CN107694539B - 一种新型反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相及其制备方法 - Google Patents

一种新型反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相及其制备方法。所述反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的结构式如式Ⅰ所示。所述反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法包括如下步骤:1)乙烯基硅烷偶联剂与球形硅胶表面的硅羟基经硅烷偶联反应,得到式Ⅱ所示化合物;2)式Ⅱ所示化合物与半胱氨酸经巯基‑烯点击化学反应,得到式Ⅲ所示化合物;3)式Ⅲ所示化合物与异氰酸十八酯反应经氨基与异氰酸基团之间的反应即得。由于本发明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相键合有亲水性基团,使其疏水性减弱,因此能够解决肽段疏水性太强而引起的不可逆吸附的问题,使蛋白质组的定性定量分析结果更加准确。

Description

一种新型反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种新型反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相及其制备方法,属于色谱分离研究领域。
背景技术
随着蛋白质组学研究向深度覆盖定性鉴定和规模化的定量分析方向发展,对蛋白质组学技术提出了新的要求。蛋白质组学研究的核心技术之一是分离方法,并且液相色谱分离与质谱检测联用技术已经成为蛋白质组学研究中的常规方法。面对生物样本的极端复杂性以及对分析系统本身在准确性、灵敏性、选择性、快速和自动化以及重现性方面越来越高的要求,传统的单一模式反相色谱分离方法已不能满足要求。目前,反相色谱与离子交换色谱联用是蛋白质组学中较为经典的分离方法。例如,Zeng[DaiJ,WangLS,WuYB,etal.JProteome Res,2009,8(1):133]等将强阳离子交换柱与反相色谱柱在线联用分析鼠肝蛋白组,Zhang等[GuX,DengC,YanG,etal.JProteomeRes,2006,5(11):3186]使用一维强阳离子交换色谱和二维阵列式反相色谱柱分析正常人肝组织蛋白质组,均提高了蛋白质组的鉴定效率。这种二维液相色谱分离方法在磷酸化蛋白鉴定和高峰度蛋白的去除等方面也有很多应用。但这种方法通常需要两根或更多数量的色谱柱,并且不同色谱柱之间的连接较为复杂,需要流动相之间的多次切换。
混合模式色谱(mixed-mode chromatography,MMC)的出现为解决这个问题指明了方向。混合模式色谱是在一根色谱柱上能够实现两种或多种分离机理的分离技术。由于多种作用力的存在,混合模式色谱将十分有利于复杂生物样品的分离工作。一种MMC的实现方式是将多种分离机理的色谱填料进行混合,然后装填到色谱柱中,但这种方法往往由于功能基团之间相距较远而导致分离效果不理想,重复性差。而另一种方式是发展具有多种功能集团的色谱固定相,它较前一种方法更为理想,因此成为近年来研究的热点,但目前的研究主要集中在将两种正交性较好的色谱模式进行组合,例如,反相/离子交换作用混合模式色谱(reversed phase/ion-exchange mixed-mode chromatography,RPLC/IEX)[NogueiraR,Lubda D,Leitner A,et al.J Sep Sci,2006,29(7):966]、亲水/离子交换作用混合模式色谱(hydrophilic interaction/ion-exchange mixed-mode chromatography,HILIC/IEX)[Mant C T,Hodges R S.J Sep Sci,2008,31(15):2754]以及反相/亲水作用(reversed-phase/hydrophilic interaction mixed-mode chromatography,RPLC/HILIC)[Wu J Y,Bicker W G,Lindner W G.J Sep Sci,2008,31(9):1492]。梁鑫淼等通过极性共聚的方法制备了C18WCX[Guo Z M,Wang C R,Liang T,et al.J Chromatogr A,2010,1217(27):4555]、C18SCX[Wei J,Guo Z M,Zhang P J,et al.J Chromatogr A,2012,1246:129]以及C18SAX[Li X L,Guo Z M,Sheng Q Y,et al.Analyst,2012,137(12):2774]反相/离子交换作用混合模式色谱(RPLC/IEX)填料,它们极大地提高了蛋白质与多肽的鉴定数量,并且在磷酸化肽的富集中获得了更高的选择性。亲水/离子交换作用混合模式色谱(HILIC/IEX)作为反相色谱的前期分离方法越来越多的应用到了蛋白或多肽的分离和鉴定中。基于此,梁鑫淼等[Shen A J,Guo Z M,Yu L,et al.ChemCommun,2011,47(15):4550]通过点击化学的方法制备了HILIC/IEX混合模式固定相,显示出了极强的富集糖肽的能力。但由于他们制备的C18WCX混合模式色谱填料采用的是极性共聚的方法,得到的填料表面反相分离机制的C18基团和离子交换作用分离机制的羧基是间隔的,且分布不均匀。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相,由于双重分离机制的存在,在复杂蛋白质样本的分离中,可以对化学性质相近的肽段进行进一步的分离,并且能够解决肽段疏水性太强而引起的不可逆吸附的问题,从而提高蛋白质组的鉴定覆盖率;同时本发明提供的固定相的制备方法具有反应选择性好、产率高、反应条件简单等优点。
