JP2009033970A

JP2009033970A - フコキサンチノールの製造方法

Info

Publication number: JP2009033970A
Application number: JP2005340997A
Authority: JP
Inventors: Tokutake Sajima; 徳武佐島; Masafumi Hosokawa; 雅史細川; Kazuo Miyashita; 和夫宮下; Takanori Sasaki; 荘法佐々木
Original assignee: KYODO KUMIAI MARINTEKKU KAMAIS; KYODO KUMIAI MARINTEKKU KAMAISHI; Hokkaido University NUC
Current assignee: KYODO KUMIAI MARINTEKKU KAMAIS; KYODO KUMIAI MARINTEKKU KAMAISHI; Hokkaido University NUC
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2005-11-25
Publication date: 2009-02-19
Also published as: WO2007060811A1

Abstract

【課題】フコキサンチノールを短時間で且つ低コストで然も高収率で製造する、フコキサンチノールの製造方法を提供すること。
【解決手段】フコキサンチンと界面活性剤とを第一の有機溶媒に溶解させ、前記有機溶媒を蒸発させて前記フコキサンチンと前記界面活性剤を乾燥させた後、得られた乾燥物をpH緩衝溶液に溶解させ、リパーゼを前記乾燥物を溶解させた前記ｐＨ緩衝溶液に加え、所定の温度で所定の時間だけインキュベートして、未精製のフコキサンチノールを製造し、得られた未精製のフコキサンチノールを第二の有機溶媒に溶解し、クロマトグラフィにより展開することで精製したフコキサンチノールを得る。
【選択図】図１

Description

本願発明は、フコキサンチノールの製造方法に関するものである。更に、詳述すれば、本願発明は、酵素反応によってフコキサンチンからフコキサンチノールを短時間で且つ安価に然も高収率で得るためのフコキサンチノールの製造方法に関するものである。

フコキサンチン及びフコキサンチノールはβカロテン等と同じ基本骨格（図６参照）、即ち、共役二重結合鎖を持つカロテノイド（carotenoids）の一種で、様々な生理的機能を有することが報告されている。例えば、フコキサンチンの場合、抗肥満効果（非特許文献１）やガン細胞への高いアポトーシス誘導能（非特許文献２）を有することが見出されている。このようにフコキサンチンは高い生理的活性を持つが、フコキサンチンのアセチル基が水酸基に置き換わった化学構造を持つフコキサンチノールには、フコキサンチンよりも更に高い生理活性があることを、最近発明者等は見出した。

現在のところ学術論文において、次の３種類のフコキサンチノールの製造方法が報告されている。即ち、（１）フコキサンチンを餌とする海洋生物（例えば、ホヤなど）から有機溶媒を用いて抽出する方法（非特許文献３〜５）、（２）フコキサンチンをアルカリ加水分解することによって得られた反応物から単離・精製する方法（非特許文献３、６）、（３）加水分解酵素によるフコキサンチンの加水分解によって得られた反応物から単離・精製する方法（非特許文献７〜１０）である。

上記（１）の製造方法では、フコキサンチノールの大量生産という観点から、「フコキサンチノールを抽出する材料（海洋生物）の確保」と「同時に抽出される数種類のカロテノイドからの単離・精製の困難さ」の理由により、非効率的であると言える。例えば、非特許文献４によると、ホヤ科の中で最もフコキサンチノールを多く含有しているシロウスボヤ（学名：Didemnum moseleyi）の場合、７種類のカロテノイドが存在し、フコキサンチノールは１００ｇ当り１２．４ｍｇ存在している。つまり、１ｇ単位でフコキサンチノールを調製するには、抽出材料となるシロウスボヤを約８ｋｇ必要とし、抽出材料の安定的確保・保存・調達資金に難点がある。

次に上記（２）の製造方法の場合、フコキサンチノールを得るための操作は、上記（１）、（３）の製造方法と比較して非常に簡便であるが、収率が非常に悪い点に問題がある。例えば、非特許文献６によると、フコキサンチンを０．０１％水酸化カリウムのメタノール溶液に添加（水酸化カリウムとフコキサンチンのモル比＝２．２）すると、４０分後の各カロテノイドの成分比は、フコキサンチン（３３％）、フコキサンチノール（８％）、フコキサンチンヘミケタール（１１％）、フコキサンチノールヘミケタール（３％）、イソフコキサンチン（１７％）、イソフコキサンチノール（１４％）になると記載されている。これによれば、フコキサンチノールの収率は僅か８％である。

