CN105749887A - 一种液相色谱固定相的制备方法及其糖基键合固定相 - Google Patents

Abstract

本发明涉及液相色谱固定相，为一种液相色谱固定相的制备方法及其糖基键合固定相，本发明是使用无重金属催化的“巯基-烯烃”点击化学反应制备糖基键合硅胶固定相。首先在硅胶表面引入巯基，制备巯基硅胶中间体；然后通过巯基与烯基的加成反应，将烯基糖分子键合到巯基硅胶表面。该方法为无重金属催化反应，因此最终产物中不含重金属残留，完全避免重金属对产品性能带来的不利影响。制备过程简单可靠，反应条件温和，而且十分容易放大到大量制备。应用范围广，本发明提供的糖基固定相可作为亲水作用色谱分离材料，广泛用于寡糖、糖肽、糖蛋白、多肽、核苷等极性化合物的选择性分离。

Description

一种液相色谱固定相的制备方法及其糖基键合固定相

技术领域

本发明涉及液相色谱固定相，具体的说是糖基键合固定相及其制备方法。

背景技术

反相色谱是当前使用最为广泛的色谱分离模式。但是，反相色谱主要依靠疏水相互作用实现样品的保留与分离，对极性化合物的保留较短，选择性不足。如何提高极性化合物的保留和极性选择性成为HPLC研究和应用需要解决的重要问题。亲水作用色谱(HILIC)是一种使用极性固定相，乙腈/水为流动相，其中水为强洗脱溶剂[Alpert,A.J.J.Chromatogr.1990,499,177]。在HILIC模式下，样品分子极性越大，保留时间越长。因此，HILIC可以作为反相色谱的补充，广泛应用于各类极性化合物的分离[Irgum,K.etal,J.Sep.Sci.,2006,29,1784]。极性固定相是HILIC实现保留和分离选择性的关键因素。当前，HILIC固定相种类众多，结构丰富。色谱评价和应用结果表明，HILIC固定相的结构对其色谱保留和选择性具有显著影响。近年来，各类结构新颖的HILIC固定相被开发和应用。

糖分子具有优异的亲水性，带有多个羟基，可以提供丰富的氢键作用力，而且糖分子的空间结构还可提供结构选择性。Guo等[Guo,Z.M.Chem.Commun.,2006,4512；Guo,Z.M.Chem.Commun.,2007,2491]、Moni等[Moni,L.Chem.Eur.J.2010,16,5712]和Huang等[Huang,H.X.Chem.Commun.,2009,6973]分别报道了基于叠氮-炔基的点击化学方法的糖基HILIC固定相及其在各类极性化合物分离中的应用。专利[CN200710010808.8]和专利[CN200910265450.2]也分别公开了糖基HILIC固定相及其制备方法。以上糖基固定相都以叠氮-炔基之间的环加成反应为制备方法，存在重金属铜催化的问题和使用具有爆炸性危险的叠氮化物带来的安全性问题，不利于大规模应用。近年来，基于巯基-烯烃自由基加成的点击化学方法得到了巨大发展和广泛应用，在色谱固定相的制备中也受到重视。但是，基于巯基-烯烃点击化学的糖基固定相未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种液相色谱固定相及其制备方法。该固定相为糖基键合硅胶固定相。该固定相的制备方法简单可靠，用途广泛。

本发明的技术方案是：一种液相色谱固定相，于键合相为单糖或二糖或寡聚糖，而且键合相中含有特征的硫醚连接基团，其结构式如下：

其中Silica为硅胶，n＝1-10。

本发明还提供了上述固定相的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a.硅胶预处理：硅胶加入质量浓度为1％～38％的盐酸或硝酸溶液中，加热至回流，搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，于80～160℃下干燥至恒重；

b.硅胶表面引入巯基：将步骤a所得干燥硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在惰性气体氛围下加入有机溶剂搅拌，滴加硅烷偶联剂，保持温度为60～140℃条件下搅拌2～48小时。反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，固体产品在60～90℃条件下干燥6-24小时即得3-巯基丙基硅胶；

