CN106749110B - 一种采用还原剂制备岩藻黄醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用还原剂制备岩藻黄醇的方法，包括在加入还原剂的情况下，采用还原剂还原反应岩藻黄质生成岩藻黄醇，通过浓缩获得岩藻黄醇粗提物；将岩藻黄醇粗提物以流动相为溶媒，启动半制备/制备型高效液相色谱，进行分离纯化，获得岩藻黄醇纯化液，纯化液经减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于99％的岩藻黄醇。本法操作简单、收率高，适用于自动化控制制备高纯岩藻黄醇。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的制备方法，具体涉及一种高纯岩藻黄醇的制备方法，能够用于食品加工技术及功能保健领域。
背景技术
岩藻黄质(fucoxanthin)亦称褐藻黄素，是自可食用褐藻中，如裙带菜(翅藻科，Undaria pinnatifida)，海带(Laminaria japonica Aresch)中提取出来的天然类胡萝卜素，在其刚性全反式长链的两端分别有一个化学性质活泼的5，6-环氧非饱和丙二烯键结构，因而又异于其他类胡萝卜素分子，具有很强的生物活性。近年来它的多种生物学活性已被证实，一些潜在的活性也正在被科学家们积极探求之中，目前己成为当今海洋药物研究与开发的主攻热点之一。
岩藻黄醇是岩藻黄质脱去一个乙酰基的代谢产物，其结构与岩藻黄质的结构类似，具有很强的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、减肥等多种生物活性。近年来研究表明，小鼠口服岩藻黄质后可将其转化为岩藻黄醇而得到利用。Hayato Maeda等研究也发现3T3-L1细胞系中的岩藻黄质代谢产物岩藻黄醇可以通过减少PPARγ(过氧化物酶体增殖激活受体)从而达到抑制3T3-L1前成脂肪细胞系到脂肪细胞系分化的目的，从而达到减肥的效果。有研究表明，岩藻黄醇的体外抗肿瘤活性甚至强于岩藻黄质。目前国内仅少数几个厂家提取制备低含量岩藻黄质原料(HPLC法，含量＜1％)，出口欧美、日本等国家，目前国内外尚未见到岩藻黄醇批量制备研究的报道，不能对岩藻黄醇以及岩藻黄醇系列产品进行高值化开发应用，因此，有必要发明一种高纯岩藻黄醇的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以岩藻黄质为底物，通过还原反应制备岩藻黄醇得到岩藻黄醇粗提物的方法，还提供一种将岩藻黄醇粗提物再进行分离纯化获得高纯样品的方法。
本发明一方面涉及一种岩藻黄质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、以岩藻黄质或者含岩藻黄质的提取物为原料；
2)、将原料用溶剂溶解,加入一定比例还原剂还原反应得含有岩藻黄醇的反应液；
3)、将反应液浓缩至干，加水混悬，采用有机溶剂萃取，得到岩藻黄醇萃取液；
4)、将萃取液浓缩至干，加入流动相溶解，后采用半制备/制备型液相色谱制备分离得到制备液相纯化液；
5)将制备液相纯化液浓缩，后将浓缩液进行干燥，得到岩藻黄醇高纯单体。
优选地，步骤2)中所述的溶剂为有机溶剂，优选甲醇、乙醇、四氢呋喃。
优选地，步骤2)中所述还原剂为硼氢化钠、氢化铝锂、氯化亚锡、草酸、硼氢化钾、硫酸亚铁、亚硫酸钠等的一种或者几种组合；其中最优选硼氢化钠。
优选地，步骤2)中所述的原料与还原剂比例为50：1至1：1，可选自50:1，40:1，30:1，20:1,10:1，5:1，1:1。
优选地，步骤2)中所述的反应温度为20-50℃，可选自25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃；反应时间为0.5-48h，可选自0.5h、1h、2h、4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h、48h。
优选地，步骤3)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或者正丁醇。
优选地，步骤4)中所述的流动相为甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水三种体系溶剂以及该三种体系溶剂以任意比例混合的溶剂。
优选地，步骤4)为将萃取液浓缩至干，加入流动相溶解，转入半制备/制备型高效液相色谱进样瓶中，启动半制备/制备型高效液相色谱进行分离纯化，通过紫外在线检测信号触发馏分收集器自动收集岩藻黄醇纯化液
优选地，步骤4)所述半制备/制备型高效液相色谱采用的半制备/制备柱填料为C8柱或C18柱。
优选地，步骤4)所述半制备/制备型高效液相色谱采用的半制备/制备柱的直径为10-50mm。
优选地，步骤4)所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的进样量为100μL/次-20mL/次。
优选地，步骤4)所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的流动相流速为5-200mL/min，优选5、6、10、20、28、50、80、100、120、150、180、200mL/min。
优选地，步骤4)所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器，检测波长为400-500nm，优选450nm。
优选地，步骤5)所述减压浓缩温度为20-50℃，干燥方式为冷冻干燥。
优选地，步骤5)所述高纯岩藻黄醇，纯度大于99％。
附图说明
图1实施例1中岩藻黄醇制备色谱图
图2实施例1中岩藻黄醇纯度检测色谱图
图3实施例1所制备的岩藻黄醇的核磁共振氢谱图
图4实施例1所制备的岩藻黄醇的核磁共振碳谱图
具体实施方式
实施例1
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氢化钠10mg，于37℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液80mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇42.2mg，纯度99.53％。
实施例2
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氢化钠10mg，于40℃下反应4h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液100mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇40.3mg，纯度99.36％。
实施例3
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氢化钠10mg，于45℃下反应3h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液110mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇43.0mg，纯度99.45％。
实施例4
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用四氢呋喃30mL溶解，加入硼氢化钠10mg，于37℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液80mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇35.2mg，纯度99.53％。
实施例5
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氢化钠20mg，于30℃下反应10h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液50mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇42.7mg，纯度99.38％。
实施例6
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氢化钠10mg，于37℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积正丁醇萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液50mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇33.6mg，纯度99.15％。
