JPH02469A

JPH02469A - ビタミンｄ類の製造方法

Info

Publication number: JPH02469A
Application number: JP63108337A
Authority: JP
Inventors: Sadafumi Omura; 大村　貞文; Jiyouji Sasaki; 冗二佐々木; Akiko Mikami; 三上　明子; Kazutoshi Mizogami; 溝上　一敏
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-07-08
Filing date: 1988-04-30
Publication date: 1990-01-05
Also published as: JPH0464678B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ヒドロキシビタミンＤ類の微生物を利用する
製造方法に関する。

従来の技術有機化学的方法によりビタミンＤ類の１α及び／又は２
５位に直接水酸基を導入することは極めて困難で、その
例は未だ報告されていない。

また、微生物を用いた酵素化学的方法によりビタミンＤ
類に直接水酸基を導入する方法も、これまでに報告され
ていない。

一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により原料のビ
タミンＤ類の１α及び／又は２５位に直接水酸基を導入
することは、従来から可能であった。すなわち、１α位
に直接水酸基を導入する場合、ニワトリなどの動物の腎
のホモジネートやミドフンドリア画分を用いる方法［ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２３０巻、第２２８頁（
１９７１年）、ジャーナルオブバイオロジカルケミスト
リ＝（Ｊ、　Ｂｉｏｌｏｇ。

Ｃｈｅｆｆｉ、　）　、第２４７巻、第７５２８頁（１
９７２年）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、第２５巻、第５５１２頁（１９８６年）など
］が知られている。また、２５位に直接水酸基を導入す
る場合、ラットなどの動物の単離した肝臓にビタミンＤ
類を含む溶液を潅流させる方法［ジャーナルオブクリニ
カルインベステイゲーション（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎ
ｖｅｓｔ、　）　、第４８巻、第２０３２頁（１９６９
年）、バイオケミカルアンドバイオフィジカル　リサー
チ　コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）、第
６６巻、第６３２頁（１９７５年）］やラットなどの動
物の肝のホモジネートを用いる方法［バイオケミカルア
ンドバイオフィジカルリサーチ　コミュニケーション（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　）　、第３６巻、第２５１頁
（１９６９年）コが知られている。

発明が解決しようとする課しかしながら、動物臓器を用いた酵素化学的方法では、
多量の動物の腎又は肝が必要であり、しかもその調製に
手間がかかり、非効率的で実用的な製造法ではない。

本発明は、より容易な操作による１α−及び／又は２５
−ヒドロキシビタミンＤ類を得る方法を提供することを
目的とする。

課題を解決するための手段本発明者らは、特定の微生物を利用することにより、ビ
タミンＤ類の１α及び／又は２５位に直接水酸基を導入
できることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、ビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はそ
の産生する酵素を含有する溶液中に１α又は２５位に水
ＭＭ子を有するビタミンＤ類を加えて、それぞれその水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒド
ロキシビタミンＤ類又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類
の製造方法、並びにビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌
体又はその産生ずる酵素を含有する溶液中に１α及び２
５位に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、その水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする２５−ヒド
ロキシビタミンＤＭ又は１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造方法である。す
なわち、本発明によれば、１α位又は２５位に水素原子
を有するビタミンＤ類は、それぞれその水素原子が水酸
基に変換きれ、１α及び２５位に水素原子を有するビタ
ミンＤ類は、まずその２５位水素原子が水酸基に変換さ
れ、次いで、１α位が水酸基に変換される。

本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の１α及び／又は２
５位に直接、１工程で水酸基を導入する方法であり、１
α又は２５位以外にいずれの置換基を有していてもよい
、従って、本発明においてビタミンＤ類とは、たとえば
、ビタミンＤ、系及びビタミンＤ、系の化合物であり、
その１７位側鎖の水素原子又は水酸基がフッ素などのハ
ロゲン原子、水酸基、低級アルキル基などで置換きれて
いてもよい。原料のビタミンＤ類の１α又は２５位は、
これが水素原子以外のときは水酸基であることが好まし
い。それらは、たとえば、ビタミンＤ！、ビタミンＤ８
．１α−ヒドロキシビタミンＤいｌα、２４−ジヒドロ
キシビタミンＤｓ、２５−ヒドロキシビタミンＤＡ、２
５−ヒドロキシビタミンＤ３．２４．２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ、、２３．２５−ジヒド「Ｊキシビタミン
Ｄ、、２５．２６−ジヒドロキシビタミンＤ３．２３．
２４．２５−トリとドロキシビタミンＤ８．２４．２４
−ジフルオロ−２５−ヒドロキシ−２６，２７−シメチ
ルビタミンＤ８．２５−ヒドロキシ−２６，２６，２６
，２７゜２７．２７−ヘキサフルオロビタミンＤ、など
である。

