CN104028254B - 一种温度响应型的β-环糊精硅胶固定相及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种温度响应型的β-环糊精硅胶固定相，其结构式为：
Description
技术领域
本发明涉及一种液相色谱固定相的制备方法，具体地说，是提供一种制备高效液相色谱温度响应型硅胶固定相的方法。
背景技术
水溶性、温度敏感性聚合物是近年来十分引人注目的功能高分子材料。自上世纪70年代末发现轻度离子化的聚丙烯酰胺在特定的介质中具有体积相转变现象后，人们对引起其体积相转变的一系列因素，如：温度、压力、溶剂组成、pH值以及离子强度等都进行了深入的研究。近年来这类温敏性聚合物凝胶已在药物控制释放，物质的分离，固定化酶等领域显示出广阔的应用前景。有关在填料表面用热敏性聚合物接枝改性用于色谱固定相不断见诸报道，其主要是基于聚丙烯酰胺这类热敏性聚合物，尤其是聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，它有低临界溶解温度(LCST)，约为32℃。当温度上升到其LCST时，聚合物分子链段构象会发生从亲水状态到疏水状态的转变。利用这一性质，可以使热敏性聚合物改性的固定相表面发生由极性到非极性的转变，从而在相转变温度前后对溶质分子产生不同的作用力，达到分离的效果。这就在原有的通过改变流动相为主要分离手段的基础上引入了新的分离方法，具有很高的应用价值。
其中对热敏性固定相研究最多的是日本的TeruoOkano[12-17]小组。最近，他们设计并合成了几种温度和pH双响应的色谱固定相，同时还嵌入了阴、阳离子官能基团和憎水链，在生物分子的分析与分离方面显示出巨大的潜力（参见E.Ayanao,H.Kanazawa,A.Kikuchi,T.Okano,Anal.Sci.17(2001)873;C.Sakamoto,Y.Okada,H.Kanazawa,E.Ayano,T.Nishimura,M.Ando,A.Kikuchi,T.Okano,J.Chromatogr.A1030(2004)247;E.Ayano,K.Nambu,C.Sakamoto,H.Kanazawa,A.Kikuchi,T.Okano,J.Chromatogr.A1119(1–2)(2006)58）。这类材料主要是通过温度的改变，使聚合物分子链段构象会发生亲、疏水状态的转变，而实现分子在功能基团上的吸附与脱附。
尽管如此，目前温度敏感性色谱填料的种类还很有限，对它的保留机理有待进一步研究，因此，对温敏性色谱填料的制备和应用研究具有重要的意义。
发明内容
鉴于上述，本发明的目的旨在提供一种温度响应型的β-环糊精硅胶固定相。这是一种新型的分离材料，这种材料结构新颖，应用灵活，可以通过柱温的控制来实现分子的有效分离，并且具有亲水色谱的特征,适用于极性和强亲水性物质、生物分子以及手性分子的分离。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种温度响应型的β-环糊精硅胶固定相，其结构式为：
一种温度响应型的β-环糊精硅胶固定相制备方法，其合成步骤为：
a.β-环糊精衍生物的制备
将质量比为1：1-1.5：0.4-0.6的β-环糊精、对甲苯磺酰氯和氢氧化钠充分混合。在冰浴下反应5-10小时，然后过滤，调节pH至中性，洗涤，干燥，即得苯甲酰化的β-环糊精；
在苯甲酰化的β-环糊精中，加入乙二胺，每克苯甲酰化的β-环糊精所需乙二胺剂量为5-8mL，在75℃水浴中搅拌反应4小时；再向上述反应液逐滴加入到冷丙酮中，立即生成白色沉淀，减压过滤，将白色沉淀重新溶解于水/甲醇（体积比为3:1）的混合溶液中，过滤得到淡黄色澄清液体；将淡黄色澄清滤液缓慢倒入丙酮中，减压过滤收集白色沉淀；洗涤产物，干燥即得到β-环糊精衍生物；
b.烯基硅胶的制备
