CN102059105A

CN102059105A - 一种类寡肽手性固定相及其制备方法

Info

Publication number: CN102059105A
Application number: CN 201010572427
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 柯燕雄; 吴海波; 罗淼; 殷承华; 苏小兵
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: CN102059105B

Abstract

本发明一种类寡肽手性固定相及其制备方法：类寡肽手性固定相由手性选择剂、连接臂和载体组成，手性选择剂通过涂覆或硅烷偶联剂共价键连接的方式固载到载体表面；连接臂为共价键的连接臂；载体为硅胶及色谱用填料；其制备方法包括以下步骤：①制备2-氯-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺；②制备2-(S-1-苯乙胺基)-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺；③制备仲胺化合物；④制备含三个手性单元的手性单体；⑤手性固定相CSP的制备；其积极效果是：制得的类寡肽手性固定相具有很好的稳定性能，具有应用于手性分析、质量控制和生产制备对映异构体的潜力，整个反应路线产率高，易操作，便于工业化应用。

Description

一种类寡肽手性固定相及其制备方法

技术领域

本发明涉及化学中的手性固定相技术领域，具体地说，是一种类寡肽手性固定相及制备方法。

背景技术

手性是自然界普遍存在的现象。手性物质的对映体之间有许多相同的理化性质，如熔点、溶解度、发生相同类型的化学反应等等。但是，也有一些理化性同有极大的差异，如旋光性、气味、与手性物质相互作用产生不同的产物，特别是许多与生物体密切相关的生化反应均与物质的手性相关联，是因为生命活动的生化反应与有机物的手性具有相关性。手性化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在着显著的差异。广泛应用于农业的手性除草剂、杀虫剂和植物生长调节剂也同样表现出强烈的生物识别作用。因为作为生命活动重要基础的生物大分子，如蛋白质、多糖、核酸和酶等几乎全是手性的。美国食品与药品管理局(FDA)于1992年发布了手性药物指导原则，它要求所有在美国上市的消旋体类新药，生产者都必须提供报告，说明药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。基于以上原因，获得对映纯的化合物对于化学、生物或是药学的应用目的是非常必要的。

手性物质的分离对人类的重大意义是绝对不可忽视的。拆分对映体常用的方法有化学法、酶法和色谱法。相对于前两者，色谱法因具有回收率和选择性高、重复性好、操作简单、成本较低等优点而被人们广泛接受。目前使用最为广泛、有效的手性分离方法为高效液相手性色谱法，其分离光学异构体的方法又分为间接的手性试剂衍生化法和直接的手性流动相添加剂法与手性固定相法，其中，后者的手性固定相法由于直接、快速、有效、简便、容量大的优点，更适合于制备级色谱。

由于蛋白质手性固定相作为一类重要的手性固定相具有较高的手性选择性，含有肽键的Pirkle型小分子手性固定相的制备引起了人们的极大关注。2005年，Tingyu Li课题组首次将多个L-脯氨酸分子通过肽键相互连接并对末端氨基加以保护，然后键合到功能化的硅胶表面，从而制成了一种新型的脯氨肽手性固定相。此类手性固定相的手性选择剂由于具有螺旋的二级结构，因而具有广泛、较高的手性分离能力。再经过一系列的优化，该固定相的手性分离能力甚至要比一些商品化的手性固定相还要好。2005年之后，又有人以其他手性氨基酸为手性源，采用类似的方法制成了一些氨基酸肽手性固定相，同样也都具有一定的手性识别能力。

近二十年来，一种N-取代的甘肽（又叫“类肽”化合物），常作为多肽与蛋白质的仿体用于生物与制药领域，但在手性固定相上的应用尚为空白。当N上取代基为α-手性基团时，该种“类肽”化合物被证明具有螺旋的二级结构。考虑到具有螺旋结构的寡肽可以用作很好的手性选择剂，所以，本发明采用新的方法合成了N上取代基为S-苯乙基的“类肽”化合物，并成功地将其用作手性固定相的手性选择剂，制成一种新型的类寡肽手性固定相。

发明内容

本发明的目的在于在上述现有研究的基础上，通过化学合成的方法将若干个胺单元相互连接起来并键合到载体表面，提供一种目前没有的类寡肽手性固定相；本发明的第二目的是，提供所述类寡肽手性固定相的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种类寡肽手性固定相，其特征是，由手性选择剂、连接臂和载体组成，所述的手性选择剂或是具有结构通式（Ⅰ）的化合物，或是由胺化合物桥连一起制成的类寡肽化合物，通过涂覆或（硅烷偶联剂）共价键连接的方式固载到载体表面；所述的连接臂为共价键的连接臂；所述的载体为硅胶及色谱用填料；