本発明に使用される放ｎ！２とは、ビタミンＤＭの１α
及び／又は２５位に水酸基を導入する能力を有する放線
菌である。それらは、たとえば、アクチツマジュラ（Ａ
ｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　）属、ロドコッカス（Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ　）属、チャイニア（Ｃｈａｉｎｉａ
）！、ストレプトパーティシリウム（Ｓｔｒｅ　ｔｏｖ
ｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アクチノプラネス（酸見
μ遍匹胡）属、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏ　１ａ
ｎｅｓ）属、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓ
　ｏｒａ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　）属、
ストレプトマイセス〈兆匹匹印パ朋）属などに属するも
のであり、好ましくは、本発明者らが埼玉県大宮市の土
壌より新たに分離した菌株であり、微生物の名称及び記
号１ストレプトマイセス・スクレロチアラスＴ−ＪＳＩ
（兆朋匹叩バ朋５ｃｌｅｒｏｔｉａｌｕｓ　Ｔ　−Ｊ　
Ｓ　１　）Ｊ及び１微生物の保管受託番号第１３７０号
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３７０）、として工業技術院微生
物工業研究所に寄託されているもの、本発明者らが山梨
県南部留郡鳥沢村の土壌より新たに分離した菌株であり
、微生物の名称１ストレプトマイセス・ロゼオスポラス
Ａ−５７９７（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓｇ朋Ａ−５７
９７）Ｊ及び１微生物の保管受託番号第１５７４号（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−１５７４）Ｊとして工業技術院微生物工
業研究所に寄託されているもの、又は、本発明者らが埼
玉県大宮市の土壌より新たに分離した菌株であり、微生
物の名称１ノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２（
Ｎｏｃａｒｄｉａ　肚印竺並垣ｃａ　Ｎ　−１０２）Ｊ
及び１微生物の保管受託番号第１５７３号（ＦＥＢ１３
８Ｐ−１５７３）、として工業技術院微生物工業研究所
に寄託されているものである。

これらの菌株の菌学的性状を以下に示す。

ａ、ストレプトマイセス・スクレロテアラスＴ−Ｊ　Ｓ
　１１）形態栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地において分岐
しながらよく発達する。気菌糸はイースト麦芽寒天培地
、オートミール寒天培地、スターチ無機塩寒天培地、グ
リセリン・アスパラギン寒天培地でわずかに形成される
。胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で螺旋状の胞子連
鎖形態を呈する。１３子は通常１０個以上の連鎖が認め
られ表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で、その太
ききは０．５７〜１．ＯＸｏ、６４〜１．４Ｐである。

螺旋状の胞子連鎖はスターチ・無機塩寒天培地で最もよ
く発達する。栄養菌糸には菌核が観察される。また、イ
ースト麦芽寒天培地で２週間培養した場合には胞子のう
に類似した形態を呈する胞子の集束が観察きれる。べん
毛胞子は観察されない。

２）培地上での生育状態各種培地で２８’Ｃ，１４日間培養したときの肉眼的観
察結果を第１表に示す。

第１表３）生理的性質（１）生育温度範囲スターチ・無機塩寒天培地上において２５〜３５°Ｃの
範囲で良好に生育する。

１０℃以下、４５℃以上の温度範囲では生育しない。

（り生化学的性質ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化：　　　　　陽性Ｃ）脱脂乳の凝固：　　　　　　陰性ｄ）脱脂乳のペプトン化；　　　陽性ｅ）スターチの加水分解；　　　陽性ｆ）メラニン様色素生成；　　　陰性（３）炭素源の利用（ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地）以下の炭素源すべてを利用する。

Ｄ−グルフース、Ｄ−フラクトース。

イノシトール、ガラクトース、スターチ。

シュクロース、ラムノース。

Ｄ−マンニット、Ｌ−アラビノース。

Ｄ−キシロース、ラフィノース以上の性状から本菌株が放ＩＩＩに属することは明らか
であり、上記諸性状をＩ　、　Ｓ、　Ｐ、’インターナ
ショナル・ストレプトマイセス・ブロジェクトヨ。

バージ−著「マニュアル・才ブ・デイターミナテイプ・
バクテリオロジー」第８版（１９７４年）及びワックス
マン著ｒジ・アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）
に報告きれている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はストレプトマイセス・スクレロチアテスに最も近い
性状を示していた。

以上の結果より、本菌株はストレプトマイセス・スクレ
ロチアラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はス
トレプトマイセス・スクレロチアラス　Ｔ−Ｊ　Ｓ　１
と命名した。

ｂ、ストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７９
７１）形態栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、亀子はグリセリン・アスパラギン寒天培地、スターチ
無機塩寒天培地及びオートミール寒天培地などで良好に
形成される６ｗ４微鏡で観察すると胞子形成菌糸の分岐
方法は単純分岐で胞子は直鎖状に形成きれる。胞子は通
常１０個以−ヒの連鎖が認められ、培養の後期には長い
鎖状を呈し、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で
、その太ききは０．６７〜０．７５Ｘ　１．３０〜１．
５８４である。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察きれ
ない。

２）培地上での生育状態各種培地で３０°Ｃ１１４日間培養したときの南限的観
察結果を第２表に示す。

第２表３）生理的性質（υ生育温度範囲オートミール寒天培地上において２０〜３０℃ｃ７）Ｑ
［囲で良好に生育する。

１０°Ｃ以下、４０°Ｃ以上の温度範囲では生育しない
。

（り生化学的性質ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化；　　　　　陽性Ｃ）脱脂乳の凝固；　　　　　　陰性ｄ）脱脂乳のペプトン化；　　　陽性ｅ）スターチの加水分解；　　　陽性ｆ）メラニン様色素生成；　　　陰性ｇ）細胞壁タイプ；　　　　　　　Ｉ型（３）炭素源の
利用（ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地）利用する二叶グルコース、Ｌ−アラビノース。

叶キシロース、Ｆ）ずかに利用する＝Ｄ−フラクトース。

ラムノース利用しない：シュクロース、イノシトール。

ラフィノース、Ｄ−マンニット以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らかで
あり、上記諸性状を１．Ｓ、Ｐ、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」、バージ−著１
マニュアル・オブ・ディターミナティブ・バクテリオロ
ジー」第８版（１９７４年）及びワックスマン著１ジ・
アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）に報告諮れて
いる多くの既知菌種と比較した結果、本菌株はストレプ
トマイセス・ロゼオスポラスに最も近い性状を示してい
た。

以上の結果より、本菌株はストレプトマイセス・ロゼオ
スポラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はスト
レプトマイセス・ロゼオスポラスＡ−５７９７と命名し
た。