将硅胶分散于无水甲苯中，每克硅胶所需无水甲苯剂量为10-50mL，再加入带双键的硅烷化试剂3-（甲基丙烯酰氧基）丙基-三甲氧基硅烷，每克硅胶所需硅烷化试剂剂量为0.5-1.5mL，在氮气保护下，搅拌回流24小时，然后用沙芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷，丙酮，甲醇洗涤，然后在真空干燥箱中于40-60℃干燥12-24小时，即得烯基硅胶；
c.温度响应聚合物在硅胶表面的形成
将烯基硅胶分散于1，4-二氧六环或甲苯溶剂中，每克烯基硅胶所需溶剂剂量为10-50mL，再加入N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油醚两种具有温度响应能力的聚合物单体，两种单体质量比为2-4:1，烯基硅胶与聚合物单体质量比为1：0.2-1，最后加入偶氮二异丁腈引发剂，偶氮二异丁腈引发剂用量为聚合物单体质量的0.5-1.0%；在氮气保护下，于70-80℃反应10-20小时，依次用1，4-二氧六环，丙酮，二氯甲烷，甲醇洗涤，然后在真空干燥箱中于40-60℃干燥12-24小时，即得温度响应聚合物包裹的硅胶。
d.β-环糊精衍生物植入聚合物链
将温度响应聚合物包裹的硅胶分散于甲苯中,每克硅胶所需甲苯剂量为10-50mL，再加入β-环糊精衍生物，其用量为硅胶质量的100%，在60-90℃下反应5-10小时，即得温度响应型β-环糊精硅胶固定相。该固定相为淡黄色球形固体，它的LCST约为32℃，聚合物的上载量为10-30%。
温度响应型的β-环糊精硅胶固定相合成路线为：
本发明具有如下优点：
1.结构新颖。本发明合成的温度响应型的β-环糊精硅胶固定相是由一个具有温敏性的线性聚合物层和一个具有不同取代基修饰的环糊精衍生物构成。温敏聚合物可以提供温度响应能力，环糊精衍生物可以提供亲水特性和手性分离能力。因此可以用作温敏色谱固定相、亲水色谱固定相和手性固定相,在色谱分析方面显示独特的行为能力。
2.应用灵活。作为温敏固定相，通常只需要调节柱温就能满足不同样品的分析要求，可广泛应用于分析化学和生物化学领域。
3.热敏聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺可以在硅胶表面形成致密的保护层，使其耐受更宽的pH值范围，避免了残余硅羟基对极性溶质的非特异性吸附。并且由于聚N-异丙基丙烯酰胺有低临界溶解温度，约为32℃，并且聚合物侧链引入了β-环糊精功能基团，因此该固定相主要是通过温度的改变，使聚合物分子链段构象发生亲、疏水状态的转变，而实现分子在β-环糊精功能基团上的吸附与脱附，实现目标分子的有效分离。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明技术方案再作进一步说明：
实施例1
β-环糊精衍生物的制备
将20.0g氢氧化钠溶于800mL蒸馏水，加入40.0gβ-环糊精，在0-5℃剧烈搅拌下，加入40.0g对甲苯磺酰氯反应5小时；过滤，将滤液冷却至0℃，用盐酸调节pH至6-7，保存在冰箱中过夜，得到白色固体产物；洗涤，干燥，即得苯甲酰化的β-环糊精。；
称取10.0g苯甲酰化的β-环糊精，随后加入60mL乙二胺，在75℃水浴中搅拌反应4小时；再向上述反应液逐滴加入到500mL冷丙酮中，立即生成白色沉淀，减压过滤，将白色沉淀重新溶解于60mL水/甲醇（v/v=3:1）的混合溶液中，过滤得到淡黄色澄清液体；将淡黄色澄清滤液缓慢倒入200mL丙酮中，减压过滤收集白色沉淀；洗涤产物，干燥即得到β-环糊精衍生物；
烯基硅胶的制备
硅胶为球形硅胶，直径为7μm，孔径为10nm。将2g硅胶分散于30mL无水甲苯中，加入2mL3-（甲基丙烯酰氧基）丙基-三甲氧基硅烷，在氮气保护下，搅拌回流24小时。然后用沙芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷，丙酮，甲醇洗涤，放置在真空干燥箱中于60℃干燥12小时，即得烯基硅胶；