本发明所提供的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的结构式如式Ⅰ所示,
Figure BDA0001072369660000021
式Ⅰ中,
Figure BDA0001072369660000022
表示球形硅胶。
本发明进一步提供了所述反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法,包括如下步骤:
1)乙烯基硅烷偶联剂与球形硅胶表面的硅羟基经硅烷偶联反应,得到式Ⅱ所示化合物;
Figure BDA0001072369660000023
Figure BDA0001072369660000031
式Ⅱ中,
Figure BDA0001072369660000032
表示所述球形硅胶;
2)式Ⅱ所示化合物与半胱氨酸经巯基-烯点击化学反应,得到式Ⅲ所示化合物;
Figure BDA0001072369660000033
式Ⅲ中,
Figure BDA0001072369660000034
的定义同式Ⅱ中;
3)式Ⅲ所示化合物与异氰酸十八酯反应经氨基与异氰酸基团之间的反应,得到式Ⅰ所示反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相;
Figure BDA0001072369660000035
式Ⅰ中,
Figure BDA0001072369660000036
的定义同式Ⅱ中。
上述的制备方法中,所述球形硅胶的粒径为2.8~3.2μm,孔径为
Figure BDA0001072369660000037
即为多孔硅胶小球,如选择粒径为3μm、孔径为
Figure BDA0001072369660000038
的球形硅胶。
上述的制备方法中,步骤1)之前,所述方法还包括对所述球形硅胶进行如下预处理的步骤:
将所述球形硅胶分散于盐酸水溶液(如20wt%)中并超声处理(如半小时);然后置于旋转混合仪震荡过夜,并用水清洗至中性,于110℃干燥过夜即可。所述预处理的步骤可起到如下作用:一方面可以洗去球形硅胶表面吸附的微量金属离子,另一方面可以使球形硅胶表面的硅羟基充分暴露,提高反应量。
上述的制备方法中,步骤1)中,所述乙烯基硅烷偶联剂可为乙烯基三氯硅烷;
所述硅烷偶联反应在惰性气氛下进行,如氮气;
所述球形硅胶与所述乙烯基硅烷偶联剂的配比为:1g所述球形硅胶:1~10mL所述乙烯基硅烷偶联剂,如1g所述球形硅胶与1mL所述乙烯基硅烷偶联剂进行反应;
所述硅烷偶联反应的温度为35~40℃,时间为20~24h,如在40℃下搅拌反应24小时;
所述反应可在甲苯中进行;反应结束后还可依次用甲苯、甲醇和二氯甲烷对产物进行清洗,于80℃干燥6h。
上述的制备方法中,步骤2)中,所述巯基-烯点击化学反应在偶氮二异丁腈的催化下进行;
式Ⅱ所示化合物、所述半胱氨酸与所述偶氮二异丁腈的质量比为1:0.8~1.2:0.008~0.012,具体可为1:1:0.01
所述巯基-烯点击化学反应的温度为65~70℃,时间为20~24h,如在65℃下搅拌反应24小时;反应结束后可分别用水和甲醇清洗产物,并于80℃干燥6h;
所述巯基-烯点击化学反应可在甲醇水溶液中进行,所述甲醇水溶液中,甲醇与水的体积比可为1:2。
上述的制备方法中,步骤3)中,所述反应在二月桂酸二丁基锡的催化下进行;
式Ⅲ所示化合物与所述异氰酸十八酯的配比为:1g式Ⅲ所示化合物:0.8~1.2mL所述异氰酸十八酯,如1g式Ⅲ所示化合物与1mL所述异氰酸十八酯进行反应;
式Ⅲ所示化合物与所述二月桂酸二丁基锡的配比为:1g式Ⅲ所示化合物:0.8~1.2μL所述二月桂酸二丁基锡,如1g式Ⅲ所示化合物需加入1μL所述二月桂酸二丁基锡;
所述反应的温度为48~52℃,时间为22~26h,如在50℃下搅拌反应24小时;反应结束后可分别用四氢呋喃和甲醇清洗产物,并于80℃干燥6h;
所述反应可在四氢呋喃中进行。
本发明提供的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相可用于固定相分离蛋白质、多肽或多环芳烃混合物。
经本发明实验验证,在反相模式下,本发明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相能够实现对16种多环芳烃混合物的良好分离,这16种多环芳烃混合物为萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[ghi]苝和茚并[1,2,3-cd]芘的混合物。
