CN103613684B - 一种不同乙酰度的n-乙酰化壳六糖的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋化学工程技术，具体涉及一种不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖的分离纯化方法。首先制备全脱乙酰化壳六糖为原料，将其溶于甲醇/水溶液中，加入一定量的乙酸酐室温下进行乙酰化修饰得到N-乙酰化壳六糖混合物，然后将混合物用离子交换色谱柱CM？Sephadex？C-25或CM？Sepharose？Fast？Flow以0-2M浓度的NaCl溶液在pH3-6，流速为2-5mLmin-1的条件下进行分离纯化，收集洗脱液，将洗脱组分分别经活性碳萃取脱盐后浓缩，即得到不同乙酰度N-乙酰化壳六糖，本发明以全脱乙酰化壳六糖为原料，采用离子交换色谱分离得到六种不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖，具有流速快、分辨率高、产率高的特点，而且分离步骤少，只经过一步分离就能够得到不同乙酰度N-乙酰化壳六糖。
Description
技术领域
本发明属于海洋化学工程技术，具体涉及一种不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖的分离纯化方法。
背景技术
壳寡糖，又称低聚葡萄糖胺、低聚氨基葡萄糖，是一种由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成线性寡糖。壳寡糖被发现具有多种生理活性，如抗肿瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，调节血糖血脂，增强免疫力，活化肠道菌群等。目前，壳寡糖主要通过壳聚糖的酸解，氧化降解，或酶解三种技术得到。然而，这些技术制备的壳寡糖产物是一个非常复杂的混合物，其中含有各个分子量和各种乙酰度的壳寡糖。而大部分壳寡糖的生物活性都是采用这些混合物进行实验，这很难知道具体是哪个或哪些壳寡糖分子在生物活性试验中起作用。因此，为了进一步研究壳寡糖的生物活性，从壳寡糖混合物中分离得到带有准确脱乙酰度和窄聚合度的壳寡糖是十分必要的。
壳寡糖的生理活性受其聚合度和乙酰度的影响。已有报道部分乙酰化的壳寡糖比全脱乙酰化和全乙酰化的壳寡糖能够更好的诱导植物产生抗性反应。另外，壳寡糖的乙酰度决定了其单糖序列排布，影响其与蛋白相互作用的特异性。部分乙酰化单一聚合度壳寡糖制备与分离对于研究壳寡糖的活性机制具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖的分离纯化方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖的分离纯化方法，将全脱乙酰化壳六糖进行乙酰化后得到N-乙酰化壳六糖混合物，所得N-乙酰化壳六糖混合物溶解后用离子交换色谱柱以含0-2M浓度的NaCl的缓冲溶液，在pH3-6，2-5mLmin-1流速下进行分离纯化，以糖含量收集含有寡糖的不同组分的洗脱液，将不同组分的洗脱液分别经活性碳萃取脱盐后浓缩，即得到N-乙酰化壳六糖、N,N’-二乙酰化壳六糖、N,N’,N”-三乙酰化壳六糖、N,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖、N,N’,N’’,N’’’,N’’’’-五乙酰化壳六糖、N,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖。
所述离子交换色谱柱为CMSephadexC-25或CMSepharoseFastFlow。
所述N-乙酰化壳六糖、N,N’-二乙酰化壳六糖、N,N’,N”-三乙酰化壳六糖、N,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖、N,N’,N’’,N’’’,N’’’’-五乙酰化壳六糖、N,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖可能存在不同序列排布的同分异构体，以A和D分别代表N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，结构式如下所示：
N-乙酰氨基葡萄糖（A）：
氨基葡萄糖（D）：
六种N-乙酰化壳六糖糖链以β-1，4糖苷键连接，其结构序列如下所示：
N-乙酰壳六糖：
ADDDDD、DADDDD、DDADDD、DDDADD、DDDDAD或DDDDDA；
N,N’-二乙酰化壳六糖：
AADDDD、ADADDD、ADDADD、ADDDAD、ADDDDA、DAADDD、DADADD、DADDAD、DADDDA、DDAADD、DDADAD、DDADDA、DDDAAD、DDDADA或DDDDAA；
N,N’,N”-三乙酰化壳六糖：
AAADDD、AADADD、AADDAD、AADDDA、ADAADD、ADADAD、ADADDA、ADDAAD、ADDADA、ADDDAA、DDDAAA、DDADAA、DDAADA、DDAAAD、DADDAA、DADADA、DADAAD、DAADDA、DAADAD或DAAADD；
N,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖：
