结构，可以表现出独特的色谱行为和分离能力。
2.应用范围广。本发明提供的键合糖固定相可作为亲水作用色谱分离材料，广泛用于分离中药强极性组分，强极性生物样品等各类强极性化合物。
3.制备过程简单可靠。click chemistry反应，反应条件温和，在水溶液中进行，而且十分容易放大到大量制备(公斤级)。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的硅胶键合葡萄糖分离材料(Click Glucose)用于亲水模式的色谱图；
图2为本发明实施例1制备的硅胶键合葡萄糖分离材料(Click Glucose)用于分离碱基和核苷的色谱图；
图3为本发明实施例2制备的硅胶键合麦芽糖分离材料(Click Maltose)用于分离碱基和核苷的色谱图。
具体实施方式
本发明所述的分离材料可有效地用于高效液相色谱分离各类强极性化合物。下面结合实例和附图，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
所述炔基糖参照文献[H.B.Mereyala and S.R.Gurrala，Carbohy.Resear.，1998，307，351-354；A.K.Pathak，et al，Carbohy.Resear.，2004，339，683-691]方法制备，简要过程如下：
在乙酸酐溶液中加入糖，加热回流2～4小时，冷却至室温，倒入冰水中析出固体，即得乙酰糖；将全乙酰糖溶于二氯甲烷中，然后冰水浴中加入丙炔醇和三氟化硼/乙醚，室温下搅拌2～4小时，加入K2CO3继续搅拌30分钟，过滤除去固体，浓缩干燥滤液得固体产品，用二氯甲烷/正己烷重结晶即得炔化乙酰糖；将炔化乙酰糖溶于甲醇溶液中，缓慢滴加甲胺醇溶液，室温搅拌12～24小时，浓缩干燥溶液得油状固体，过硅胶柱色谱纯化即得炔基糖。
实施例1
在1000ml三口烧瓶中加入500ml无水DMF，45mmol(约10ml)3-氯丙基三乙氧基硅烷，60mmol(约4.0g)叠氮化钠，然后加入3.0mmol碘化钠(约0.5g)作为催化剂，80℃下反应24h，然后加入粒径为5μm的球形硅胶颗粒20g，80℃下再反应24h，然后依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮各洗涤两次，每次200ml，60℃真空干燥12小时即得(3-丙基)叠氮基硅胶。
在250ml烧瓶中加入80ml甲醇和80ml水，然后加入2.9g炔基葡萄糖，3g(3-丙基)叠氮基硅胶，0.075gCuSO4和0.24gNaAsc。在25℃条件下反应24～72小时，用砂芯漏斗过滤，依次用甲醇，水，10％EDTA水溶液，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40℃条件下干燥12小时，即得键合葡萄糖固定相，其结构为：
Figure A20071001080800071
实施例2
与实施例1不同之处在于，采用麦芽糖代替葡萄糖，按实施例1的合成步骤可得键合麦芽糖固定相，其结构为：
Figure A20071001080800072
实施例3
与实施例1不同之处在于，采用壳寡糖代替葡萄糖，按实施例1的合成步骤可得键合可寡糖固定相，结构为其结构为：
Figure A20071001080800073
其中n＝2～7。
实施例4
使用实施例1所制备的键合葡萄糖固定相，用匀浆法填装4.6*150mm不锈钢色谱柱，在亲水色谱模式下分离萘和三种强极性化合物(如图1所示)。
图1所用色谱条件为：流动相A为10mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流速：1ml/min；等度洗脱：15％A；柱温：30℃；检测波长：254nm。图中1为萘，2为尿嘧啶，3为腺苷，4为鸟苷。
实施例5
使用实施例1所制备的键合葡萄糖固定相，用匀浆法填装4.6*150mm不锈钢色谱柱，在亲水色谱模式下分离碱基和核苷类化合物(如图2所示)。
图2所用色谱条件为：流动相A为10mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流速：1ml/min；梯度条件为：0-5min，3％A；5-20min，3％-20％A；柱温：30℃；检测波长：270nm。图中1为胸腺嘧啶，2为尿嘧啶，3为尿苷，4为腺苷，5为腺嘌呤，6为胞嘧啶，7为胞苷，8为鸟苷。
实施例6
使用实施例2所制备的键合麦芽糖固定相，用匀浆法填装4.6*150mm不锈钢色谱柱，在亲水色谱模式下分离碱基和核苷类化合物(如图3所示)。图3所用色谱条件为：流动相A为10mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流速：1ml/min；梯度条件为：0-20min，10％-20％A；柱温：30℃；检测波长：275nm。图中1为胸腺嘧啶，2为尿嘧啶，3为尿苷，4为腺苷，5为腺嘌呤，6为胞嘧啶，7为胞苷，8为鸟苷。

Claims (7)

1. 一种糖键合硅胶固定相，其特征在于：键合相为单糖、二糖或聚合度为3～10的寡糖，其结构如下：
其中，X为-OCH3或-OCH2CH3，Y为-OH或-NH2Ac，n＝1～10。
2. 一种权利要求1所述固定相的制备方法，其特征在于：使用clickchemistry作为键合方法，键合修饰有炔基的糖分子，包括如下步骤：
a.硅胶表面引入叠氮基团
在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、叠氮化钠和催化剂，硅烷偶联剂、叠氮化钠与催化剂的摩尔比为1∶1.2-3∶0.01-0.1，于60～130℃条件下反应8～24小时，然后加入经160℃加热6～18小时的微球型硅胶，每克硅胶所需硅烷偶联剂为2-8mmol；在60～130℃条件下继续反应12～24小时，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40～80℃条件下干燥6～12小时，即得(3-丙基)叠氮基硅胶；
所用硅烷偶联剂有如下结构：
Figure A2007100108080002C2
其中，X为-OCH3或-OCH2CH3，A为Cl-或Br-；
b.click chemistry键合糖固定相
将上述制备的(3-丙基)叠氮基硅胶加入到体积比为1/10～10/1的水/甲醇或水/乙醇混合溶剂中，每克(3-丙基)叠氮基硅胶所需混合溶剂量为10-50ml，再加入炔基糖、催化剂，催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠，所用摩尔剂量分别为炔基糖的摩尔剂量的1～10％和2～40％；在10～80℃条件下反应24～72小时，用砂芯漏斗过滤，依次用乙醇，水，质量浓度2-20％EDTA水溶液，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40～80℃条件下干燥6～12小时，即得键合糖固定相。
3. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤a所用的有机溶剂为乙腈，甲苯或N，N-二甲基甲酰胺；每克硅胶所需有机溶剂的量为5-30ml。
4. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤a所用的催化剂为碘化钠或者碘化钾。
5. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤a所用的球形硅胶是粒径和孔径均匀的全多孔硅胶小球，粒径为5～40μm，孔径为60～300A。
6. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b所用炔基糖可以是修饰了炔基的单一糖分子或修饰了有炔基的寡糖混合物。
7. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b所用的炔基糖的摩尔比剂量为硅胶上叠氮的摩尔比剂量的2～5倍。
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