实施例7
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入氢化铝锂10mg，于37℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液80mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇17.0mg，纯度99.26％。
实施例8
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硫酸亚铁10mg，于37℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液50mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇12.1mg，纯度99.25％。
实施例9
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入氯化亚锡10mg，于37℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液80mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇20.1mg，纯度99.30％。
实施例10
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入亚硫酸氢钠10mg，于37℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为90％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液80mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇18.3mg，纯度99.30％。
实施例11
1)还原反应：取岩藻黄质(纯度为99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入氢化铝锂50mg，于50℃下反应2h后，浓缩至近干，加入30mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用80％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C8柱(250mm×10mm)，流动相系统为80％甲醇水溶液，流动相流速为4mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：100μL；
通过运行半制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液80mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇15.6mg，纯度99.38％。
实施例12
1)还原反应：取岩藻黄质提取物(纯度为50％)200mg，用甲醇100mL溶解，加入硼氢化钠40mg，于50℃下反应2h后，浓缩至近干，加入100mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C18柱(250mm×10mm)，流动相系统为60％乙醇水溶液，流动相流速为6mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：300μL；
通过运行制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液160mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇83.4mg，纯度99.33％。
实施例13
1)还原反应：取岩藻黄质提取物(纯度为50％)200mg，用乙醇100mL溶解，加入氯化亚锡40mg，于50℃下反应2h后，浓缩至近干，加入1000mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％乙醇溶解；；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成20mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：制备色谱柱为C18柱(250mm×20mm)，流动相系统为90％乙醇水溶液，流动相流速为25mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：1200μL；
通过运行制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液1300mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇22.8mg，纯度99.19％。
实施例14
1)还原反应：取岩藻黄质提取物(纯度为50％)200mg，用甲醇100mL溶解，加入氢化铝锂40mg，于50℃下反应2h后，浓缩至近干，加入100mL的水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩至干，用90％甲醇溶解；
2)岩藻黄醇精制：
a)原料的配置：将岩藻黄醇粗品配置成6mg/mL的溶液；
b)仪器：半制备型高效液相色谱；
c)色谱条件：半制备色谱柱为C18柱(250mm×10mm)，流动相系统为60％乙醇水溶液，流动相流速为6mL/min，检测波长为450nm；
d)进样体积：300μL；
通过运行制备型高效液相色谱获得岩藻黄醇制备液160mL，在30℃下减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，即得岩藻黄醇25.2mg，纯度99.33％。
Claims (6)
1.一种采用还原剂制备岩藻黄醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、以岩藻黄质或者含岩藻黄质提取物为原料；
2)、将原料用溶剂溶解,加入一定比例还原剂还原反应得含有岩藻黄醇的反应液；还原剂为硼氢化钠、氢化铝锂、氯化亚锡、硫酸亚铁；所述的溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃；
3)、将反应液浓缩至干，加水混悬，采用有机溶剂萃取，得到岩藻黄醇萃取液；有机溶剂为乙酸乙酯；
4)、将萃取液浓缩至干，加入流动相溶解，后采用半制备/制备型液相色谱制备分离得到制备液相纯化液；
5)将制备液相纯化液浓缩，后将浓缩液进行干燥，得到岩藻黄醇高纯单体。
2.如权利要求1所述的采用还原剂制备岩藻黄醇的方法，其特征在于步骤2)中原料与还原剂的重量比为50：1至1：1。
3.如权利要求1所述的采用还原剂制备岩藻黄醇的方法，其特征在于步骤2)中所述的反应温度为20-50℃，反应时间为0.5-48h。
4.如权利要求1所述的采用还原剂制备岩藻黄醇的方法，其特征在于，步骤4)为将萃取液浓缩至干，加入流动相溶解，转入半制备/制备型高效液相色谱进样瓶中，启动半制备/制备型高效液相色谱进行分离纯化，通过紫外在线检测信号触发馏分收集器自动收集岩藻黄醇纯化液。
5.如权利要求1所述的采用还原剂制备岩藻黄醇的方法，其特征在于步骤5)中所述的浓缩为真空浓缩，干燥为冷冻干燥。
6.如权利要求1所述的采用还原剂制备岩藻黄醇的方法，其特征在于所述的半制备/制备型高效液相色谱采用的流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液中的一种，甲醇水溶液的体积百分比浓度为70-95％，乙醇水溶液的体积百分比为60-95％，乙腈水溶液的体积百分比为55-95％。
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| "Separation and identification of chlorophylls and carotenoids from Caulerpa prolifera，Jania rubens and Padina pavonica by reversed-phase high-performance liquid chromatography";Muhammad M. Hegazi et al.;《Journal of Chromatography A》;19981231;第829卷;第153-159页 |
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