また、０．１％水酸化カリウムのメタノール溶液に添加（水酸化カリウムとフコキサンチンのモル比＝２４）すると、３５分後の各カロテノイドの成分比は、フコキサンチン（２０％）、フコキサンチノール（６％）、フコキサンチンヘミケタール（１０％）、フコキサンチノールヘミケタール（３％）、イソフコキサンチン（４％）、イソフコキサンチノール（７％）になると記載されている。即ち、フコキサンチノールの収率は僅か６％である。

非特許文献３に於いても、２００ｍｇのフコキサンチンから８ｍｇのフコキサンチノールしか得られていない。つまり、フコキサンチンのアルカリ加水分解では、原料となるフコキサンチンに対しての収率が１０％以下と非常に低収率である。従って、後述のフコキサンチノールの製造方法（３）と比較して、この製造方法（２）はフコキサンチノールの収率が１０％以下であるため、大量の製造方法には適していないと言える。

上記（３）の製造方法の場合、（１）と（２）の製造方法と比較して、高い収率でフコキサンチノールを合成できるが、コストや収率に於いて、従来報告されている製造方法では問題が残されている。

例えば、非特許文献７によると、微生物（学名：Pseudomonas fluorescens）由来のコレステロールエステラーゼ酵素を用いてフコキサンチンのアセチル基を加水分解してフコキサンチノールを合成している。

反応は次の３つの溶液Ａ、Ｂ、Ｃを混合することによって行われる。溶液Ａは、フコキサンチン溶液であって、濃度が０．３３μｇ／μＬになるように調製されたフコキサンチンのアセトン溶液１０μＬである。溶液Ｂは、コレステロールエステラーゼ酵素溶液であって、３７℃、ｐＨ＝７．０において活性度が２３００ユニット／ｇである微生物由来コレステロールエステラーゼ酵素から次のようにして作成したストック溶液である。１０１ｍｇのコレステロールエステラーゼ酵素をｐＨ＝７．０に調製されたトリス塩酸緩衝液に溶解する。ここで、要するトリス塩酸緩衝液は１０ｍＬである。このようにして調製された４５．８μＬのストック溶液がＢである。溶液Ｃは、緩衝液であって、９４４．２μＬのｐＨ＝７．０、０．０５Ｍ（モル／Ｌ）に調製されたトリス塩酸緩衝液である。これらＡ、Ｂ、Ｃの３つの溶液を混合させ、３０分間反応させる。一般的に、精製されたコレステロールエステラーゼ酵素は高価であり、この酵素を用いたフコキサンチンの脱アセチル化反応は反応速度が遅く、収率は５％以下であると非特許文献７には報告されている。

非特許文献８によると、豚肝臓由来のエステラーゼ（ＰＬＥ）を用いてフコキサンチンのアセチル基を加水分解してフコキサンチノールを合成している。反応は、次の溶液Ｃ、Ｄをフコキサンチンに加えて行う。溶液Ｃは、メタノールとトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．３、５０ｍＭ）の混合溶液であって、比率はメタノール：トリス塩酸緩衝液＝２：３である。溶液Ｄは、豚肝臓由来エステラーゼ（ＰＬＥ）酵素溶液であって、まず、ＰＬＥ（活性度が３５５ユニット/ｍｇ）を用意する。このＰＬＥ１９ｍｇを１００μＬの硫酸アンモニウム溶液に溶解させる。ここで使用する硫酸アンモニウム溶液は、３．２Ｍになるように溶液Ｄを用いて調製したものである。このように調製された溶液Ｃ、Ｄを用いて以下の条件で反応させる。１ｍｇのフコキサンチンを６．５ｍＬの溶液Ｃに溶解させた後、１００μＬの溶液Ｄを加える。この混合溶液を窒素雰囲気下で、２５〜２８℃において攪拌機で２４時間作用させることにより、加水分解反応を行っている。

この反応条件ではフコキサンチノールが０．３３ｍｇ（収率４５%）得られているが、依然収率は改善される余地がある。さらに反応終了まで２４時間掛かっていることから、短時間で反応を完結させる必要も残されている。