所述制备方法步骤b所用的有机溶剂为甲醇，乙醇，乙腈，甲苯，二甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种；每克硅胶所需有机溶剂的量为5-30mL；

所述制备方法步骤b所用硅烷偶联剂有如下结构：

其中，X为-OCH₃或-OCH₂CH₃。

所述制备方法步骤b中硅烷偶联剂的使用量为每克硅胶使用0.1mL-2mL；

c.巯基-烯烃点击化学反应键合糖固定相：将步骤b所得的3-巯基丙基硅胶中加入体积比为1/10～10/1的水/甲醇或水/乙醇混合溶剂中，每克3-巯基丙基硅胶所需混合溶剂量为5-50mL，再加入烯基糖和引发剂，在40～70℃条件下反应10～100小时。过滤，依次用甲醇，水，甲醇洗涤，所得固体于60～90℃条件下干燥6～48小时，即得键合糖固定相；

所述制备方法步骤c所用烯基糖为修饰了烯丙基的单糖、二糖、聚合度为3～10的寡糖中的一种或多种；

所述步骤c所用烯基糖使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用1～50mmol；

所述制备方法步骤c所用的引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈；

所述制备方法步骤c中引发剂使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用0.01～1mmol。

本发明具有如下优点：

1.固定相结构新颖。本发明首次提出以硫醚连接的糖分子作为键合固定相，含有特定的硫醚单元，因而具有良好的亲水性和亲硫特性，并且保持电中性。

2.应用范围广。本发明提供的糖基键合固定相适合用于核苷、寡糖、多肽、皂苷等极性物质的分离分析和分离制备。

3.本发明提供的制备方法为无重金属催化反应，因此最终产物中不含重金属残留，完全避免重金属对产品性能带来的不利影响。

4.制备过程安全可靠，较传统的叠氮-炔基反应，本发明提供的制备方法不涉及叠氮基团，可以避免爆炸危险。

5.制备过程简单可靠，有利于实现产业化。

附图说明

图1为使用实施例1所得色谱固定相用于核苷分离分析图。

图2为使用实施例1所得色谱固定相用于半乳寡糖分离分析图。

图3为使用实施例1所得色谱固定相用于葡寡糖分离分析图。

图4为使用实施例1所得色谱固定相用于多肽分离分析图。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

所述含有烯基的糖参照文献[H.B.MereyalaandS.R.Gurrala,Carbohy.Resear.,1998,307,351-354；A.K.Pathak,etal，Carbohy.Resear.,2004,339,683-691]方法制备，简要过程如下：在乙酸酐溶液中加入糖，加热回流2～4小时，冷却至室温，倒入冰水中析出固体，即得全乙酰糖；将全乙酰糖溶于二氯甲烷中，然后在冰水浴中加入丙炔醇和三氟化硼/乙醚，室温下搅拌2～4小时，加入K₂CO₃继续搅拌30分钟，过滤除去固体，浓缩干燥滤液得固体产品，用二氯甲烷/正己烷重结晶即得烯基乙酰糖；将烯基乙酰糖溶于甲醇溶液中，通入氨气，室温搅拌12～24小时，浓缩干燥溶液得油状固体，使用甲醇重结晶即得烯基糖。

实施例1

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积300m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，加入30mL甲醇和30mL水，然后加入10g烯基麦芽糖和0.4g偶氮二异丁腈，65℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得键合麦芽糖固定相。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，使用葡萄糖代替麦芽糖，按实施例1的合成步骤可得键合葡萄糖固定相。