Ｃ，ノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２１）形態栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地及びスター
チ無機寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡で観察
すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で胞子は直鎖
状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ
、培養の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑である。

胞子の形状は円筒形で、その大きさは０．５〜０．８×
２．５〜４．３Ｐである。菌核、胞子のう、べん毛胞子
はｆｉ察されない。

２）培地上での生育状態各種培地で３０°Ｃ５１４日間培養したときの肉眼的観
察結果を第３表に示す。

第３表／／′ ／、／／／３）生理的性質（１）生育温度範囲栄養寒天培地上において２０〜３０°Ｃの範囲で良好に
生育する。

１０℃以下、４０℃以上の温度範囲では生育しない。

（り生化学的性質ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化；　　　　　陰性Ｃ）脱脂乳の凝固；　　　　　　陰性ｄ）脱脂乳のペプトン化；　　　陰性Ｃ〉スターチの加水分解；　　　陰性ｆ）メラニン様色素生成；　　　陰性ｇ）硝酸還元能；　　　　　　　陰性０）炭素源の利用（ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地）利用する＝Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース。

シュクロース、Ｄ−キシロース。

Ｌ−イノシトール、Ｄ−マニトース。

Ｄ−フラクトース、ラムノースわずかに利用する：ラフィノース以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らかで
あり、上記諸性状を１．Ｓ、Ｐ、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」。

バージ−著「マニュアル・才ブ・ディターミナティブ・
バクテリオロジー、第８版（１９７４年）及びワックス
マン著１ジ・アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）
に報告されている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はノカルジア・オウトトＯヒ力に最も近い性状を示し
ていた。

以上の結果より、本菌株はノカルジア・オウトトロヒ力
と種を同じくするものと判断し、本菌株はノカルジア・
オウトトロヒカＮ−１０２と命名した。

本発明の方法は、放線菌の菌体又はその産生ずる酵素を
含有する溶液中で、基質ビタミンＤ類を好気的条件下で
反応きせることによって行うものである。

反応に必要な放線菌の菌体を得るためには、好気条件下
で本閑の培養を培地中で行う。

培地は主として液体培地を用い、炭素源としてグルコー
ス、マルトース、デキストロース、スターチ、アラビノ
ース、キシロースを単独又は混合して用いる。窒素源と
しては、ボリペブ）・ン。

カサミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンステーブリ
カー及びソイビーンミールなどを単独又は混合して用い
る。その他、本菌株の生育を助け、１α−及び／又は２
５−ヒドロキシビタミンＤ類の生産を促進する有機物及
び無機塩を必要番こより添加することができる。培養方
法は振とう培養、通気攪拌培養などの好気培養が適して
おり、ｐＨ６〜７．４．２８〜３０℃で２〜８日間培養
する。

この培養により得られた菌体を含有する溶液を、１α−
及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生産する反
応に用いる。すなわち、培養中の菌体を含む培養液をそ
のまま用いるか、培養終了後、遠心分離又はＵ過により
分離した菌体を懸濁した溶液を用いる。また、培養後に
得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除い
た溶液を用いる。きらにまた、菌体は光架橋性Ｉ６１詣
プレポリマー、たとえばＥＮＴ３４００［商品名；関西
ペイント（株）製］などや、ウレタン・プレポリマー、
たとえばＰＵ−９［商品名；東洋ゴム（株）製］などや
に一カラギナンなどの多糖類に固定化してから溶液に添
加してもよい。

また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同様に用い
ることもできる。

本発明において用いられる溶液は、前記培地であるか、
あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリ
ウムーフハク酸、フハク酸カリウムーフハク酸、クエン
酸ナトリウム−クエン酸、リン酸、カコジル酸ナトリウ
ム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの
緩衝液を弔独又は混合したものである。その他、緩衝液
には、目的のビタミンＤ類の生産を促進する界面活性剤
、有機物及び無機塩を必要により添加することができる
。

本発明の製造方法は、前記菌体を含有する溶液中で振と
う操作、通気攪拌操作などに付して好気条件下で行うこ
とが適しており、ｐＨ５〜８．２０〜３７°Ｃで５分間
〜９６時間攪拌振とうする。また、酸素気流下で反応す
ることができる。基質のビタミンＤ類は攪拌振とう開始
時に適量添加する。

また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は、基質
ビタミンＤ類を添加後、更に同条件下で２４〜９６時間
培養して本反応を行う。

なお、１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ類
を原料とする場合、後記の高速液体クロマトグラフィー
等で生成物を確認して反応時間をさめ、２５−ヒドロキ
シビタミンＤ類又は１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ類をそれぞれ製造するこ
とができる。

これらの反応により製造されたビタミンＤ類を／Ｉｔ　
ＰＩＬするには、血液中からビタミンＤ類を採取する一
般的な方法に準じて行えばよい。たとえば、反応終了後
、反応液を有機溶媒により抽出し、濃縮乾固する。これ
を２−プロパノ−ルーｎ−ヘキサンなどの適当な溶媒に
溶解し、遠心分離により不溶物を除いた後、シリカゲル
順層カラム（たとえば、ゾルパックスＳＩＬ、米国デュ
ポン社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー又はシ
リカゲル逆層カラム（たとえば、ゾルパックスＯＤＳ。

米国デュポン社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ
ーに付すことにより目的のヒドロキシビタミンＤ類を単
離することができる。

発明の効果本発明の方法により、ビタミンＤ類のｌα及び／又は２
５位へ直接水酸基を導入することが可能になった。すな
わち、本発明の微生物を用いる方法では、微生物や反応
溶液などの調製に手間がかからず、しかも１段階で短時
間に行うことができ、極めて容易かつ能率的である。