非特許文献９によると、微生物（学名：Candida cylindracea）由来のリパーゼを用いてフコキサンチンのアセチル基を加水分解してフコキサンチノールを合成している。反応条件は、２６ｐｍｏｌのフコキサンチンを溶解させたフコキサンチンのアセトン溶液１０μＬに、５ｍｇのリパーゼを含む１ｍＬのBritton-Robinson緩衝液を加え、３７℃、６時間インキュベートすることにより加水分解反応を行っている。この文献中にはフコキサンチンからフコキサンチノールへの収率は記載されていないが、ＨＰＬＣの分析結果の図から、６０％程度の収率であるものと予測される。この方法は実験室レベルであり、且つ非常に少量で行っており、然も高価なリパーゼを使用しているため、大量生産可能な技術であるかどうかは疑問である。

非特許文献１０によると、豚膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いてフコキサンチンのアセチル基を加水分解してフコキサンチノールを合成している。反応条件は、５μｍｏｌフコキサンチンと１００ｍｇのタウロコール酸を少量のジクロロメタン／メタノール（２:１）に溶解しアルゴンガスで溶媒を気化させた後、１０ｕｎｉｔのコレステロールエステラーゼを含む１０ｍＬのカリウムリン酸緩衝液中に溶解させ、３７℃で２時間インキュベートすることによりフコキサンチンを加水分解している。収率に関しては全く記載されていないが、高価なコレステロールエステラーゼを使用していることから大量生産に不向きである。

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本願発明は、従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、フコキサンチノールを短時間で且つ低コストで然も高収率で製造することが可能な、フコキサンチノールの製造方法の提供を目的とする。

本発明者等は上記課題について鋭意検討を行った結果、動物内臓由来リパーゼをフコキサンチンに適温、適濃度、適時間で作用させたところ、８０％以上もの効率でフコキサンチノールが得られることを見出した。

即ち、本願発明のフコキサンチノールの製造方法は、フコキサンチンと界面活性剤とを第一の有機溶媒に溶解させ、前記有機溶媒を蒸発させて前記フコキサンチンと前記界面活性剤を乾燥させた後、得られた乾燥物をpH緩衝溶液に溶解させ、リパーゼを前記乾燥物を溶解させた前記ｐＨ緩衝溶液に加え、所定の温度で所定の時間だけ保ち、未精製のフコキサンチノールを製造することを特徴とする。

本願発明と従来法との決定的な違いは、フコキサンチンの加水分解酵素としてリパーゼ、特に動物由来のリパーゼを使用している点にある。動物由来のリパーゼであれば、未精製のリパーゼであっても十分に高収率でフコキサンチンの加水分解によりフコキサンチノールを得ることが可能である。

また、本願発明のフコキサンチノールの製造方法は、請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法により得られた未精製のフコキサンチノールを、第二の有機溶媒に溶解し、クロマトグラフィにより精製することを特徴とする。

前記フコキサンチンは、有機合成物、若しくは動物又は植物又は藻類から抽出し単離・精製されたもの、若しくは細菌から抽出し精製されたものである。また、前記第一の有機溶媒は、アルコール類、エーテル類、ケト類、脂肪族炭化水素のハロゲン化合物、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上であってもよい。

前記界面活性剤は、タウロコール酸、デキシコール酸、グリコール酸及びこれらのアルカリ塩又はレシチン類、脂肪酸グリセリンエステル、脂肪酸プロピレングリコールエステル、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ショ糖エステル、オレイン酸アルカリ塩、脂肪酸モルホリン塩、ステアリル乳酸カルシウム、タンパク質の中から選ばれた一種又は二種以上であってもよい。

前記pH緩衝溶液のpHは、５以上９以下であり、前記リパーゼは、動物内臓由来のリパーゼである。前記インキュベートの所定の温度は、１０℃以上５０℃以下、前記インキュベートの所定の時間は、３０分以上４８時間以下であってもよい。

前記第二の有機溶媒及び前記クロマトグラフィの展開溶媒は、アルコール類、エーテル類、ケト類、脂肪族炭化水素のハロゲン化合物、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上であることを特徴とする。また、前記クロマトグラフィの充填剤は、順相系のシリカゲル、セライト、アルミナ、水酸化カルシウム、若しくは逆相系の直鎖アルキル基、芳香族官能基、親水性官能基又は極性内包型官能基がシルカゲルに化学結合したものの中から選ばれた一種又は二種以上であることを特徴とする。