DDAAAA、DADAAA、DAADAA、DAAADA、DAAAAD、ADDAAA、ADADAA、ADAADA、ADAAAD、AADDAA、AADADA、AADAAD、AAADDA、AAADAD或AAAADD；
N,N’,N”,N”’,N””-五乙酰化壳六糖：
DAAAAA、ADAAAA、AADAAA、AAADAA、AAAADA或AAAAAD；
N,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖:
AAAAAA。
所述将全脱乙酰化壳六糖进行乙酰化后得到N-乙酰化壳六糖混合物具体为：将全脱乙酰化壳六糖加入到过量的甲醇与水（甲醇与水按体积比1:1的比例混合）混合液中，混匀后再加入乙酸酐在室温下反应15-240min，反应后收集反应液冷冻干燥得到固体N-乙酰化壳六糖混合物，待用；其中，全脱乙酰化壳六糖与乙酸酐的质量体积比为1:0.1-1.5。
所述N-乙酰化壳六糖混合物于pH=3-6的酸性溶液中溶解，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，待用。
本发明的优点
1.本发明采用甲醇/水为反应体系，使得进行的乙酰化反应具有选择性，通过红外光谱检测发现，乙酰化反应发生在2位氨基上，而没有检测到羟基乙酰化副产物。
2.本发明以全脱乙酰化壳六糖为原料，采用离子交换色谱分离得到六种不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖，具有流速快、分辨率高、产率高的特点，而且分离步骤少，只经过一步分离就能够得到N-乙酰化壳六糖、N,N’-二乙酰化壳六糖、N,N’,N”-三乙酰化壳六糖、N,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖、N,N’,N”,N”’,N””-五乙酰化壳六糖、N,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖；进而为单一聚合度部分乙酰化壳寡糖单体系列的制备提供了一个很好的途径，这对壳寡糖的进一步活性筛选及活性机制的阐明具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明实施例提供的全脱乙酰化壳六糖的红外光谱图。
图2为本发明实施例提供的制备N-乙酰化壳六糖混合物的红外光谱图。
图3为实施例提供的不同乙酰度N-乙酰化壳六糖的色谱洗脱曲线。
图4为本发明实施例提供的分离到的六种N-乙酰化壳六糖的质谱分析图谱，A为N-乙酰化壳六糖，B为N,N’-二乙酰化壳六糖、C为N,N’,N”-三乙酰化壳六糖、D为N,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖、E为N,N’,N”,N”’,N””-五乙酰化壳六糖、F为N,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖。
具体实施例
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
将400mg全脱乙酰化壳六糖（全脱乙酰化壳六糖的制备参见K.Li,R.Xing,S.Liu,R.Li,Y.Qin,X.Meng,P.Li,Separationofchito-oligomerswithseveraldegreesofpolymerizationandstudyoftheirantioxidantactivity,CarbohydratePolymers,88(2012)896-903.）溶于10ml体积比1:1的甲醇/水溶液中，再加入100μL乙酸酐，磁力搅拌，室温下反应4h后加水稀释，稀释后取部分N-乙酰化壳六糖混合物冷冻干燥，将干燥混合物进行红外分析如图2所示。与全脱乙酰化壳六糖（参见图1）相比，N-乙酰化后的化合物红外光谱变化主要在于1635cm,1556cm-1,1320cm-1波峰的出现，分别为酰胺Ⅰ，酰胺Ⅱ，酰胺Ⅲ谱带。这说明壳六糖N-乙酰化反应完成。另外，在N-乙酰化后的化合物红外光谱中没有出现1735cm-1谱带（-COO-吸收峰），说明乙酰化反应只发生在2位氨基上，而没有羟基乙酰化反应发生。
另一部分N-乙酰化壳六糖混合物用pH=5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解经0.45μm的微孔滤膜过滤后用离子交换色谱柱CMSephadexC-25用pH=5.0，含0MNaCl，pH=5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液冲洗色谱柱2-3个柱体积收集为组分1（Fraction1），之后采用含0-2M浓度的NaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=5.0），在3mL/min-1流速下连续梯度洗脱进行分离纯化，以多糖含量检测洗脱组分，收0-60min（Fraction2），150-240min（Fraction3），260-340min（Fraction4），360-480min（Fraction5），500-600min（Fraction6）的洗脱组分（参见图3），将上述各个洗脱组分溶液分别与10g活性炭混合搅拌1h，后抽滤再用50％的乙醇将吸附在活性炭上的寡糖洗脱下来，重复3次操作至脱盐完成，浓缩寡糖液，分别得到六个N-乙酰化壳六糖组分。