经本发明实验验证,本发明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相能够实现对牛血清白蛋白酶切肽段混合物的良好分离。
经本发明实验验证,本发明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相能够对Hep-G2细胞全蛋白酶切肽段混合物进行分离,共鉴定到了5924个蛋白质。
本发明具有如下优点:
(1)本发明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相,由于双重分离机制的存在,在复杂蛋白质样本的分离中,对化学性质相近的肽段既可以根据其疏水性进行分离,又可以根据其等电点的不同进行进一步的分离,从而有效提高蛋白质组的鉴定覆盖率。
(2)由于本发明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相键合有亲水性基团,使其疏水性减弱,因此能够解决肽段疏水性太强而引起的不可逆吸附的问题,使蛋白质组的定性定量分析结果更加准确。
(3)采用了“巯基-烯”点击化学的方法制备固定相,其优点为:反应原料易得、反应简单可靠、产率高、反应条件温和,并且该点击化学反应不使用铜作为催化剂,所以固定相中无铜残留,使其在分离生物样本的过程中不会产生样品降解等影响。
附图说明
图1为裸硅球(图1(A))与本发明实施例1制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相(图1(B))的扫描电镜图。
图2为裸硅球与本发明实施例1制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的傅里叶转换-红外光谱图。
图3为本发明实施例2中反相/弱阳离子交换混合模式色谱柱(图3(A))以及资生堂反相色谱柱(图3(B))分离多环芳烃混合物的色谱图。
图4为本发明实施例3中不同pH条件下6种多肽混合物的分离色谱图,其中,图4(A)为pH值为4.5时的分离色谱图,图4(B)为pH值为6时的分离色谱图,图4(C)为pH值为7.5时的分离色谱图。
图5为本发明实施例3中资生堂反相色谱柱对6条肽段混合物的分离色谱图。
图6为本发明实施例4中反相/混合模式混合模式色谱(图6(A))以及十八烷基反相色谱(图6(B))固定相分离牛血清白蛋白酶切肽段混合物的总离子流色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、制备反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相
(1)取30g球形硅胶(粒径为3μm,孔径为
Figure BDA0001072369660000051
),分散于5mL/g盐酸溶液(20wt%)中,超声半小时,于旋转混合仪上震荡过夜。用去离子水清洗硅胶至中性,于110℃干燥过夜,置于干燥器中备用。
(2)取15g预处理硅胶微球基质分散于45mL干燥甲苯中,加入15mL乙烯基三氯硅烷,氮气保护下,于40℃水浴中在100rpm磁力搅拌速度下反应24h。反应后,分别用甲苯、甲醇和二氯甲烷清洗,于80℃干燥6h。
(3)然后将反应后的硅球分散于100mL甲醇:水(V:V=1:2)中,并加入15g半胱氨酸以及0.15g偶氮二异丁腈,于65℃水浴中磁力搅拌反应24h,分别用水和甲醇清洗硅胶,于80℃干燥6h。
(4)最后,将反应好的硅球分散于100mL四氢呋喃中,加入10mL异氰酸十八酯和10μL二月桂酸二丁基锡,于50℃水浴中磁力搅拌反应24h,分别用四氢呋喃和甲醇清洗硅球,于80℃干燥6h。即得到本发明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相。
采用有机元素分析、傅里叶转换红外分光光度法以及扫描电镜对本实施例制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料进行了表征。
通过扫描电镜图(图1),可以观察到填料形状完整,粒径均匀。
元素分析表征结果,反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的碳含量为14.92%,商品化十八烷基反相固定相的碳含量为15.25%,两者碳含量基本相同,说明反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相表面基团的键合效率较高,表面基团数量符合色谱分离要求。从氮元素含量的不同也能看出本发明制备的填料与十八烷基反相固定相的不同,说明固定相上连接的基团符合预期。
在傅里叶转换-红外光谱图中(图2),可以明显看到波数为2850cm-1、2919cm-1处的C-H伸缩振动吸收峰,由于硅羟基的存在,掩蔽了羧基的红外吸收峰,因而从傅里叶转换-红外光谱图中看不到明显的羧基吸收峰。而从图中可以明显看到反应后硅羟基峰强大幅度减小,说明功能集团的键合较为完全,因而不需要封尾。
上述表征结果均表明本实施例成功制备了反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相。