及履刻以下、実施例及び試験例をあげて本発明をきらに詳細に
説明する。

実施例１スターｆ１％、マルトース１％、デキストリン１％、ソ
イビーンミール１．５％、肉エキス０．３％、カザミノ
酸０．５％、炭酸カルシウム０．４％、　ｐＨ７，０の
無菌液体培地５０ｄの入った５００ｍＱの三角フラスコ
５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロデアラ
スＴ−Ｊ　Ｓ　１を１白金耳ずつ接種し、３０°Ｃで４
８時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心
分離して菌体を集め、この菌体を１５ｍＭトリス−酢酸
、２５ｍＭコハク酸ナトリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウ
ム及び２００ｍＭシュクロースからなるｐＨ７，４の緩
衝液（以下、緩衝液Ａと略す）２００ｄに懸濁し、ｉｌ
Ｔびこの懸濁液を遠心分離して菌体を集めた。この菌体
をきらにｔｉｆｔ衝液Ａ　２００ｍＱに充分攪拌して懸
濁し、５００ｍ１ｌの三角フラスコ５本にそれぞれ４０
ｒ＋ｔｌｌずつ分注し、３０℃で５分間保温した。その
三角フラスコ５木のそれぞれに４００−のエタノールに
溶解した４００題の基１２５−ヒドロキシビタミンＤ、
を添加し、３０″Ｃで４５分間攪拌振とうした。各三角
フラスコの反応液を集め、塩化メチレン１１で抽出し、
塩化メチレン后を４０°Ｃ以下で減圧乾固後、直ちに２
−プロパツール：ｎ−ヘキｔン；１：９の混合溶媒７．
５ｍｌに溶解し、−２０℃で３時間放置した。これを遠
心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清液
を４０℃以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフ
ィー［ゾルバ・／クスＳＩＬ、米国デュポン社製］に付
した。

’ｆｆｌ　出ｍ　媒；　２−プロパツール：ｎ−ヘキサ
ン＝１　：　９　。

カラム温度；２５°Ｃ２溶出速度；１．５ｙｎＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた０次に
これを４０″Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１：９゜カラム温度；　４０”Ｃ、溶出速度；１．０ｍ１ｌ／分
。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
を２００（得た。　これは市販の１α、２５−ジヒドａ
キシビタミンＤ、（デュファー社製、オランダ）の標品
と液体クロマトグラフィ−の保持時間［ゾルバ・７クス
ＳＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開
裂／くターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍａｚ”　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）：４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−Ｈ，Ｏ）　、　３
８０（Ｍ”−２Ｈ！Ｏ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１２９　、１１６　、１１１　。

実施例２実施例１と同様にして、２４．２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、から１α、　２４．２５−トリヒドロキシビタ
ミンＤ、を得た。

実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾル
パックスＳＩＬ］における保持時間は、２９．４分であ
った。

最大紫外部吸収： λ１１６ｚ−２６５ａｍ（エタノール）Ｅ　　Ｉ　−Ｍ
　Ｓ（ｍ／ｚ）：４３２（Ｍ”）　、　４１４（Ｍ”−Ｈｌｏ＞　、　３
９６（Ｍ”−２ＨｆＯ）　。

２８７．２６９．２５１．１５２，１３４．１１６．５
９実施例３実施例１と同様にして、２５−ヒドロキシビタミンＤ、
から１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、を得た。

実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾル
パックスＳＩＬ］における保持時間は、１４．４分であ
った。

最大紫外部吸収： λｍａｚ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）：４２８（Ｍ”）　、　４１０（Ｍ”−Ｈ＊０）　、　３
９２（Ｍ”−２８ｔＯ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１１６　、５９実施例４実施例１と同様にして、　２４．２４−ジフルオロ−２
５−ヒドロキシ−２６，２７−シメチルビタミンＤ、か
ら１α、２５−ジヒドロキシ−２４，２４−ジフルオロ
−２６，２７−シメチルビタミンＤ、を得た。

最大紫外部吸収： λｗａｘ”　２６５　ｎｍ（ｒ、タノール）Ｅ　Ｉ−Ｍ
Ｓ（ｍ／ｚ）：４８０（Ｍ”）　、　２８７　、２６９．２５１　、１
５２．１３４　、１１６実施例５実施例１と同様にして、２５−ヒドロキシ−２６，２６
゜２６、２７．２７．２７−ヘキサフルオロビタミンＤ
、から１α、２５−ジヒドロキシ−２６，２６，２６，
２７，２７，２７−ヘキサフルオロビタミンＤ、を得た
。

最大紫外部吸収： λｍａｘ−２６５ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２４（Ｍ”）　、　２８７　、２６９　、２５１　、
１５２　、１３４　、１１６実施例６グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コー
ンスチーブリ力−０，５％、塩化ナトリウム０５デ≦、
炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５
０ｍ１の入った５００ｍ１ｌの三角フラスコ５本のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７
９７を１白金耳ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を１５ｍＭ　トリス−酢酸、２５ｍＭ
フハク酸ナトリウム及び２ｍＭ酢酸マグネシウムからな
るｐＨ７，４の緩衝液（以下、緩衝液Ｂと略す）２００
ｍｌに懸濁し、ストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ
−５７９７の菌懸濁液を調製した。この菌懸渭液を再び
遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液Ｂ
　２００ｍ１ｌに充分攪拌して懸濁し、５００ｍ１ｌの
三角フラスコ５本にそれぞれ４０ｍ１ｌずつ分注し、３
０°Ｃで５分間保温した。その三角フラスコ５本のそれ
ぞれに１００４のエタノールに溶解したｚｏｏ、ｇの基
質２５−ヒドロキシビタミンＤ、をｆｌｉ　加し、３０
°Ｃで９０分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応
液を集め、塩化メチレン１１で抽出し、塩化メチレン層
を４０’Ｃ以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパツール
：ｎ−ヘキサン−１：９の混合溶媒７．５ｍｌに溶解し
、−２０℃で３時間放置した。

これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。こ
の上清液を４０’Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速ン１クロ
マトグラフィー［ジノしパックスＳＩＬ。

米国デュポン社製］に付した。

ｒＮ　出ｍ　媒；　２−プロパツール：ｎ−ヘキサン−
１：９Ｉカラム温度；２５“Ｃ９溶出速度；１．５ｄ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの画分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜カラム温度、　４０’Ｃ、溶出速度；１．０ｍ９７分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの画分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
を２００尾得九０　これは市販の１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ、（デュファー社製２オンンダ）の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパックスＳ
ＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｌｌ１６ｘ”　２６５　ｎｏ＋（エタノ−ル）Ｅ　ｒ
−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１６（Ｍ”）　、　３９Ｊ３（Ｍ”−Ｈ，Ｏ）　、　
３８０（Ｍ”−２Ｈ，Ｏ）　。

実施例７グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コー
ンスデーブリカ−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、
炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５
０ｍ１の入った５００ｍＱの三角フラスコ５本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２を１白金耳
ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振とう培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、この菌
体を緩衝液Ｂ　２００ｍＨに懸濁し、ノカルジア・オウ
トトロヒカＮ−１０２の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさら
に緩衝液Ｂ　２００ｍＱに充分攪拌して懸濁し、５００
ｍＱの三角フラスコ５本にそれぞれ４０ｍ１ずつ分注し
、３０℃で５分間保温した。その三角フラスコ５本のそ
れぞれに１００μのエタノールに溶解した２００尾の基
質２５−ヒドロキシビタミンＤ、を添加し、３０’Ｃで
４５分間攪拌振とうした。

各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレン１１で抽
出し、塩化メチレン届を４０°Ｃ以下で減圧乾固後、直
ちに２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝１＝９の混合溶
媒７．５ｍＱに溶解し、−２０°Ｃで３時間放置した。

これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。こ
の上清液を４０°Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速液体クロ
マトグラフィー［ゾルバ・ＺクスＳＩＬ、米国デュポン
社製］に付した。

溶出？１１［；２−プロパツール：ｎ−へキサ７　。

１＝９゜カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度Ｈ１，５ｍ１ｌ／分。

）オドダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤＭの紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ　、米国デュポン社製］
に付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜カラム温度；４０℃、溶出速度；１．（１ｍＱ／分。

）オドダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
を１００尾得尾得　これは市販の１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ、（デュファ−社製、オランダ）の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパックスＳ
ＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍａｘ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ　−Ｍ
　Ｓ（ｍ／ｚ）Ｈ４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−１１ｆｆｉＯ）　
、　３８０（Ｍ”−２Ｈ！Ｏ）　。

実施例８スクーチ１％、マルトース１％、デキストリン１％、ソ
イビーンミール１．５％、肉エキス０．３％、カブミノ
酸０．５％、次階カルシウム０．４％、　１）Ｈ７，０
の無菌液体培地５０ｍ１ｌの入った５００−の三角フラ
スコ５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレｉ］
チアラスＴ−Ｊ　Ｓ　１を１白金耳ずつ接種し、３０°
Ｃで４８時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌体を緩衝液Ａ　２０
０ｍＱに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離して菌体を
集めた。　この菌体をきらに緩衝液Ｂ２００ｍ１１に充
分攪拌して懸濁し、５００ｍ１１の三角フラスコ５本に
それぞれ４０ｄずつ分注し、３０°Ｃで５分間保温した
。　その三角フラスコ５本のそれぞれに１００μのエタ
ノールに溶解した２００題の基質１α−ヒドロキシビタ
ミンＤ、を添加し、３０℃で９０分間攪拌振とうした。

各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレン１１で抽
出し、塩化メチレン層を４０℃以下で減圧乾固後、直ち
に２−プロパツール：ｎ−ヘキサン−１＝９の混合溶媒
７．５ｍＱに溶解し、−２０°Ｃで３時間放置した。こ
れを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この
上清液を４０°Ｃ以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー［ツルパックスＳＩＬ、米国デュポン社製
］に付した。

溶出ｉ媒；２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝１＝９゜カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度；１．５ｍＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大扉電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１：９゜カラム温度；４０℃、溶出速度；１．０＋ｎｌｌ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大扉電子社製）で１′！＋ｑ定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０″Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒド［１キシビタミンＤ
、を２０Ｐｇ得た。　　これは市販の１α、２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ、（デュファー社製、オランダ）の
標品と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパック
ス５ＩＬＩ、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λ、ａｘ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）：４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−ＨｔＯ）　、　３
８０（Ｍ”−２Ｈ，Ｏ）　。