实施例3

与实施例1的不同之处在于，使用甘露糖代替麦芽糖，按实施例1的合成步骤可得键合甘露糖固定相。

实施例4

与实施例1的不同之处在于，使用纤维二糖代替麦芽糖，按实施例1的合成步骤可得键合纤维二糖固定相。

实施例5

与实施例1的不同之处在于，使用聚合度为2-9的木寡糖代替麦芽糖，按实施例1的合成步骤可得键合木寡糖固定相。

实施例6

称取100g球形硅胶(粒径为3μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于500mL玻璃烧瓶中，加入300mL体积浓度为38％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，120℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于1000mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入600mL甲醇，搅拌均匀，然后滴加30mL巯丙基三甲氧基硅烷，于65℃条件回流搅拌反应24小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥24小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于2000mL三口玻璃瓶中，加入500mL乙醇和1000mL水，然后加入50g烯基乳糖和0.2g偶氮二异庚腈，55℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得乳糖键合固定相。

实施例7

称取20g球形硅胶(粒径为10μm，孔径为300nm，比表面积80m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入100mL体积浓度为10％的硝酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，160℃干燥12小时。

将干燥后的硅胶置于500mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入200mL乙腈，搅拌均匀，然后滴加5mL巯丙基三甲氧基硅烷，于80℃条件回流搅拌反应12小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于1000mL三口玻璃瓶中，加入300mL乙醇和300mL水，然后加入150g烯基半乳糖和0.1g偶氮二异庚腈，60℃条件下搅拌48小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得半乳糖键合固定相。

实施例8

使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于核苷分离分析。如图1所示，核苷得到很好的分离。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：100mM甲酸铵：乙腈：水＝10:85:5

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：270nm。

实施例9

使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于半乳寡糖分离分析，如图2所示。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：70％乙腈+30％水，经10min达50％乙腈+50％水，并保持10min

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

ELSD检测器：30psi，70℃，加热模式-动力级别70％，增益值100

实施例10

使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于葡寡糖分离分析，如图3所示。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：70％乙腈+30％水，经20min达50％乙腈+50％水

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

ELSD检测器：30psi，70℃，加热模式-动力级别70％，增益值100。

实施例11

使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于多肽分离分析，如图4所示。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：A：20mM磷酸二氢钾(pH＝2.4)；B：乙腈75％B经20min达50％B

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：210nm。

Claims (9)

1.一种液相色谱固定相的制备方法，包括如下步骤：

a.硅胶预处理：硅胶加入质量浓度为1％～38％的盐酸或硝酸溶液中，加热至回流，搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，于80～160℃下干燥至恒重；

b.硅胶表面引入巯基：将步骤a所得干燥硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在惰性气体氛围下加入有机溶剂搅拌，滴加硅烷偶联剂，保持温度为60～140℃条件下搅拌2～48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤并依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，固体产品在60～90℃条件下干燥6-24小时即得巯丙基硅胶；

c.巯基-烯烃点击化学反应键合糖固定相：将步骤b所得的3-巯基丙基硅胶中加入体积比为1/10～10/1的水/甲醇或水/乙醇混合溶剂中，每克3-巯基丙基硅胶所需混合溶剂量为5-50mL，再加入烯基糖和引发剂，在40～70℃条件下反应10～100小时；过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于60～90℃条件下干燥6～48小时，即得键合糖固定相。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b所用的有机溶剂为甲醇，乙醇，乙腈，甲苯，二甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种；每克硅胶所需有机溶剂的量为5-30mL。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b所用硅烷偶联剂有如下结构：

其中，X为-OCH₃或-OCH₂CH₃；

步骤b中硅烷偶联剂的使用量为每克硅胶使用0.1mL-2mL。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c所用烯基糖为修饰了烯丙基的单糖、二糖、聚合度为3～10的寡糖中的一种或二种以上。

5.按照权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于：步骤c所用烯基糖使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用1～50mmol。

6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c所用的引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈。

7.按照权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于：步骤c中引发剂使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用0.01～1mmol。

8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a中每克硅胶所需盐酸或硝酸溶液的量为2-100mL。

9.一种权利要求1-8任一方法制备的糖基键合固定相，其特征在于：键合相为单糖或二糖或寡聚糖，而且键合相中含有特征的硫醚连接基团，其结构式如下：

其中Silica为硅胶，n＝1-10。