——所述的结构通式（Ⅰ）为：

式中：

n为1～10的任一整数；

R₁、R₂、R₃为氢、脂肪烷烃基、环烷烃基、含有取代基或不含取代基的芳基、芳烷基、萘基、蒽基，或为-CONR、-COOR，R为氢或脂肪烷烃基；

R₁、R₂所连的碳与R₃所连的碳必须至少有一个为手性碳；

R₁/R/R₃还有一个或更多的手性中心。

所述的类寡肽化合物是首先由桥连试剂与胺制成的酰胺化合物，然后再与另一分子胺发生取代反应制成仲胺化合物，其中桥连试剂的结构如通式(Ⅱ)所示：

式中：

X为OH、Cl或Br中的任何一种；

Y为Cl、Br或I中的任何一种；

R₃为氢、脂肪烷烃基、环烷烃基、含有取代基或不含取代基的芳基、芳烷基、萘基、蒽基的任何一种。

所述的连接臂为三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷。

所述的载体包括色谱用球形、无定形硅胶以及有机无机杂化硅胶。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种类寡肽手性固定相的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）制备2-氯-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺

将(S)-1-苯乙胺、0.5～1.0倍当量无水碳酸钠溶于水与丙酮的混合溶剂中，冰水浴下滴加1～1.5倍当量的氯代乙酰氯的丙酮溶液；反应结束后，蒸除溶剂，残留物用稀盐酸溶液酸化后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂获得白色固体的酰胺产物2-氯-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺；

（2）制备2-(S-1-苯乙胺基)-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺

将步骤（1）获得的2-氯-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺溶于无水乙醇中，加入1～1.5倍当量的(S)-1-苯乙胺和0.5～1.0倍当量的K₂CO₃进行回流反应8～15小时；反应结束后蒸除溶剂，加水并用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂获得仲胺产物粗产品，经色谱柱分离获得纯产品；

（3）制备仲胺化合物

以步骤（2）得到的仲胺产物为原料，按需要重复步骤（1）和步骤（2）的操作若干次，获得含不同手性单元个数的仲胺化合物；

（4）制备含多个手性单元的手性单体

将步骤（3）获得的仲胺化合物溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷，室温下反应过夜，旋干，用硅胶色谱柱分离得手性硅烷化单体；

（5）手性固定相CSP的制备

将步骤（4）获得的手性硅烷化单体与硅胶加入烧瓶中，在甲苯溶液中加热回流反应48～72小时；将获得的硅胶进行过滤，以甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、丙酮依次洗涤，于50～60℃条件下真空干燥过夜，制成类寡肽手性固定相；

类寡肽手性固定相的化学合成路线为：

。

步骤（4）所述的三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷的加入量为仲胺化合物的1.5～3.0倍量，在无水无氧条件下操作；其中，反应过程中过量的三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷通过硅胶柱除去，以得到纯度较高的手性硅烷单体。

步骤（5）所述的硅胶为表面含有硅羟基的活化硅胶。

所述的硅胶以2.5～3.0M的盐酸水溶液为活化剂，活化时间为5～8个小时。

本发明的积极效果是：

（1）首次制备出了由若干手性苯乙胺桥连一起的类寡肽化合物作为手性选择剂，由三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷作为连接臂的适合高效液相色谱用的手性色谱填料；

（2）不同色谱模式的评价表明，制备的固定相具有良好的手性色谱能力，对联萘酚衍生物具有较高的手性识别能力，同时，对3-取代吲哚-2-酮、苯乙醇、氨基酸等一些衍生物也具有一定的手性分离能力，且该类手性固定的手性分离能力与手性选择剂所含手性中心的个数密切相关，最佳手性中心的个数为5或6个；

（3）制得的类寡肽手性固定相具有很好的稳定性能，具有应用于手性分析、质量控制和生产制备对映异构体的潜力，并且整个反应路线产率高，易操作，便于工业化应用。

附图说明

附图1为联萘酚在固定相CSP1-CSP5上的分离效果对比图；

附图2为甲磺酸联萘酚酯在CSP4固定相上的拆分谱图；

附图3为O,O’-二苯基氨基甲酰基联萘酚在CSP4固定相上的拆分谱图；

各附图中，横坐标为出峰时间，单位为分钟。

具体实施方式

以下提供本发明一种新型类寡肽手性固定相的制备方法的具体实施方式，提供5个实施例和一个应用实施例。但是，需要说明的是，本发明的实施不限于以下的实施例。

实施例1

一种类寡肽手性固定相的制备，其具体的制备步骤为：

（1）制备2-氯-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺

在250ml单口反应烧瓶中加入9.68g (S)-1-苯乙胺和4.24g无水碳酸钠，用50mL丙酮和50mL水进行溶解；于冰水浴下将反应液冷却至0℃，在搅拌状态下缓慢滴加9.04g氯乙酰氯的丙酮溶液20mL，约1小时后反应完成；减压蒸除溶剂，残留物用6M HCl酸化后用乙酸乙酯萃取，将无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得到14.0g白色固体产物，收率为89%；¹HNMR (CDCl₃): δ1.54 (d, 3H), 4.06-4.09 (m, 2H), 5.14 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 7.31-7.36 (m, 5H).

