JPH02469A - ビタミンd類の製造方法 - Google Patents
ビタミンd類の製造方法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒドロキシビタミンD類の微生物を利用する
製造方法に関する。
製造方法に関する。
従来の技術
有機化学的方法によりビタミンD類の1α及び/又は2
5位に直接水酸基を導入することは極めて困難で、その
例は未だ報告されていない。
5位に直接水酸基を導入することは極めて困難で、その
例は未だ報告されていない。
また、微生物を用いた酵素化学的方法によりビタミンD
類に直接水酸基を導入する方法も、これまでに報告され
ていない。
類に直接水酸基を導入する方法も、これまでに報告され
ていない。
一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により原料のビ
タミンD類の1α及び/又は25位に直接水酸基を導入
することは、従来から可能であった。すなわち、1α位
に直接水酸基を導入する場合、ニワトリなどの動物の腎
のホモジネートやミドフンドリア画分を用いる方法[ネ
ーチャー(Nature)、第230巻、第228頁(
1971年)、ジャーナルオブバイオロジカルケミスト
リ=(J、 Biolog。
タミンD類の1α及び/又は25位に直接水酸基を導入
することは、従来から可能であった。すなわち、1α位
に直接水酸基を導入する場合、ニワトリなどの動物の腎
のホモジネートやミドフンドリア画分を用いる方法[ネ
ーチャー(Nature)、第230巻、第228頁(
1971年)、ジャーナルオブバイオロジカルケミスト
リ=(J、 Biolog。
Cheffi、 ) 、第247巻、第7528頁(1
972年)、バイオケミストリー(Biochemis
try)、第25巻、第5512頁(1986年)など
]が知られている。また、25位に直接水酸基を導入す
る場合、ラットなどの動物の単離した肝臓にビタミンD
類を含む溶液を潅流させる方法[ジャーナルオブクリニ
カルインベステイゲーション(J、 C11n、 In
vest、 ) 、第48巻、第2032頁(1969
年)、バイオケミカルアンドバイオフィジカル リサー
チ コミュニケーション(Biochem。
972年)、バイオケミストリー(Biochemis
try)、第25巻、第5512頁(1986年)など
]が知られている。また、25位に直接水酸基を導入す
る場合、ラットなどの動物の単離した肝臓にビタミンD
類を含む溶液を潅流させる方法[ジャーナルオブクリニ
カルインベステイゲーション(J、 C11n、 In
vest、 ) 、第48巻、第2032頁(1969
年)、バイオケミカルアンドバイオフィジカル リサー
チ コミュニケーション(Biochem。
Biophys、 Res、 Commun、 )、第
66巻、第632頁(1975年)]やラットなどの動
物の肝のホモジネートを用いる方法[バイオケミカルア
ンドバイオフィジカルリサーチ コミュニケーション(
Biochem、 Biophys。
66巻、第632頁(1975年)]やラットなどの動
物の肝のホモジネートを用いる方法[バイオケミカルア
ンドバイオフィジカルリサーチ コミュニケーション(
Biochem、 Biophys。
Res、Commun、 ) 、第36巻、第251頁
(1969年)コが知られている。
(1969年)コが知られている。
発明が解決しようとする課
しかしながら、動物臓器を用いた酵素化学的方法では、
多量の動物の腎又は肝が必要であり、しかもその調製に
手間がかかり、非効率的で実用的な製造法ではない。
多量の動物の腎又は肝が必要であり、しかもその調製に
手間がかかり、非効率的で実用的な製造法ではない。
本発明は、より容易な操作による1α−及び/又は25
−ヒドロキシビタミンD類を得る方法を提供することを
目的とする。
−ヒドロキシビタミンD類を得る方法を提供することを
目的とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、特定の微生物を利用することにより、ビ
タミンD類の1α及び/又は25位に直接水酸基を導入
できることを見出し、本発明を完成した。
タミンD類の1α及び/又は25位に直接水酸基を導入
できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、ビタミンD類を水酸化する放線菌菌体又はそ
の産生する酵素を含有する溶液中に1α又は25位に水
MM子を有するビタミンD類を加えて、それぞれその水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする1α−ヒド
ロキシビタミンD類又は25−ヒドロキシビタミンD類
の製造方法、並びにビタミンD類を水酸化する放線菌菌
体又はその産生ずる酵素を含有する溶液中に1α及び2
5位に水素原子を有するビタミンD類を加えて、その水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする25−ヒド
ロキシビタミンDM又は1α。
の産生する酵素を含有する溶液中に1α又は25位に水
MM子を有するビタミンD類を加えて、それぞれその水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする1α−ヒド