フコキサンチンと界面活性剤とを第一の有機溶媒に溶解させ、前記有機溶媒を蒸発させて前記フコキサンチンと前記界面活性剤を乾燥させた後、得られた乾燥物をpH緩衝溶液に溶解させ、リパーゼを前記乾燥物を溶解させた前記ｐＨ緩衝溶液に加え、所定の温度で所定の時間だけインキュベートして、未精製のフコキサンチノールを製造し、この得られた未精製のフコキサンチノールを、第二の有機溶媒に溶解し、クロマトグラフィにより精製することを特徴とするので、フコキサンチノールを短時間で且つ低コストで然も高収率で製造することが可能となる。

また、このフコキサンチノールを食品素材に添加することで、種々の機能を有する機能性食品素材とすることが可能で、機能性食品素材の市場を拡大することに大きく寄与することが予想される。

以下、本願発明の実施の形態について具体的に説明するが、本願発明がこの実施の形態のみに限定されるものではない。図１は、本願発明のフコキサンチノールの製造方法のフローチャートである。ワカメから抽出し、単離・精製したフコキサンチンから豚膵臓由来リパーゼを用いてフコキサンチノールを合成する一連の操作について示した。

原料となるフコキサンチンは、ここでは海藻から抽出したフコキサンチンを用いたが、有機合成によって得られたフコキサンチンであっても、フコキサンチンを含有する動物から抽出されたフコキサンチンであっても、大腸菌や酵母に生合成させたフコキサンチンであっても、これらの方法を組み合わせて合成したフコキサンチンであっても構わない。言い換えると、如何なる手段で得られたフコキサンチンであっても最終生成物であるフコキサンチノールを短時間に安価で高収率に合成することが可能である。

このフコキサンチン０．５ｇをメタノール３００ｍＬに溶解し、続いて界面活性剤であるタウロコール酸ナトリウム２．５ｇをこの溶液に加え、完全に溶解させる。ここでタウロコール酸ナトリウムが溶解しにくい場合には、ソニケータを用いることも可能である。得られたフコキサンチンとタウロコール酸ナトリウムのメタノール溶液をエバポレータで乾固させる。さらに乾燥窒素ガスを乾固物に吹き付けて、メタノールを完全に取り除いた。

得られた乾固物を０．１Ｍ、ｐＨ＝７．０のリン酸カリウム緩衝液５００ｍＬに溶解し、続いて豚膵臓由来リパーゼ１０ｇを加えた。ここで用いる豚肝臓由来リパーゼは高価な精製された物である必要は無く、実際に本実施例では粗リパーゼを用いているが、反応効率や反応時間において何ら問題は無かった。従って、安価にフコキサンチノールを製造するには粗精製リパーゼで十分である。

リパーゼが溶解した後、３７℃で２時間インキュベートした。酵素反応後の溶液にメタノール３００ｍＬを加えて攪拌後、１０分間静置した。この溶液にジエチルエーテル５００ｍＬを加えて分液操作を行った。ジエチルエーテル相は回収し、水相はカロテノイドの色が無くなるまで分液操作を繰り返した。回収したジエチルエーテル相をエバポレータで乾固することで、未精製フコキサンチノールを得た。

得られた未精製フコキサンチノールをカラムクロマトグラフィ（充填剤：シリカゲル、展開溶媒：５０％アセトン／ヘキサン）に供した。図２にカラムクロマトグラフィの展開状況を示した。まず、タウロコール酸ナトリウムが溶出し、続いて未反応のフコキサンチン、フコキサンチノールの順番で溶出する。図2に示した反応条件（リパーゼ量が原料フコキサンチンの１０倍量）の場合には、未反応のフコキサンチンが現れてきているが、図１のフローチャートの反応条件（リパーゼ量が原料フコキサンチンの２０倍量）では目視に於いて、カラムクロマトグラムでフコキサンチンのバンドは確認されなかった。