（2）制备2-(S-1-苯乙胺基)-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺

称取13.9g步骤（1）的产物和8.5g (S)-1-苯乙胺溶于100ml无水乙醇中，加入4.86g碳酸钾，80℃温度下回流8小时，减压蒸除溶剂后加水，用乙酸乙酯萃取，将无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到粗产品，再经色谱柱分离后得到15.9g纯产品，收率为80%；¹HNMR (CDCl₃): δ1.36 (d, 3H), 1.43 (d, 3H), 1.52 (m, 1H), 3.18 (m, 2H), 3.72 (q, 1H), 5.10 (m, 1H), 7.27-7.35 (m, 10H), 7.42 (d, 1H).

（3）制备仲胺化合物1

以步骤（2）的产物为原料，重复步骤（1）和步骤（2）的操作，可制得含三个手性单元的仲胺化合物1，两步的总收率为75%；

（4）制备含三个手性单元的手性单体6

将步骤（3）的产物仲胺化合物1（4.0g）溶于50ml无水二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷，室温下反应过夜，旋干，用硅胶色谱柱分离获得5.3g手性硅烷化单体6，收率为85%；

（5）手性固定相CSP1的制备

将步骤（4）获得的手性硅烷化单体6与硅胶加入烧瓶中：称取4.0g活化好的5μ商品化硅胶（日本Fuji Silysia 化学公司产品)，干燥除水，氮气保护下加入新蒸甲苯40mL、手性单体硅烷化试剂2.76g，整个反应体系加热回流反应48小时；所得的硅胶用砂芯漏斗进行过滤，以甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、丙酮依次洗涤，于50℃真空干燥过夜，得4.6g 手性固定相CSP1；元素分析：C9.82，N1.59，H2.16%。以含氮量估算键合量约0.28mmol/g。

实施例2

一种类寡肽手性固定相的制备，其具体的制备步骤为：

（1）和（2）同实施例1；

（3）以仲胺化合物1为原料重复步骤（1）与步骤（2）制得含四个手性单元的仲胺化合物2；

（4）将步骤（3）的产物仲胺化合物2 按实施例1步骤（4）的方法获得手性硅烷化单体7；

（5）将步骤（4）获得的手性硅烷化单体7按实施例1步骤（5）的方法获得手性固定相CSP2；元素分析：C11.32，N1.64，H1.96%。以含氮量估算键合量约0.23mmol/g。

实施例3

一种类寡肽手性固定相的制备，其具体的制备步骤为：

（1）和（2）同实施例1；

（3）以仲胺化合物2为原料重复步骤（1）与步骤（2）制得含四个手性单元的仲胺化合物3；

（4）将步骤（3）的产物仲胺化合物3 按实施例1步骤（4）的方法获得手性硅烷化单体8；

（5）将步骤（4）获得的手性硅烷化单体8按实施例1步骤（5）的方法获得手性固定相CSP3；元素分析：C13.35，N1.82，H2.52%。以含氮量估算键合量约0.21mmol/g。

实施例4

一种类寡肽手性固定相的制备，其具体的制备步骤为：

（1）和（2）同实施例1；

（3）以仲胺化合物3为原料重复步骤（1）与步骤（2）制得含四个手性单元的仲胺化合物4；

（4）将步骤（3）的产物仲胺化合物4 按实施例1步骤（4）的方法获得手性硅烷化单体9；

（5）将步骤（4）获得的手性硅烷化单体9按实施例1步骤（5）的方法获得手性固定相CSP4；元素分析：C13.33，N1.77，H2.0%。以含氮量估算键合量约0.18mmol/g。

实施例5

一种类寡肽手性固定相的制备，其具体的制备步骤为：

（1）和（2）同实施例1；

（3）以仲胺化合物4为原料重复步骤（1）与步骤（2）制得含四个手性单元的仲胺化合物5；

（4）将步骤（3）的产物仲胺化合物5 按实施例1步骤（4）的方法获得手性硅烷化单体10；

（5）将步骤（4）获得的手性硅烷化单体10按实施例1步骤（5）的方法获得手性固定相CSP5；元素分析：C11.32，N1.41，H2.21%。以含氮量估算键合量约0.13mmol/g。