ロキシビタミンD類又は25−ヒドロキシビタミンD類
の製造方法、並びにビタミンD類を水酸化する放線菌菌
体又はその産生ずる酵素を含有する溶液中に1α及び2
5位に水素原子を有するビタミンD類を加えて、その水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする25−ヒド
ロキシビタミンDM又は1α。
25−ジヒドロキシビタミンD類の製造方法である。す
なわち、本発明によれば、1α位又は25位に水素原子
を有するビタミンD類は、それぞれその水素原子が水酸
基に変換きれ、1α及び25位に水素原子を有するビタ
ミンD類は、まずその25位水素原子が水酸基に変換さ
れ、次いで、1α位が水酸基に変換される。
なわち、本発明によれば、1α位又は25位に水素原子
を有するビタミンD類は、それぞれその水素原子が水酸
基に変換きれ、1α及び25位に水素原子を有するビタ
ミンD類は、まずその25位水素原子が水酸基に変換さ
れ、次いで、1α位が水酸基に変換される。
本発明の製造方法は、ビタミンD類の1α及び/又は2
5位に直接、1工程で水酸基を導入する方法であり、1
α又は25位以外にいずれの置換基を有していてもよい
、従って、本発明においてビタミンD類とは、たとえば
、ビタミンD、系及びビタミンD、系の化合物であり、
その17位側鎖の水素原子又は水酸基がフッ素などのハ
ロゲン原子、水酸基、低級アルキル基などで置換きれて
いてもよい。原料のビタミンD類の1α又は25位は、
これが水素原子以外のときは水酸基であることが好まし
い。それらは、たとえば、ビタミンD!、ビタミンD8
.1α−ヒドロキシビタミンDいlα、24−ジヒドロ
キシビタミンDs、25−ヒドロキシビタミンDA、2
5−ヒドロキシビタミンD3.24.25−ジヒドロキ
シビタミンD、、23.25−ジヒド「Jキシビタミン
D、、25.26−ジヒドロキシビタミンD3.23.
24.25−トリとドロキシビタミンD8.24.24
−ジフルオロ−25−ヒドロキシ−26,27−シメチ
ルビタミンD8.25−ヒドロキシ−26,26,26
,27゜27.27−ヘキサフルオロビタミンD、など
である。
5位に直接、1工程で水酸基を導入する方法であり、1
α又は25位以外にいずれの置換基を有していてもよい
、従って、本発明においてビタミンD類とは、たとえば
、ビタミンD、系及びビタミンD、系の化合物であり、
その17位側鎖の水素原子又は水酸基がフッ素などのハ
ロゲン原子、水酸基、低級アルキル基などで置換きれて
いてもよい。原料のビタミンD類の1α又は25位は、
これが水素原子以外のときは水酸基であることが好まし
い。それらは、たとえば、ビタミンD!、ビタミンD8
.1α−ヒドロキシビタミンDいlα、24−ジヒドロ
キシビタミンDs、25−ヒドロキシビタミンDA、2
5−ヒドロキシビタミンD3.24.25−ジヒドロキ
シビタミンD、、23.25−ジヒド「Jキシビタミン
D、、25.26−ジヒドロキシビタミンD3.23.
24.25−トリとドロキシビタミンD8.24.24
−ジフルオロ−25−ヒドロキシ−26,27−シメチ
ルビタミンD8.25−ヒドロキシ−26,26,26
,27゜27.27−ヘキサフルオロビタミンD、など
である。
本発明に使用される放n!2とは、ビタミンDMの1α
及び/又は25位に水酸基を導入する能力を有する放線
菌である。それらは、たとえば、アクチツマジュラ(A
ctinomadura )属、ロドコッカス(Rho
dococcus )属、チャイニア(Chainia
)!、ストレプトパーティシリウム(Stre tov
erticillium)属、アクチノプラネス(酸見
μ遍匹胡)属、アクチノプラネス(Actino 1a
nes)属、ミクロモノスポラ(Micromonos
ora)属、ノカルジア(Nocardia )属、
ストレプトマイセス〈兆匹匹印パ朋)属などに属するも
のであり、好ましくは、本発明者らが埼玉県大宮市の土
壌より新たに分離した菌株であり、微生物の名称及び記
号1ストレプトマイセス・スクレロチアラスT−JSI
(兆朋匹叩バ朋5clerotialus T −J
S 1 )J及び1微生物の保管受託番号第1370号
(FERM BP−1370)、として工業技術院微生
物工業研究所に寄託されているもの、本発明者らが山梨
県南部留郡鳥沢村の土壌より新たに分離した菌株であり
、微生物の名称1ストレプトマイセス・ロゼオスポラス
A−5797(Stre tom cesg朋A−57
97)J及び1微生物の保管受託番号第1574号(F
ERM BP−1574)Jとして工業技術院微生物工
業研究所に寄託されているもの、又は、本発明者らが埼
玉県大宮市の土壌より新たに分離した菌株であり、微生
物の名称1ノカルジア・オウトトロヒカN −102(
Nocardia 肚印竺並垣ca N −102)J
及び1微生物の保管受託番号第1573号(FEB13
8P−1573)、として工業技術院微生物工業研究所
に寄託されているものである。
及び/又は25位に水酸基を導入する能力を有する放線
菌である。それらは、たとえば、アクチツマジュラ(A
ctinomadura )属、ロドコッカス(Rho
dococcus )属、チャイニア(Chainia
