CN104148037A - 一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法 - Google Patents

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杨丙成
吴胜杰
章飞芳
沈国滨
纪顺利
何成霞
梁鑫淼
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Abstract

本发明公开一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法，即用点击化学方法制备精氨酸键合型亲水固定相。该方法包括如下步骤：首先将硅胶炔基化，然后将叠氮化修饰后的精氨酸通过1,3-环加成反应键合到硅胶表面，即得精氨酸键合型亲水固定相。本发明所采用的点击化学键合方法，具有制备简单、选择性高、反应条件温和等优点。利用精氨酸和点击化学反应过程中产生的1,4-三唑环为强极性官能团在亲水模式下能够对极性化合物进行高效分离。

Description

一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法
技术领域
本发明涉及亲水色谱固定相制备技术，更具体地讲，涉及一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法。
背景技术
亲水色谱(HILIC)是近些年发展起来的一种色谱技术，主要用来分离一些亲水和极性较大的物质。相对于反相色谱(RPLC)，亲水色谱能够解决C18、C8等对糖、氨基酸、多肽等强极性物质保留弱甚至无保留的问题。亲水色谱用于分离极性化合物，如氨基酸、肽和糖等已有文献报道。固定相的选择对于亲水分离具有重要作用，目前亲水色谱固定相的类型主要有氨基、酰胺基、二醇基、糖类等。氨基酸是氨基(-NH2)和羧基(-COOH)直接连接在一个-CH-结构上的有机化合物。氨基酸固定相的报道有很多，通常的合成路线是：首先将γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷分子引入到硅胶表面，然后利用氨基酸分子自身带的氨基与γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷分子中的环氧基进行开环反应，实现将氨基酸引入到硅胶表面的目的。尽管该反应过程比较简单，但通常产率比较低(表现为键合量低)，而且还会引入副反应。
点击化学(Click chemistry)作为一种高效、高选择性的键合硅胶固定相的方法，得到越来越广泛的应用。其中Huisgen 1,3-偶极环加成反应在色谱固定相的合成上发挥了重要作用。其步骤是在催化剂的作用下末端炔基和叠氮化合物反应，选择性的生成1,4-三唑环，从而将所需官能团引入到硅胶表面。本发明是通过将氨基酸分子自身携带的氨基转化为点击化学中所需要的叠氮基，然后通过点击化学反应引入到硅胶基质上。本发明考虑到精氨酸分子结构含有胍基及羧基基团均为高亲水性基团，尤其是胍基，其pKa为12.48，在酸性、中性以及碱性条件下都带正电荷，并且能够形成多重氢键，可以提供多重作用机制。另外，点击化学反应过程中产生的三唑环也为一个碱性亲水性基团而有利于提高分离选择性。目前尚无类似的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种精氨酸键合型亲水色谱固定相。
本发明的第二个目的提供精氨酸键合型亲水色谱固定相的制备方法。
为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种精氨酸键合型亲水色谱固定相，其结构为：
精氨酸键合型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，使用点击化学将精氨酸键合到硅胶上，包括如下步骤：
(1)硅胶表面引入炔基
在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为1～5:1.2～5，在60～150℃的条件下反应8～24小时；然后加入活化硅胶；在60～100℃条件下继续反应12～48小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在40～80℃条件下干燥6～12小时，即得炔基硅胶衍生物；
(2)用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面
将步骤(1)所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为2/1～10/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物所需混合溶剂量20～50mL；向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在20～80℃的条件下反应24～72小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在40～80℃的真空干燥箱中干燥6～12小时，即得精氨酸亲水色谱固定相。
作为一个优选方案，步骤(1)中有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为5～30mL。
作为一个优选方案，步骤(1)中硅烷偶联剂的结构为：
作为一个优选方案，步骤(2)中修饰有叠氮基团的精氨酸的结构为：
修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为1～15。
作为一个优选方案，步骤(2)中所用的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，且上述催化剂的摩尔剂量分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为0.1～1和0.4～2。
本发明的优点在于：(1)采用精氨酸作为极性功能基团，其结构简单，应用范围广，能够在亲水模式下实现小分子酸、核苷和糖类等多种物质的良好分离；(2)采用精氨酸作为功能基团，其性质十分稳定，不容易与溶质分子发生反应；(3)采用点击化学将精氨酸键合到硅胶上，能够在温和的条件下实现高选择性和高转化率的固载；(4)利用精氨酸和点击化学反应过程中产生的1,4-三唑环为强极性官能团在亲水模式下能够对极性化合物进行高效分离。
附图说明
图1为本发明精氨酸色谱固定相的制备方法流程图。
图2为本发明炔基硅胶(a)和精氨酸色谱固定相(b)的红外谱图。
图3为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离小分子酸的色谱图。
图4为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离核苷和碱基的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
制备精氨酸亲水色谱固定相，图1为本发明精氨酸色谱固定相的制备方法流程图，包括如下步骤：
(1)硅胶表面引入炔基
在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为0.8，在85℃的条件下反应18小时；然后加入活化硅胶；在90℃条件下继续反应20小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在80℃条件下干燥10小时，即得炔基硅胶衍生物；
