CN106669637A - 一种亲水性聚合物固定相及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种亲水性聚合物固定相，该固定相中含有特征的硫醚连接基团，其结构式如下：其中Silica为硅胶，n＝1-100的整数，R₁为H或CH₃，X-R₂是带有亲水性基团的侧链。本发明还提供了上述亲水性固定相的制备方法。该方法的特征是使用巯基-烯烃聚合反应，并加入RAFT试剂控制聚合反应速率，制备得到亲水性聚合物键合硅胶固定相。该方法在聚合过程中通过RAFT试剂对聚合反应速率加以控制，反应条件温和，制备得到的聚合物固定相分子量可控且分布范围窄，键合密度均匀。本发明提供的亲水性聚合物固定相可作为分离材料，广泛用于糖类、蛋白质、多肽、核苷，氨基糖苷化合物的选择性富集与分离。

Description

一种亲水性聚合物固定相及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及硅胶基质分离材料，具体的说是亲水性聚合物固定相及其制备方法和应用。

背景技术

亲水作用色谱法(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC)是一种用于分离极性化合物的色谱技术，最早是由Alpert于1990年提出的(Alpert,A.J.et al,J.Chromatogr.1990.499,177-196.)。作为RPLC的有效补充，HILIC模式近年来得到广泛的应用，其中亲水性固定相种类也越来越丰富[Guo,Y.et al.,J.Chromatogr.A,2005,1074,71-80；Jandera,P.et al.,J.Sep.Sci,2008,31,1421-1437；P.et al.,J.Sep.Sci,2006,29,1784-1821；Buszewski,B.et al.,Anal.Bioanal.Chem,2012,402,231-247.]。尽管如此，小分子亲水固定相的开发逐步遭遇瓶颈。受到硅胶本身比表面积和键合效率的制约，小分子键合相的官能团数量有限，亲水性已经很难大幅提升。因此，发展亲水性聚合物键合相，通过增加聚合物链的长度和改变聚合物链的组成，提高分离材料的亲水性和分离选择性，可以突破亲水性固定相的发展瓶颈。

聚合反应和聚合物在硅胶表面的固载是发展亲水性聚合物键合相的关键和基础。目前，主要通过两种方式将聚合物固载到固体表面：“grafting to”技术和“grafting from”技术[Barbey,R.et al.,Chem.Rev,2009,109,5437-5527.]。其中“grafting to”技术由于聚合物链预先在溶液中合成，键合到固体表面时会受到空间位阻的影响，导致聚合物的键合密度不高。“grafting from”技术，由于溶液中的单体体积小，易扩散到固体表面发生链增长反应，得到的聚合物的键合密度高，但是固体表面的聚合反应不易控制，得到的聚合物的分子量分布较宽。RAFT试剂[Moad,G.et al,Aust.J.Chem,2012,65,985-1076]是一种链转移试剂，在聚合反应过程中，能够与链增长自由基发生一系列的可逆加成-断裂的平衡反应，使聚合反应变得可控。将巯基通过硅烷化反应键合到硅胶表面，经引发后发生表面聚合反应，同时在反应液中加入RAFT试剂加以控制，可以得到分子量可控且分布范围窄，键合密度均匀的亲水性聚合物固定相。当前，尚未出现使用此方法制备亲水性聚合物固定相的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种亲水性聚合物固定相及其制备方法和应用。该固定相中含有特征的硫醚连接基团，其结构式如下：

其中Silica为硅胶；n＝1-100的整数；

-R₁＝-H或-CH₃；

本发明还提供了上述固定相的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a.硅胶预处理：硅胶加入质量浓度为1％～38％的盐酸或硝酸溶液中，加热至回流，搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，于80～160℃下干燥至恒重；

b.硅胶表面引入巯基：将步骤a所得干燥硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在氮气氛围下加入有机溶剂搅拌，滴加硅烷偶联剂，保持温度为60～140℃条件下搅拌2～48小时。反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，固体产品在60～90℃条件下干燥6-24小时即得3-巯基丙基硅胶；

所述制备方法步骤b所用的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种；每克硅胶所需有机溶剂的量为5-30mL；

所述制备方法步骤b所用硅烷偶联剂有如下结构：

其中，X为-OCH₃或-OCH₂CH₃。

所述制备方法步骤b中硅烷偶联剂的使用量为每克硅胶使用0.1mL-2mL；

c.巯基-烯烃“可控”聚合反应制备聚合物固定相：将步骤b所得的3-巯基丙基硅胶中加入体积比为1/10～10/1的水/有机溶剂混合溶剂中，每克3-巯基丙基硅胶所需混合溶剂量为5-50mL，再加入引发剂，RAFT试剂和单体，搅拌使其完全溶解。体系经抽真空-通氮气，循环三次除氧后在40～70℃条件下反应10～100小时。过滤，依次用水，甲醇洗涤，所得固体于60～90℃条件下干燥6～48小时，即得聚合物固定相；