实施例2、分离多环芳烃混合物
使用实施例1中制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相采用高压匀浆法将固定相装入4.6×150mm的不锈钢色谱柱中,在反相模式下对16种多环芳烃混合物进行分离。作为对比,在相同色谱条件下,使用资生堂公司反相色谱柱(型号为CAPCELL PAKC18MGII S3)分离16种多环芳烃混合物。
色谱条件:样品浓度为10μg/mL,上样体积为10μL,流速为0.5mL/min。A相:水;B相:乙腈;梯度为:0~5min 60%~100%B,5~45min 100%B。检测波长为254nm。
分离色谱图如图3所示(峰1表示萘;峰2表示苊烯;峰3表示苊;峰4表示芴;峰5表示菲;峰6表示蒽;峰7表示荧蒽;峰8表示芘;峰9表示苯并[a]蒽;峰10表示屈;峰11表示苯并[b]荧蒽;峰12表示苯并[k]荧蒽;峰13表示苯并[a]芘;峰14表示二苯并[a,h]蒽;峰15表示苯并[ghi]苝;峰16表示茚并[1,2,3-cd]芘),可以看出,两种色谱柱对16种多环芳烃混合物均能做到良好分离,但反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相可以将分离的化合物更加均匀的分布在一个分离周期内,说明其在分离复杂样本的时候具有更好的分离度。
实施例3、分离多肽混合物
使用实施例1中制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相采用高压匀浆法将固定相装入4.6×150mm的不锈钢色谱柱中,在不同pH条件下对6种多肽的混合物进行分离。
色谱条件为:样品浓度为0.5μg/μL,上样体积为20μL,流速为0.5mL/min。A相:98%水(20mM甲酸铵,pH 4.5,6.0,7.5)~2%乙腈;B相:98%乙腈~2%水;梯度为:0~30min2%~95%B。检测波长为214nm。
分离色谱图如图4,在pH较低时,反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相表现为反相分离机制,无法将6种多肽完全分离;pH较高时,该固定相表现为混合模式的分离机制,可以将6种多肽完全分离。
使用资生堂公司反相色谱柱(型号为CAPCELL PAK C18MGII S3)分离6种多肽的混合物。其色谱条件为:样品浓度为0.5μg/μL,上样体积为20μL,流速为0.5mL/min。A相:98%水-2%乙腈-0.1%甲酸(pH 2.6);B相:98%乙腈-2%水-0.1%甲酸;梯度为:0-30min 2%-95%B。检测波长为214nm。该色谱柱无法将6种多肽完全分离(如图5所示)。
实施例4、分离牛血清白蛋白酶切肽段混合物
使用实施例1中制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相以及十八烷基反相固定相(购自北京金欧亚公司)分别采用高压匀浆法装入15cm×75μm i.d.直喷柱中,对牛血清白蛋白酶切肽段混合物进行分离,总离子流色谱图如图6所示,可以看出,两者均获得了良好的分离效果。
毛细管液相色谱条件:样品浓度为0.1μg/μL,上样体积为5μL,流速为300nL/min。流动相A:2%乙腈和0.1%甲酸水溶液;流动相B:98%乙腈和0.1%甲酸水溶液;洗脱梯度为:0-5min5%-8%B,5-30min8%-40%B,30-35min40%-95%B,35-40min95%B,40-42min95%-5%B,42-52min5%B。质谱条件:使用LTQ质谱仪(Thermo Fisher)进行检测,选用正离子模式采集数据,质谱扫描范围设为m/z 400.0-1600.0,采集时间为52min。在采用数据依赖模式(DDA)进行串联质谱分析时,选取一级质谱中10个信号最强的离子进行二级质谱分析,其碰撞能量设为35V,动态排除(dynamic exclusion)时间为30秒。
实施例5、分离蛋白质
使用实施例1中制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相采用采用高压匀浆法将固定相装入4.6×150mm的不锈钢色谱柱中。建立了一种离线二维-反相/弱阳离子交换-反相色谱分离-质谱鉴定蛋白质组的分析方法,并且在第一维液相分离中使用了pH梯度的流动相,即使用pH值不同的流动相,通过A、B相的梯度混合,获得pH梯度。
二维-反相/弱阳离子交换-反相色谱分离中第一维分离色谱条件:样品浓度为1μg/μL,上样体积为100μL,流速为0.5mL/min。A相:98%水(20mM甲酸铵,pH 2.5)-2%乙腈;B相:98%乙腈-2%水(20mM甲酸铵,pH 7.5);梯度为:0-5min 5%-8%B,5-20min 8%-18%B,20-70min 18%-40%B,70-75min 40%-95%B,75-80min 95%B,80-85min 95%-5%B。检测波长为214nm。馏分收集:从洗脱开始后第7min开始到第72min结束,将每分钟得到的馏分分别收集到1.5mL离心管中,按照表1中所示,将每行中的对应时间收集到的馏分合并成为6个组分,使用真空离心浓缩仪在45℃条件下将组分浓缩至约0.5mL。