质谱分析得到的六种组分，Fraction1-6分子量分别为1236.48Da，1194.49Da，1152.48Da,1110.48Da，1068.44Da，和1026.44Da，证明六种部分N-乙酰化壳六糖分别为N,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖（Fraction1）、N,N’,N”,N”’,N””-五乙酰化壳六糖（Fraction2）、N,N’,N’’,N’’’-四乙酰化壳六糖（Fraction3）、N,N’,N’’-三乙酰化壳六糖（Fraction4）、N,N’-二乙酰化壳六糖（Fraction5）和N-乙酰化壳六糖（Fraction6）。冷冻干燥后分别为8mgN,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖，14mgN,N’,N”,N”’,N””-五乙酰化壳六糖，35mgN,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖，70mgN,N’,N”-三乙酰化壳六糖，90mgN,N’-二乙酰化壳六糖和85mgN-乙酰化壳六糖。
实施例2
将400mg全脱乙酰化壳六糖溶于10ml体积比1:1的甲醇/水溶液中，加入350μL乙酸酐，磁力搅拌，室温下反应2h后加水稀释，冷冻干燥得N-乙酰化壳六糖混合物。将N-乙酰化壳六糖混合物用pH=4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解经0.45μm的微孔滤膜过滤后用离子交换色谱柱CMSepharoseFastFlow用pH=4.8，含0MNaCl，pH=4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液冲洗色谱柱2-3个柱体积收集为组分1（Fraction1），之后采用含0-1.2M浓度的NaCl醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH=4.8），在3mL/min-1流速下连续梯度洗脱进行分离纯化，以多糖含量检测洗脱组分，收集40-130min（Fraction2），150-200min（Fraction3），240-320min（Fraction4），330-380min（Fraction5），390-430min（Fraction6）的洗脱组分，将上述各个洗脱组分分别经活性碳萃取脱盐后浓缩，分别得到六个N-乙酰化壳六糖组分。质谱分析得到的六种组分，Fraction1-6分子量分别为1236.48Da，1194.49Da，1152.48Da,1110.48Da，1068.44Da，和1026.44Da，证明六种部分N-乙酰化壳六糖分别为N,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖（Fraction1）、N,N’,N”,N”’,N””-五乙酰化壳六糖（Fraction2）、N,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖（Fraction3）、N,N’,N”-三乙酰化壳六糖（Fraction4）、N,N’-二乙酰化壳六糖（Fraction5）和N-乙酰化壳六糖（Fraction6）。冷冻干燥后分别为24mgN,N’,N”,N”’,N””,N””’-六乙酰化壳六糖，73mgN,N’,N”,N”’,N””-五乙酰化壳六糖，97mgN,N’,N”,N”’-四乙酰化壳六糖，65mgN,N’,N”-三乙酰化壳六糖，25mgN,N’-二乙酰化壳六糖和10mgN-乙酰化壳六糖。
Claims (3)
1.一种不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖的分离纯化方法，其特征在于：将全脱乙酰化壳六糖进行乙酰化后得到N-乙酰化壳六糖混合物，所得N-乙酰化壳六糖混合物溶解后用离子交换色谱柱以含0-2M浓度的NaCl的缓冲溶液，在pH3-6，2-5mLmin-1流速下进行分离纯化，以糖含量收集含有寡糖的不同组分的洗脱液，将不同组分的洗脱液分别经活性炭萃取脱盐后浓缩，即得到N-乙酰化壳六糖、N，N′-二乙酰化壳六糖、N，N′，N′′-三乙酰化壳六糖、N，N′，N′′，N′′′-四乙酰化壳六糖、N，N′，N′′，N′′′，N′′′′-五乙酰化壳六糖、N，N′，N′′，N′′′，N′′′′，N′′′′′-六乙酰化壳六糖；
所述将全脱乙酰化壳六糖进行乙酰化后得到N-乙酰化壳六糖混合物具体为：将全脱乙酰化壳六糖加入到过量的甲醇与水混合液中，混匀后再加入乙酸酐在室温下反应15-240min，反应后收集反应液冷冻干燥得到固体N-乙酰化壳六糖混合物，待用；其中，全脱乙酰化壳六糖与乙酸酐的质量体积比为1∶0.1-1.5；
所述甲醇与水混合液中甲醇与水按体积比1∶1的比例混合。
2.按权利要求1所述的不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖的分离纯化方法，其特征在于：所述离子交换色谱柱为CMSephadexC-25或CMSepharoseFastFlow。
3.按权利要求1所述的不同乙酰度的N-乙酰化壳六糖的分离纯化方法，其特征在于：所述N-乙酰化壳六糖混合物于pH＝3-6的酸性溶液中溶解，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，待用。
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