所述制备方法步骤c所用有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺等能与水互溶的有机溶剂中的一种；

所述制备方法步骤c所用单体为

等中的一种或几种；

所述步骤c所用单体使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用1～100mmol；

所述制备方法步骤c所用的引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈；

所述制备方法步骤c中引发剂使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用0.01～10mmol；

所述制备方法步骤c中RAFT试剂为4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸等二硫代酯或者4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸等三硫代碳酸酯中的一种，其结构式如下：

RAFT试剂：

其中

优选为4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸或4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸。

所述制备方法步骤c中RAFT试剂使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用0.01～20mmol。

使用本发明提供的方法制得的固定相可作为分离材料，广泛用于糖类、蛋白质、多肽、核苷，氨基糖苷化合物以及碱性化合物莱克多巴胺，石杉碱甲，普萘洛尔，地昔帕明，阿米替林的选择性富集与分离。

本发明具有如下优点：

1.聚合反应可控。在自由基聚合中加入RAFT试剂加以控制，得到的聚合物分子量可控，分布范围窄。

2.固定相结构新颖。该固定相为聚合物固定相，通过增加聚合物链的长度和改变聚合物链的组成，能够提高分离材料的亲水性；通过不同官能团的单体共聚或者嵌段，能够得到多功能键合相，提高分离选择性。

3.应用范围广。本发明提供的亲水性聚合物键合固定相适合用于核苷、糖类、多肽、蛋白质等的分离分析和分离制备。

4.制备过程简单可靠，有利于实现产业化。

附图说明：

图1为实施例1中制得的固定相对核苷分离分析结果图；

图2为实施例1中制得的固定相对多肽分离分析结果图；

图3为实施例1中制得的固定相对氨基糖苷分离分析结果图；

图4为实施例6中制得的固定相对糖异构体分离分析结果图；

图5为实施例2中制得的固定相对碱性化合物分离分析结果图。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二异丁腈，然后加入甲醇和水各40mL。体系除氧后，在65℃条件下搅拌48小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺固定相。

实施例2

使用丙烯酸代替实施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例1，按实施例1的合成步骤可得聚丙烯酸固定相。

实施例3

使用丙烯酸羟乙酯代替实施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例1，按实施例1的合成步骤可得聚丙烯酸羟乙酯固定相。

实施例4

使用乙烯基咪唑代替实施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例1，按实施例1的合成步骤可得聚乙烯基咪唑固定相。

实施例5

使用乙烯基吡咯烷酮代替实施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例1，按实施例1的合成步骤可得聚乙烯基吡咯烷酮固定相。

实施例6

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于500mL三口玻璃瓶中，加入33.40g丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二异丁腈，然后加入甲醇和水各50mL，抽真空-通氮气，循环三次。体系除氧后在70℃条件下搅拌48小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯固定相。

实施例7

使用丙烯酰胺二甲基丙基羧酸胺乙酯代替实施6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例6，按实施例6的合成步骤可得聚基丙烯酸二甲基丙基羧酸胺乙酯固定相。

实施例8

使用烯基麦芽糖代替实施例6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例6，按实施例6的合成步骤可得聚烯基麦芽糖固定相。

实施例9

使用烯基环糊精代替实施例6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例6，按实施例6的合成步骤可得聚烯基环糊精固定相。

实施例10

使用寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯代替实施例6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步骤以及反应条件均同实施例6，按实施例6的合成步骤可得聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯固定相。

实施例11

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.34g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二异丁腈，然后加入经脱氧气处理的甲醇和水各40mL。体系除氧后在60℃条件下搅拌24小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺固定相。

实施例12

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.33g偶氮二异丁腈，然后加入经脱氧气处理的甲醇和水各40mL。体系除氧后在70℃条件下搅拌24小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺固定相。

实施例13

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积300m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于250mL三口玻璃瓶中，加入17.04g丙烯酰胺，0.34g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和1.32g偶氮二异丁腈，然后加入甲醇和水各80mL，抽真空-通氮气，循环三次。体系除氧后在65℃条件下搅拌72小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺固定相。

实施例14

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二异丁腈，然后加入甲醇20mL和水60mL。体系除氧后在65℃条件下搅拌24小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺固定相。

实施例15

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二异丁腈，然后加入DMF和水各40mL。体系除氧后在60℃条件下搅拌24小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺固定相。