表1馏分合并策略
Figure BDA0001072369660000081
二维-反相/弱阳离子交换-反相色谱分离中第二维分离色谱条件:色谱柱为十八烷基反相毛细管直喷柱(150mm×150μm i.d.固定相粒径1.9μm),样品浓度为0.1μg/μL,上样体积为5μL,流速为600nL/min。流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:0.1%甲酸的乙腈溶液;洗脱梯度为:0-8min 6%-9%B,8-24min 9%-14%B,24-60min14%-30%B,60-75min30%-40%B,75-78min 40%-95%B,78-85min 95%B,85-90min95%-6%B。
质谱条件:使用Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Fisher)进行检测,选用正离子模式采集数据,采集时间为90min。喷雾电压为2kV,采用数据依赖模式(DDA)进行串联质谱全扫描分析,扫描范围设为m/z 300-1400,其分辨率为120000,动态排除(dynamicexclusion)时间为12秒。
一维离线反相/弱阳离子交换混合模式色谱分离与二维反相色谱分离正交,对100μg Hep-G2细胞全蛋白酶切肽段混合物进行分离,共鉴定到了5924个蛋白质。

Claims (9)

1.式Ⅰ所示反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相,
Figure FDA0002247358160000011
式Ⅰ中,
Figure FDA0002247358160000012
表示球形硅胶。
2.式Ⅰ所示反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法,包括如下步骤:
1)乙烯基硅烷偶联剂与球形硅胶表面的硅羟基经硅烷偶联反应,得到式Ⅱ所示化合物;
Figure FDA0002247358160000013
式Ⅱ中,
Figure FDA0002247358160000014
表示所述球形硅胶;
2)式Ⅱ所示化合物与半胱氨酸经巯基-烯点击化学反应,得到式Ⅲ所示化合物;
Figure FDA0002247358160000015
式Ⅲ中,
Figure FDA0002247358160000016
的定义同式Ⅱ中;
3)式Ⅲ所示化合物与异氰酸十八酯反应经氨基与异氰酸基团之间的反应,即得式Ⅰ所示反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相;
Figure FDA0002247358160000017
式Ⅰ中,
Figure FDA0002247358160000018
的定义同式Ⅱ中。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述球形硅胶的粒径为2.8~3.2μm,孔径为
Figure FDA0002247358160000021
4.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于:步骤1)之前,所述方法还包括对所述球形硅胶进行如下预处理的步骤:
将所述球形硅胶分散于盐酸水溶液中并超声处理;然后置于旋转混合仪震荡,并用水清洗至中性,干燥即可。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于:步骤1)中,所述乙烯基硅烷偶联剂为乙烯基三氯硅烷;
所述硅烷偶联反应在惰性气氛下进行;
所述球形硅胶与所述乙烯基硅烷偶联剂的配比为:1g所述球形硅胶:9~11mL所述乙烯基硅烷偶联剂;
所述硅烷偶联反应的温度为35~40℃,时间为20~24h。
6.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于:步骤2)中,所述巯基-烯点击化学反应在偶氮二异丁腈的催化下进行;
式Ⅱ所示化合物、所述半胱氨酸与所述偶氮二异丁腈的质量比为1:0.8~1.2:0.008~0.012;
所述巯基-烯点击化学反应的温度为65~70℃,时间为20~24h。
7.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于:步骤3)中,所述反应在二月桂酸二丁基锡的催化下进行;
式Ⅲ所示化合物与所述异氰酸十八酯的配比为:1g式Ⅲ所示化合物:0.8~1.2mL所述异氰酸十八酯;
式Ⅲ所示化合物与所述二月桂酸二丁基锡的配比为:1g式Ⅲ所示化合物:0.8~1.2μL所述二月桂酸二丁基锡;
所述反应的温度为48~52℃,时间为22~26h。
8.权利要求1所述反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相在作为固定相分离蛋白质或多环芳烃混合物中的应用。
9.权利要求1所述反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相在作为固定相分离多肽混合物中的应用。
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