２８７、２６９．２５１．１５２．１３４．１２９．１
１６．１１１　。

実施例９グルツース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コー
ンスチーブリカ−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、
次階カルシウムＯ６２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５
０ｍ１ｌの入った５００ｒｄの三角フラスコ５木のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７
９７を１白金耳ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を緩衝液Ｂ　２００ｒｄに懸濁し、ス
トレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７９７の菌
懸濁液を調製した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌
体を集めた。この菌体をさらに緩衝液Ｂ２００ｍ１に充
分攪拌して懸濁し、　５００ｍ１ｌの三角フラスＴ１５
本にそれぞれ４０ｍＱずつ分注し、３０°Ｃで５分間保
温した。　その三角フラスコ５本のそれぞれに１００−
のエタノールに溶解した２００Ｐｇの基質１α−ヒドロ
キシビタミンＤ、を添加し、３０°Ｃで１８０分間攪拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチ
レン１１で抽出し、塩化メチレン層を４０°Ｃ以下で減
圧乾固後、直ちに２−プロパツール＝ｎ−ヘキサン＝１
：９の混合溶媒７．５ｍＱに溶解し、−２０°Ｃで３時
間放置した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清
液を得た。この上清液を４０°Ｃ以ドで減圧上濃縮し、
高速液体クロマトグラフィー［ゾルパックスＳＩＬ、米
国デュポン社製］に付した。

溶出溶媒；２−プロバノールニｎ−ヘキサンエ１：９゜カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度：１．５ｍＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの画分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤ５．米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１　：　９　。

カラム温度；４０°Ｃ１溶出速度；　Ｌ、Ｏｄ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製〉で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ８を
５０尾得た。　　これは市販の１α、２５−ジヒドロキ
シビタミンｐｍ（デュファー社製、オランダ）の標品と
液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパックスＳＩ
Ｌ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂バ
クーンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍＢ−２６５ｒ＋ｍ（エタノール）Ｅ　　Ｉ　−Ｍ　Ｓ（ｍ／ｚ）：４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−Ｈｌｏ）　、　３
８０（Ｍ”−２Ｈ，Ｏ）　。

２８７．２６９．２５１．１５２．１３４．１２９．１
１６．１１１　。

実施＠ｌＯグルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、フン
スチーブリ力−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、次
階カルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５０
ｍ１ｌの入った５００ｍＱの三角フラスコ５本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２を１白金耳
ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振とう培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、この菌
体を緩衝液Ｂ　２００ｍＱに懸濁し、ノカルシア・オウ
トトロヒカＮ−１０２の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をきら
に緩衝液Ｂ　２００ｍＱに充分攪拌して懸濁し、５００
ｍＱの三角フラスコ５木にそれぞれ４０ｍＱずつ分注し
、３０°Ｃで５分間保温した。その三角フラスコ５本の
それぞれに１００−のエタノールに溶解した２００尾の
基質１α−ヒドロキシビタミンＤ、を添加し、３０°Ｃ
で９０分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応液を
集め、塩化メチレン１１で抽出し、塩化メチレン層を４
０°Ｃ以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパツール：ｎ
−ヘキサン；１：９の混合溶媒７．５ｍｌに溶解し、−
２０℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性画分
を除き、上清液を得た。この上清液を４０°Ｃ以下で減
圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフィーしゾルパック
スＳＩＬ、米国デュポン社製コに付した。

ｉｌ［媒；２−プロパツール：ｎ−へ−１−サン−１：
９゜カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度；１．５ｍＱ／分２）
オドダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた０次に
これを４０°Ｃ以下で減圧ａｔｉｆｉシ、高速液体クロ
マトグラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社
製］に付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜カラム温度；４ｏ’ｃ、ｉｓ出速度；　１．０ｍ９７分
。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

火源電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０’Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧ａ縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒド［１キンビタミンＤ
、を３５０尾得九０　これは市販の１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤｉ（デュファー社製、オランダ）の標
品と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルバ・Ｚク
スＳＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収：＾□ｚ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ（
ｆｆｉ／Ｚ）：４１６（Ｍ”）　　、　　３９８（Ｍ”−ＨｌＯ）、　
　３８０（Ｍ’−２８＊０）。

２８７、２５９．２５１．１５２．１３４．１２９．１
１６．１１１゜実施例１１実施例８と同様にして、１α、２４−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、から１α、２４．２５−　トリヒドロキシビタ
ミンＤ、を得た。

実施例１と同条件の高速液体クロ７トグラフイー［ゾル
パックスＳＩＬコにおける保持時間は、２９．４分であ
った。

最大紫外部吸収： λｍａｘ’１！　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−
ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３２（Ｍ”）　、　４１４（Ｍ”−ＨｌＯ）　、　３
９６（Ｍ”−２Ｈ１０）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１１６　、５９実施例１２ノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２を、グルツー
ス１．５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスチー
ブリ力−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、次階カル
シウム０．２％、ｐＨ７，０（７）無菌液体培地５ｏ＋
Ｔｌｌ１ノ入った５００ｍ１ｌの三角フラスコ１本に１
白金耳接種し、３０゛Ｃで４８時間攪拌振とぅ培養した
。対数増殖期中にあるノカルジア・オウトトロヒカＮ　
−１０２の培養液中に２５０４のエタノールに溶解した
基質ビタミン０．５■及び０．５ｍＱのツイーン８０を
添加し、これを再び３０°Ｃで４８時間攪拌振とう培養
した。培養終了後、この培養液を塩化メ゛チレン２００
ｍ１で抽出し、塩化メチレン層を４０’Ｃ以下で減圧乾
固後、直ちに２−プロパノール二〇−ヘキサン＝１＝９
の混合溶媒３ｍ１１に溶解し、−２０°Ｃで３時間放置
した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得
た。この上清液を４０’Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速液
体クロマトグラフィー［ゾルパックスＳＩＬ、米国デュ
ポン社製］に付した。

ｍ　出ｒＲＢ　；　２−プロパツール：ｎ−へキサン＝
３：２２゜カラノ・温度；２５℃、　溶出速度ＨＬ５ｍｌｌ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズＭ　９９
０　、日本ウォーターズ社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤｙＡの紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間４．０分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０℃以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグラ
フィー［ゾルパックスｏｐｓ、米国デュポン社製コに付
した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１：９゜カラム温度；４０℃、溶出速度；　１．Ｏｄ／分。