)!、ストレプトパーティシリウム(Stre tov
erticillium)属、アクチノプラネス(酸見
μ遍匹胡)属、アクチノプラネス(Actino 1a
nes)属、ミクロモノスポラ(Micromonos
ora)属、ノカルジア(Nocardia )属、
ストレプトマイセス〈兆匹匹印パ朋)属などに属するも
のであり、好ましくは、本発明者らが埼玉県大宮市の土
壌より新たに分離した菌株であり、微生物の名称及び記
号1ストレプトマイセス・スクレロチアラスT−JSI
(兆朋匹叩バ朋5clerotialus T −J
S 1 )J及び1微生物の保管受託番号第1370号
(FERM BP−1370)、として工業技術院微生
物工業研究所に寄託されているもの、本発明者らが山梨
県南部留郡鳥沢村の土壌より新たに分離した菌株であり
、微生物の名称1ストレプトマイセス・ロゼオスポラス
A−5797(Stre tom cesg朋A−57
97)J及び1微生物の保管受託番号第1574号(F
ERM BP−1574)Jとして工業技術院微生物工
業研究所に寄託されているもの、又は、本発明者らが埼
玉県大宮市の土壌より新たに分離した菌株であり、微生
物の名称1ノカルジア・オウトトロヒカN −102(
Nocardia 肚印竺並垣ca N −102)J
及び1微生物の保管受託番号第1573号(FEB13
8P−1573)、として工業技術院微生物工業研究所
に寄託されているものである。
これらの菌株の菌学的性状を以下に示す。
a、ストレプトマイセス・スクレロテアラスT−J S
1 1)形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地において分岐
しながらよく発達する。気菌糸はイースト麦芽寒天培地
、オートミール寒天培地、スターチ無機塩寒天培地、グ
リセリン・アスパラギン寒天培地でわずかに形成される
。胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で螺旋状の胞子連
鎖形態を呈する。13子は通常10個以上の連鎖が認め
られ表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で、その太
ききは0.57〜1.OXo、64〜1.4Pである。
1 1)形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地において分岐
しながらよく発達する。気菌糸はイースト麦芽寒天培地
、オートミール寒天培地、スターチ無機塩寒天培地、グ
リセリン・アスパラギン寒天培地でわずかに形成される
。胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で螺旋状の胞子連
鎖形態を呈する。13子は通常10個以上の連鎖が認め
られ表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で、その太
ききは0.57〜1.OXo、64〜1.4Pである。
螺旋状の胞子連鎖はスターチ・無機塩寒天培地で最もよ
く発達する。栄養菌糸には菌核が観察される。また、イ
ースト麦芽寒天培地で2週間培養した場合には胞子のう
に類似した形態を呈する胞子の集束が観察きれる。べん
毛胞子は観察されない。
く発達する。栄養菌糸には菌核が観察される。また、イ
ースト麦芽寒天培地で2週間培養した場合には胞子のう
に類似した形態を呈する胞子の集束が観察きれる。べん
毛胞子は観察されない。
2)培地上での生育状態
各種培地で28’C,14日間培養したときの肉眼的観
察結果を第1表に示す。
察結果を第1表に示す。
第1表
3)生理的性質
(1)生育温度範囲
スターチ・無機塩寒天培地上において25〜35°Cの
範囲で良好に生育する。
範囲で良好に生育する。
10℃以下、45℃以上の温度範囲では生育しない。
(り生化学的性質
a)好気性、嫌気性の区別; 好気性b)ゼラチンの
液化: 陽性 C)脱脂乳の凝固: 陰性 d)脱脂乳のペプトン化; 陽性 e)スターチの加水分解; 陽性 f)メラニン様色素生成; 陰性 (3)炭素源の利用 (ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地) 以下の炭素源すべてを利用する。
液化: 陽性 C)脱脂乳の凝固: 陰性 d)脱脂乳のペプトン化; 陽性 e)スターチの加水分解; 陽性 f)メラニン様色素生成; 陰性 (3)炭素源の利用 (ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地) 以下の炭素源すべてを利用する。
D−グルフース、D−フラクトース。
イノシトール、ガラクトース、スターチ。
シュクロース、ラムノース。
D−マンニット、L−アラビノース。
D−キシロース、ラフィノース
以上の性状から本菌株が放IIIに属することは明らか
であり、上記諸性状をI 、 S、 P、’インターナ
ショナル・ストレプトマイセス・ブロジェクトヨ。
であり、上記諸性状をI 、 S、 P、’インターナ
ショナル・ストレプトマイセス・ブロジェクトヨ。
バージ−著「マニュアル・才ブ・デイターミナテイプ・
バクテリオロジー」第8版(1974年)及びワックス
マン著rジ・アクチノミセテス」第2巻(1961年)