温度响应聚合物在烯基硅胶表面的形成
将2g烯基硅胶分散于80mL1，4-二氧六环中，再加入0.7gN-异丙基丙烯酰胺和0.3g甲基丙烯酸缩水甘油醚，最后加入0.008g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下，于75℃反应18小时，依次用1，4-二氧六环，丙酮，二氯甲烷，甲醇洗涤，然后于50℃干燥18小时，即得温度响应聚合物包裹的硅胶；
β-环糊精衍生物植入聚合物链
将2g温度响应聚合物包裹的硅胶分散于80mL甲苯中，加入2gβ-环糊精衍生物，在75℃下反应8小时，过滤，依次用甲苯、丙酮、甲醇洗涤，即得温度响应型硅胶固定相。
应用例1
用实施例1所得到的温度响应型硅胶固定相，匀浆法填充于长150mm，内径为4.6mm的不锈钢柱子中，得到的色谱柱用于分析分离样品。
用上述制备的色谱柱，通过柱温的控制分离了几种极性核苷混合物。图1为柱温=20℃时，其色谱分离结果：1-肌苷；2-胸腺嘧啶；3-腺苷；4-腺嘌呤，由图可以看到上述4种化合物不能有效的分离；图2为柱温=50℃时，其色谱分离结果：1-肌苷；2-胸腺嘧啶；3-腺苷；4-腺嘌呤，由图2可以看到，当柱温从20℃升高至50℃后，上述4种混合物得到了很好的分离，则表明该固定相具有良好的温度响应能力。
图1-2的色谱条件为:10mM的乙酸铵水溶液;流速为1.0mL/min；检测波长248nm。
Claims (2)
1.一种温度响应型的β-环糊精硅胶固定相，其结构式为：
。
2.一种权利要求1所述的一种温度响应型的β-环糊精硅胶固定相的制备方法，其步骤是：
a.β-环糊精衍生物的制备
将质量比为1：1-1.5：0.4-0.6的β-环糊精、对甲苯磺酰氯和氢氧化钠充分混合，在冰浴下反应5-10小时，然后过滤，调节pH至中性，洗涤，干燥，即得苯甲酰化的β-环糊精；
在苯甲酰化的β-环糊精中，加入乙二胺，每克苯甲酰化的β-环糊精所需乙二胺剂量为5-8mL，在75℃水浴中搅拌反应4小时；再向上述反应液逐滴加入到冷丙酮中，立即生成白色沉淀，减压过滤，将白色沉淀重新溶解于水/甲醇体积比为3:1的混合溶液中，过滤得到淡黄色澄清液体；将淡黄色澄清滤液缓慢倒入丙酮中，减压过滤收集白色沉淀；洗涤产物，干燥即得到β-环糊精衍生物；
b.烯基硅胶的制备
将硅胶分散于无水甲苯中，每克硅胶所需无水甲苯剂量为10-50mL，再加入带双键的硅烷化试剂3-（甲基丙烯酰氧基）丙基-三甲氧基硅烷，每克硅胶所需硅烷化试剂剂量为0.5-1.5mL，在氮气保护下，搅拌回流24小时，然后用沙芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷，丙酮，甲醇洗涤，然后在真空干燥箱中于40-60℃干燥12-24小时，即得烯基硅胶；
c.温度响应聚合物在硅胶表面的形成
将烯基硅胶分散于1，4-二氧六环或甲苯溶剂中，每克烯基硅胶所需溶剂剂量为10-50mL，再加入N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油醚两种具有温度响应能力的聚合物单体，两种单体质量比为2-4:1，烯基硅胶与聚合物单体质量比为1：0.2-1，最后加入偶氮二异丁腈引发剂，偶氮二异丁腈引发剂用量为聚合物单体质量的0.5-1.0%；在氮气保护下，于70-80℃反应10-20小时，依次用1，4-二氧六环，丙酮，二氯甲烷，甲醇洗涤，然后在真空干燥箱中于40-60℃干燥12-24小时，即得温度响应聚合物包裹的硅胶；
d.β-环糊精衍生物植入聚合物链
将温度响应聚合物包裹的硅胶分散于甲苯中,每克硅胶所需甲苯剂量为10-50mL，再加入β-环糊精衍生物，其用量为硅胶质量的100%，在60-90℃下反应5-10小时，即得温度响应型β-环糊精硅胶固定相。
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