(2)用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面
将步骤(1)所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为5/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物所需混合溶剂量40mL；向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在25℃的条件下反应24小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在80℃的真空干燥箱中干燥10小时，即得精氨酸亲水色谱固定相。
步骤(1)采用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为10mL；步骤(1)采用的硅烷偶联剂的结构为：
其反应式为：
步骤(2)所用的修饰后具有叠氮基团的精氨酸的结构为：
其反应式为：
步骤(2)中采用的修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为10。
步骤(2)所用的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，催化剂的摩尔剂量分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为0.8和1.6。
图2为炔基硅胶(a)和精氨酸色谱固定相(b)的红外谱图。
下表为精氨酸色谱固定相和炔基硅胶的元素分析表
实施例2.
制备精氨酸亲水色谱固定相：
(1)硅胶表面引入炔基
在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为0.6，在100℃的条件下反应15小时；然后加入活化硅胶；在100℃条件下继续反应12小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在80℃条件下干燥10小时，即得炔基硅胶衍生物；
(2)用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面
将步骤(1)所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为5/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物所需混合溶剂量30mL；向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在25℃的条件下反应24小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在80℃的真空干燥箱中干燥10小时，即得精氨酸亲水色谱固定相。
步骤(1)采用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为8mL；步骤(1)采用的硅烷偶联剂的结构为：
步骤(2)所用的修饰后具有叠氮基团的精氨酸的结构为：
步骤(2)中采用的修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为8。
步骤(2)所用的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，催化剂的摩尔剂量分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为0.8和1.4。
实施例3
图3为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离小分子酸的色谱图。
图3的色谱条件为：流动相A为水，B为乙腈，C为甲酸铵(250mM甲酸铵，pH＝3.05)；2％A/90％B/8％C；检测波长：254nm；流速1ml/min；柱温30℃；图2中对应的峰分别为A：肉桂酸；B：苯甲酸；C：对羟基苯甲酸；D：乙酰水杨酸；E：2,5二羟基苯甲酸；F：邻苯二甲酸；分离结果显示这几种小分子酸在精氨酸色谱固定相得到基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征。
实施例4
图4为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离核苷和碱基的色谱图。
图4的色谱条件为：流动相B为乙腈，C为甲酸铵(250mM甲酸铵，pH＝3.05)；90％B/10％C；检测波长：254nm；流速1ml/min；柱温30℃；图3中对应的峰分别为：A：尿嘧啶；B：腺嘌呤；C：5-甲基尿苷；D：尿苷；E：胞嘧啶；分离结果显示这几种核苷和碱基在精氨酸色谱固定相得到了基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种精氨酸键合型亲水色谱固定相，其特征在于，其结构为：
2.权利要求1所述的精氨酸键合型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，使用点击化学将精氨酸键合到硅胶上，包括如下步骤：
(1)硅胶表面引入炔基
在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为1～5:1.2～5，在60～150℃的条件下反应8～24小时；然后加入活化硅胶；在60～100℃条件下继续反应12～48小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在40～80℃条件下干燥6～12小时，即得炔基硅胶衍生物；
(2)用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面
将步骤(1)所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为2/1～10/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物所需混合溶剂量20～50mL；向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在20～80℃的条件下反应24～72小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在40～80℃的真空干燥箱中干燥6～12小时，即得精氨酸亲水色谱固定相。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为5～30mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中硅烷偶联剂的结构为：
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中修饰有叠氮基团的精氨酸的结构为：
修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为1～15。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所用的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，且上述催化剂的摩尔剂量分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为0.1～1和0.4～2。
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