实施例16

称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积150m²/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。

将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL巯丙基三乙氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得巯丙基硅胶。

将干燥后的巯丙基硅胶置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.25g 4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸和0.66g偶氮二异丁腈，然后加入甲醇和水各40mL。体系除氧后在65℃条件下搅拌24小时，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得聚丙烯酰胺固定相。

实施例17

使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于核苷分离分析。如图1所示，核苷得到很好的分离。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：A,100mM甲酸铵(pH＝3.2)；B,乙腈；C,水；梯度条件：0-20min,A/B/C＝10/90/0→A/B/C＝10/75/15

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测波长：260nm

实施例18

使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于多肽分离分析。如图2所示，多肽得到很好的分离。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：A,100mM磷酸二氢钠(pH＝3.0)；B,乙腈；C,水；梯度条件：0-5min,A/B/C＝5/75/20→A/B/C＝5/65/30；5-15min,A/B/C＝5/65/30→A/B/C＝5/40/55

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测波长：210nm

实施例19

使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于氨基糖苷分离分析。如图3所示，氨基糖苷得到很好的分离。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：A,100mM甲酸铵(pH＝3.2)；B,乙腈；C,水；梯度条件：0-20min,A/B/C＝10/70/20→A/B/C＝10/60/30

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测波长：ELS detector

实施例20

使用实施例6所得色谱固定相6装填4.6×150mm色谱柱，用于糖异构体分离分析。如图4所示，糖异构体得到很好的分离。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：80％ACN，20％H₂O

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测波长：ELS detector

实施例21

使用实施例2所得色谱固定相2装填4.6×150mm色谱柱，用于碱性化合物分离分析。如图5所示，碱性化合物得到很好的分离。色谱条件为：

色谱柱：4.6×150mm

流动相：A,200mM磷酸二氢钠(pH＝4.5)；B,乙腈；C,水；梯度条件：0-25min,A/B/C＝20/30/50→A/B/C＝50/30/20

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测波长：220nm。

Claims (9)

1.一种亲水性聚合物固定相，其特征在于：固定相中含有特征的硫醚连接基团，其结构式如下：

其中Silica为硅胶；n＝1-100的整数；

-R₁＝-H或-CH₃；

2.一种权利要求1所述亲水性聚合物固定相的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

a.硅胶预处理：硅胶加入质量浓度为1％～38％的盐酸或硝酸溶液中，加热至回流，搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，于80～160℃下干燥至恒重；

b.硅胶表面引入巯基：将步骤a所得干燥硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在氮气氛围下加入有机溶剂搅拌，滴加硅烷偶联剂，保持温度为60～140℃条件下搅拌2～48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇依次洗涤，过滤洗涤后的产品在60～90℃条件下干燥6-24小时即得3-巯基丙基硅胶；

c.巯基-烯烃“可控”聚合反应制备聚合物固定相：将步骤b所得的3-巯基丙基硅胶中加入体积比为1/10～10/1的水/有机溶剂混合溶剂中，每克3-巯基丙基硅胶所需混合溶剂量为5-50mL，再加入引发剂，RAFT试剂和单体，搅拌使其完全溶解；体系经抽真空-通氮气，循环三次除氧后，在40～70℃条件下反应10～100小时；过滤，依次用水，甲醇洗涤，所得洗涤后的产品于60～90℃条件下干燥6～48小时，即得聚合物固定相。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b所用的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲苯、N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺中的一种或二种以上；每克硅胶所需有机溶剂的量为5-30mL。

4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b所用硅烷偶联剂有如下结构：

其中，X为-OCH₃或-OCH₂CH₃；硅烷偶联剂的使用量为每克硅胶使用0.1mL-2mL。

5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤c所用有机溶剂为能与水互溶的有机溶剂；优选为甲醇、乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或二种以上；有机溶剂的量为每克3-巯基丙基硅胶使用5-50mL。

6.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤c所用单体为

中的一种或二种以上；所用单体的量为每克3-巯基丙基硅胶使用1～100mmol。

7.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤c所用的引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈；引发剂使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用0.01～10mmol。

8.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤c中RAFT试剂其结构式如下：

RAFT试剂：

其中

优选为4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸或4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸；RAFT试剂使用量为每克3-巯基丙基硅胶使用0.01～20mmol。

9.一种权利要求1所述的亲水性聚合物固定相作为分离材料，在糖类、蛋白质、多肽、核苷，氨基糖苷化合物以及碱性化合物莱克多巴胺，石杉碱甲，普萘洛尔，地昔帕明，阿米替林的选择性富集与分离中的应用。