溶出後、ビタミンＤ［の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間８，０分付近のピークの両分を集めた。これを
４０℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、２５−ヒドロキシビタミンＤ、を５００尾
得九０これは市販の２５−ヒドロキシビタミンＤ、（デ
ュファー社製、オランダ〉の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間［ゾルパックスＳＩＬ］、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。

最大紫外部吸収： λ、、ｘｘ　２６５　ａｍ（エタノール〉Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）：４００（Ｍ＋）、　３８２（Ｍ”−Ｈ，Ｏ）　、　２７
１　、２５３　、１３６　。

１１８．５９実施例１３ノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２を、グルフー
ス１，５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスゲ・
−ブリカー〇、５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カ
ルシウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ
７，０の無菌液体培地５０ＩＴＩｌｌの入った５００ｒ
Ｉｔｌ！の三角フラスコ１本に１白金耳液種し、３０℃
で４８時間攪拌振とう”；５Ｒした。対数増殖期中にあ
るノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２の培養液中
に２５０Ｐｆ１のエタノールに溶解した基質ビタミンＤ
、５■及び０．０５ｍ１のツイーン８０を添加し、これ
を再び３０℃で６０時間攪拌振とう培養した。培養終了
後、この培養液を塩化メチレン２００ｒ＋ｔｌｌで抽出
し、塩化メチレン層を４０°Ｃ以下で減圧乾固後、直ち
に２−プロパノール二〇−ヘキサン−１：９の混合溶媒
３ｒｄに溶解し、−２０°Ｃで３時間放置した。これを
遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清
液を４０°Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＳＩＬ、米国デュポン社製コに
付した。

溶出溶媒；２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝３：２２
゜カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度Ｈ１，５ｍＱ／分。

）オドダイオードアレイ検出器（ウォーターズＭ９９０
．日本つォーターズ社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１４，５分付近のピークの両分を集めた６次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製コに
付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜カラム温度；４０°ｂフォトダイオードアレイ検出器（つオーターズＭ９９０
．日本ウォーターズ社製）で測定６溶出後、ビタミンＤ
類の紫外部吸収パターンと一致する保持時間５．６分付
近のピークの両分を集めた。これを４０℃以下で、窒素
ガス置換しながら減圧濃縮乾固することにより、１α、
２５−ジヒドロキシビタミンＤ、を５０題得た。　　こ
れは市販の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、（ア
ユファー社製。オランダ）の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間［ゾルパックスＳＩＬ］、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。

最大紫外部吸収： λｍ８ｘ＝２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅｌ−ＭＳ（ｍ
／ｚ）：４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　、　３
８０（Ｍ”−２ＨｔＯ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１２９　、１１６　。

１１１．５９実施例１４実施例１２と同様にして、ビタミンＤＪから２５−ヒト
【コキシビタミンＤ、を得た。

実施例１２と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾ
ルパックスＳＩＬ］における保持時間は、３．９分であ
った。

最大紫外部吸収： λｍａｘ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ　−Ｍ
　Ｓ（ｍ／ｚ＞：４１２（Ｍ”）　、　３９４（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　、　２
７１　、２５３　、１３６　。

１１８．５９実施例１５実施例１３と同様にして、ビタミンＤ、から１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ、を得た。

実施例１３と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾ
ルパックスＳＩＬ］における保持時間は、１３，８分で
あった。

最大紫外部吸収： λ（ＢＢｚ−２６５ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ　−ＭＳ
（ｍ／ｚ）：４２８（Ｍ”）　、　４１０（Ｈ”−Ｈ，Ｏ）　、　３
９２（Ｍ”−２８，Ｏ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１１６　、５９実施例１６（１）ノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２を、グル
ツース１．５％、ソイビーンミール１．５％、フ−ンス
チーブリ力−０５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カ
ルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５０ｍＱ
の入った５００ｍＭの三角フラスコ１本に１白金耳接種
し、２８°Ｃで９６時間撹拌振とう培養した。

（２）以下の操作は２°Ｃないし８°Ｃの間で行った。

（１）で得られた菌体をｌｏｍＭ　トリス−酢酸、２ｍ
ＭＭ酸マグネシウム、７ｍＭ２−メツしカプトエタノー
ル及び２０％グリセリンからなるｐＨ７，４の緩衝液（
以下、緩衝液Ｃと略す）２００ｍＭに懸濁し閉部濁液と
してこれを遠心分離して得られた菌体を再び１００ｍＭ
のｉａ衝液Ｃに懸濁して閉部濁液とした。この懸濁ン夜
をディスパーザ−（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲ−ＲＡＸ■：商
品名、ＩＫＡ−ＷＥＲＫ社製）で２分間処理して菌体を
破砕し、菌体破砕、液とし、次にこれを遠心分離してそ
の上清液を得た。得られた−に清液にポリエチレングリ
コール６０００を終濃度２５％になるように攪拌しなが
ら少しづつ加えてこれを溶解した後、３０分間４°Ｃで
放置した６次に、この溶液を遠心骨はし、上清液を捨て
た後、粗酵素沈殿物を得た。

（３）　（２）で得られた沈殿物の約５００１７ｇ蛋白
質含量に相当する粗酵素を含む２０ｍＭ　トリス−酢酸
、７０ｍＷニコチンアミド、　２ｍＭ　ｆｈ酸マグネシ
ウム、１００ｍＭ　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　、　　５　ｍＭ　
Ａ　Ｔ　Ｐ　、　　６　ｍＭグルコース−６−リン酸、
ｐＨ７，４から成る酵素反応溶液１５ｍ１ｌにグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ５ユニット及び１５０
μのエタノールに溶かしたビタミンＤ　ｍ　３■を加え
、２８°Ｃで３０分間攪拌振とうし、酵素反応を行なっ
た。