应用实施例

将实施例1-5中所制得的（硅胶材料）手性固定相CSP1～CSP5分别溶于适量的溶剂中，超声匀浆化，使用HPLC匀浆填充机将其填压至不锈钢的HPLC空柱中（4.6mm×150mm）：于正相模式下，正己烷/异丙醇=9/1（V：V）作流动相，流速为0.8ml/min, 检测波长为220nm, 进样量为1μL，以消旋化合物 1′作分析底物，分别对此5种手性固定相进行手性分离评价，在同样的色谱操作条件下，再以CSP4作为固定相，对消旋底物2′-5′进行手性分离。k′₁ = (t₁-t₀)/t₀； k′₂= (t₂-t₀)/t₀；α = k′₂/k′₁，其中，t₁和t₂分明是对映异构体的出峰时间，t₀是死时间，以甲苯来测试死时间（参见附图1-3）。

消旋分析底物1′-5′的结构如下：

以联萘酚1′作分析底物，对5种手性固定相的评价结果如下：

（1）CSP1，保留因子（k′₁）: 6.51；选择因子（α）:1.09；

（2）CSP2，保留因子（k′₁）: 6.67；选择因子（α）:1.35；

（3）CSP3，保留因子（k′₁）: 9.65；选择因子（α）:1.94；

（4）CSP4，保留因子（k′₁）:11.12；选择因子（α）:1.90；

（5）CSP5，保留因子（k′₁）: 6.28；选择因子（α）:1.71；

CSP1-CSP5对分析物1′的分离效果对比见附图1。

以CSP4作固定相，对消旋底物2′-5′的分离结果如下：

（1）分析物2′，保留因子（k′₁）: 11.44；选择因子（α）:1.90；

（2）分析物3′，保留因子（k′₁）: 11.64；选择因子（α）:1.99；

（3）分析物4′，保留因子（k′₁）: 4.32；选择因子（α）:1.34；

（4）分析物5′，保留因子（k′₁）: 2.39；选择因子（α）:1.08；

其中，CSP4对分析物2′、3′的分离效果分别见附图2和3。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims

1.一种类寡肽手性固定相，其特征在于，由手性选择剂、连接臂和载体组成，所述的手性选择剂或是具有结构通式（Ⅰ）的化合物，或是由胺化合物桥连一起制成的类寡肽化合物，通过涂覆或（硅烷偶联剂）共价键连接的方式固载到载体表面；所述的连接臂为共价键的连接臂；所述的载体为硅胶及色谱用填料；

——所述的结构通式（Ⅰ）为：

式中：

n为1～10的任一整数；

R₁、R₂所连的碳与R₃所连的碳必须至少有一个为手性碳；

R₁/R/R₃还有一个或更多的手性中心。

2.根据权利要求1所述的一种类寡肽手性固定相，其特征在于，所述的类寡肽化合物是首先由桥连试剂与胺制成的酰胺化合物，然后再与另一分子胺发生取代反应制成仲胺化合物，其中桥连试剂的结构如通式(Ⅱ)所示：

式中：

X为OH、Cl或Br中的任何一种；

Y为Cl、Br或I中的任何一种；

3.根据权利要求1所述的一种类寡肽手性固定相，其特征在于，所述的连接臂为三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷。

4.根据权利要求1所述的一种类寡肽手性固定相，其特征在于，所述的载体包括色谱用球形、无定形硅胶以及有机无机杂化硅胶。

5.如权利要求1所述的一种类寡肽手性固定相的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备2-氯-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺

（2）制备2-(S-1-苯乙胺基)-N-(S-1-苯乙基)乙酰胺

（3）制备仲胺化合物

（4）制备含多个手性单元的手性单体

（5）手性固定相CSP的制备

类寡肽手性固定相的化学合成路线为：

。

6.根据权利要求5所述的一种类寡肽手性固定相的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷的加入量为仲胺化合物的1.5～3.0倍量，在无水条件下操作；其中，反应过程中过量的三乙氧基(3-异氰酸酯基丙基)硅烷通过硅胶柱除去，以得到纯度较高的手性硅烷单体。

7.根据权利要求5所述的一种类寡肽手性固定相的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述的硅胶为表面含有硅羟基的活化硅胶。

8.根据权利要求7所述的一种类寡肽手性固定相的制备方法，其特征在于，所述的硅胶以2.5～3.0M的盐酸水溶液为活化剂，活化时间为5～8个小时。