図2に示した反応条件と図１のフローチャートの反応条件において、それぞれ２回づつ実験を行った。図２に示した反応条件では原料５１８．９ｇ（１回目）、６２０．１ｍｇ（２回目）からそれぞれフコキサンチノール２７２．８ｇ（１回目：収率５６．１％）、３６０．６ｍｇ（２回目：収率６２．２％）、未反応フコキサンチン２２３．５ｍｇ（１回目）、１６８．９ｍｇ（２回目）が得られた。一方、図１のフローチャートの反応条件では原料４９６．７ｍｇ（１回目）、５３１．７ｍｇ（２回目）からそれぞれフコキサンチノール４３４．４ｍｇ（１回目：収率９３．４％）、４１２．２ｍｇ（２回目：収率８２．８％）が得られた。従って、フコキサンチンとリパーゼの量を適切な比に設定することで、フコキサンチノールの収率を高めることが可能となる。

得られたカラムクロマトグラフィ精製フコキサンチノールの高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析を行ったところ、図３に示したように、約８０％以上の全トランス体フコキサンチノールが得られた。ＨＰＬＣで全トランス体のみを単離・精製し、ＮＭＲ分析を行った。図４はＨＰＬＣ精製後の全トランスフコキサンチノールの１次元プロトンＮＭＲであり、図５はＨＰＬＣ精製後の全トランスフコキサンチノールの１次元カーボンＮＭＲである。これにより、得られたフコキサンチンの加水分解物がフコキサンチノールであることを確認した。従って、本願発明のフコキサンチノールの製造方法によって、高純度のフコキサンチノールを大量、安価且つ短期間に製造することが可能になった。

本願発明は、酵素反応によってフコキサンチンからフコキサンチノールを短時間で且つ安価に然も高収率で得るためのフコキサンチノールの製造方法に関するものであり、製造したフコキサンチノールを食品素材等に添加することで、機能性食品素材として用いることができる。従って、産業上は食品の分野で活用することが可能である。その他にも医学、農業の分野で応用することも考えられる。

本願発明のフコキサンチノールの製造方法のフローチャートである。カラムクロマトグラフィの展開状況を示す写真である。カラム後の各成分のＨＰＬＣ分析チャートである。ＨＰＬＣ精製後の全トランスフコキサンチノールの１次元プロトンＮＭＲである。ＨＰＬＣ精製後の全トランスフコキサンチノールの１次元カーボンＮＭＲである。フコキサンチノールとフコキサンチンの化学構造式である。

Claims

フコキサンチンと界面活性剤とを第一の有機溶媒に溶解させ、前記有機溶媒を蒸発させて前記フコキサンチンと前記界面活性剤を乾燥させた後、得られた乾燥物をpH緩衝溶液に溶解させ、リパーゼを前記乾燥物を溶解させた前記ｐＨ緩衝溶液に加え、所定の温度で所定の時間だけ保ち、未精製のフコキサンチノールを製造することを特徴とするフコキサンチノールの製造方法。
請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法により得られた未精製のフコキサンチノールを、第二の有機溶媒に溶解し、クロマトグラフィにより精製することを特徴とする、フコキサンチノールの製造方法。
前記フコキサンチンは、有機合成物、若しくは動物又は植物又は藻類から抽出し単離・精製されたもの、若しくは細菌から抽出し精製されたものであることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記第一の有機溶媒は、アルコール類、エーテル類、ケト類、脂肪族炭化水素のハロゲン化合物、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記界面活性剤は、タウロコール酸、デキシコール酸、グリコール酸及びこれらのアルカリ塩又はレシチン類、脂肪酸グリセリンエステル、脂肪酸プロピレングリコールエステル、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ショ糖エステル、オレイン酸アルカリ塩、脂肪酸モルホリン塩、ステアリル乳酸カルシウム、タンパク質の中から選ばれた一種又は二種以上であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記pH緩衝溶液のpHは、５以上９以下であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記リパーゼは、動物内臓由来のリパーゼであることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記インキュベートの所定の温度は、１０℃以上５０℃以下であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記インキュベートの所定の時間は、３０分以上４８時間以下であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記第二の有機溶媒及び前記クロマトグラフィの展開溶媒は、アルコール類、エーテル類、ケト類、脂肪族炭化水素のハロゲン化合物、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上であることを特徴とする請求項２に記載のフコキサンチノールの製造方法。
前記クロマトグラフィの充填剤は、順相系のシリカゲル、セライト、アルミナ、水酸化カルシウム、若しくは逆相系の直鎖アルキル基、芳香族官能基、親水性官能基又は極性内包型官能基がシルカゲルに化学結合したものの中から選ばれた一種又は二種以上であることを特徴とする請求項２に記載のフコキサンチノールの製造方法。