（４）クロロホルム：メタノール＝１＝２の混合溶媒４
５ｍ１を（３）の酵素反応溶液に加え、反応を停止させ
た後、反応生成物をブライ・アンド・ダイヤ−（ｂｌｉ
ｇｈ　＆　ｄｅｙｅｒ）法で抽出した。抽出後、得られ
たクロロホルム画分を４０℃以下で減圧乾固後、直ちに
２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝１＝９の混合溶媒２
５０−に溶解し、これを高速液体クロマトグラフィー［
ゾルパックスＳＩＬ、米国デュポン社製］に付した。

溶出［Ｋ；２−プロパツール：ｎ−ヘキサン−３：２２
゜カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度；１．５ｍ１ｌ／分。

）すトダ・ｆオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００
　。

火源゛ＩＥ子社製）で４！り定。

（５）　＜４）の高速液体クロマトグラフィーの溶出後
、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間４．０分付近のピークの両分を集めた。

次にこれを４０’Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー［ツルパックスＯＤＳ、米［１デュポン社
製］に付した。

溶出溶媒：水：メタノール＝１：９゜カラム温度；４０°Ｃ１溶出速度、　１．０ｍＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大間電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間８．０分付近のピークの両分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しなから減圧濃縮乾固す
ることにより、２５−ヒドロキシビタミンＤ、を１１６
Ｐ１ｇ得た。これは市販の２５−ヒドロヤシビタミンＤ
ｍ（デュファー社製、オランダ）の標品と液体クロマト
グラフィーの保持時間［ゾルパックスＳ　Ｉ　Ｌ］、紫
外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが
完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍＢｚ＝　２６５　ｒｕｎ（エタノール）Ｅ　Ｉ−Ｍ
Ｓ（ｍ／ｚ）：４００（Ｍ”）　、　３８２（Ｍ”−Ｈ＊Ｏ）　、　２
７１　、２５３　、１３６　。

１１８．５９（６）　（４）の高速液体クロマトグラフィーの溶出後
、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間１４．５分付近のピークの両分を集めた。

次にこれを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製
］に付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１　：　９　。

カラム温度；４０℃、溶出速度；　１．０ｍ９７分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

天場電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの画分を集めた。　これ
を４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら１ｆ−Ｉ　Ｉ
Ｅ　ｅ４￥Ｊ乾固することにより、１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ、を２０Ｐｇ得た。これは市販の１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤｍ（デュファー社袈、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフィの保持時間［
ゾルパックスＳＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マス
スペクトル開裂パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍＢ−２６５ｎｍ（エタノール）ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１６（Ｍ”）　　、　　３９８（Ｍ”−ＨｆｉＯン　
、　　３８０（Ｍ”−２Ｈ，０ン　。

２８７、２６９．２５１　、１５２．１３４．１２９．
１１６゜１１１．５９、−（験例１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、のインビトロ薬
理活性試験［ラジオリセブターアッセイ法］ニワトリの
胎児の腸管より調製された１α、２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ、リセブタ−［ヤマサ醤油（株）］を１１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオ
スレイトール、１０ｍＭモリブデン酸ナトリウム、ｐＨ
７，４の緩衝液に懸濁させ、これをノセブター溶液（プ
ロティン約０．５ｍｇ／　ｍＱ　）として使用した。

このリセブター溶液に、５０％エタノールに溶解した被
検薬［１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ。

の標品（デュファー社製、オランダ）］及び実施例１で
得られた１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤＩを３又
は１０−１１０１〜１０−’Ｍになるように添加した０
次いで１Ｈ−１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、（
約０．４μＭ）を添加し、０°Ｃで３時間インキュベー
ションして反応を行った。リセブター結合物と非結合物
の分離はチャコール法を用いた。特異的結合量は、上記
反応より得られる総語合量から１０μＭの１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ、存在下に得られる非特異的結
合量を差し引いて求めた。被検薬の結合能は、リセブタ
ーへのＩＨ−１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、の
結合を５０％阻害する濃度（ｔｃｓｅ）で示した。

以上、実施例１．６．７．８．１３及び１６で得られた
ｌα、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、は、ラジオクセ
ブタ−アッセイ法によるインビトロ薬理試験において、
市販の標品と同一の活性を示した。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はその産
生する酵素を含有する溶液中に１α又は２５位に水素原
子を有するビタミンＤ類を加えて、それぞれその水素原
子を水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒドロキ
シビタミンＤ類又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製
造方法
（２）ビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はその産
生する酵素を含有する溶液中に１α及び２５位に水素原
子を有するビタミンＤ類を加えて、その水素原子を水酸
基に変換することを特徴とする２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ類又は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ類の製
造方法
（３）放線菌がストレプトマイセス属又はノカルジア属
に属する菌である請求項（１）又は（２）に記載の製造
方法
（４）放線菌がストレプトマイセス・スクレロチアラス
Ｔ−ＪＳ１（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｓｃｌｅ
ｒｏｔｉａｌｕｓ￥Ｔ−ＪＳ１）である請求項（１）又
は（２）に記載の製造方法
（５）放線菌がストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ
−５７９７（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｒｏｓｅ
ｏｓｐｏｒｕｓ￥Ａ−５７９７）である請求項（１）又
は（２）に記載の製造方法
（６）放線菌がノカルジア．オウトトロヒカＮ−１０２
（￥Ｎｏｃａｒｄｉａ￥￥ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ￥
Ｎ−１０２）である請求項（１）又は（２）に記載の製
造方法