に報告きれている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はストレプトマイセス・スクレロチアテスに最も近い
性状を示していた。
バクテリオロジー」第8版(1974年)及びワックス
マン著rジ・アクチノミセテス」第2巻(1961年)
に報告きれている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はストレプトマイセス・スクレロチアテスに最も近い
性状を示していた。
以上の結果より、本菌株はストレプトマイセス・スクレ
ロチアラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はス
トレプトマイセス・スクレロチアラス T−J S 1
と命名した。
ロチアラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はス
トレプトマイセス・スクレロチアラス T−J S 1
と命名した。
b、ストレプトマイセス・ロゼオスポラスA −579
7 1)形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、亀子はグリセリン・アスパラギン寒天培地、スターチ
無機塩寒天培地及びオートミール寒天培地などで良好に
形成される6w4微鏡で観察すると胞子形成菌糸の分岐
方法は単純分岐で胞子は直鎖状に形成きれる。胞子は通
常10個以−ヒの連鎖が認められ、培養の後期には長い
鎖状を呈し、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で
、その太ききは0.67〜0.75X 1.30〜1.
584である。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察きれ
ない。
7 1)形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、亀子はグリセリン・アスパラギン寒天培地、スターチ
無機塩寒天培地及びオートミール寒天培地などで良好に
形成される6w4微鏡で観察すると胞子形成菌糸の分岐
方法は単純分岐で胞子は直鎖状に形成きれる。胞子は通
常10個以−ヒの連鎖が認められ、培養の後期には長い
鎖状を呈し、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で
、その太ききは0.67〜0.75X 1.30〜1.
584である。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察きれ
ない。
2)培地上での生育状態
各種培地で30°C114日間培養したときの南限的観
察結果を第2表に示す。
察結果を第2表に示す。
第2表
3)生理的性質
(υ生育温度範囲
オートミール寒天培地上において20〜30℃c7)Q
[囲で良好に生育する。
[囲で良好に生育する。
10°C以下、40°C以上の温度範囲では生育しない
。
。
(り生化学的性質
a)好気性、嫌気性の区別; 好気性b)ゼラチンの
液化; 陽性 C)脱脂乳の凝固; 陰性 d)脱脂乳のペプトン化; 陽性 e)スターチの加水分解; 陽性 f)メラニン様色素生成; 陰性 g)細胞壁タイプ; I型(3)炭素源の
利用 (ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地) 利用する二叶グルコース、L−アラビノース。
液化; 陽性 C)脱脂乳の凝固; 陰性 d)脱脂乳のペプトン化; 陽性 e)スターチの加水分解; 陽性 f)メラニン様色素生成; 陰性 g)細胞壁タイプ; I型(3)炭素源の
利用 (ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地) 利用する二叶グルコース、L−アラビノース。
叶キシロース
、F)ずかに利用する=D−フラクトース。
ラムノース
利用しない:シュクロース、イノシトール。
ラフィノース、D−マンニット
以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らかで
あり、上記諸性状を1.S、P、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」、バージ−著1
マニュアル・オブ・ディターミナティブ・バクテリオロ
ジー」第8版(1974年)及びワックスマン著1ジ・
アクチノミセテス」第2巻(1961年)に報告諮れて
いる多くの既知菌種と比較した結果、本菌株はストレプ
トマイセス・ロゼオスポラスに最も近い性状を示してい
た。
あり、上記諸性状を1.S、P、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」、バージ−著1
マニュアル・オブ・ディターミナティブ・バクテリオロ
ジー」第8版(1974年)及びワックスマン著1ジ・
アクチノミセテス」第2巻(1961年)に報告諮れて
いる多くの既知菌種と比較した結果、本菌株はストレプ
トマイセス・ロゼオスポラスに最も近い性状を示してい
た。
以上の結果より、本菌株はストレプトマイセス・ロゼオ
スポラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はスト
レプトマイセス・ロゼオスポラスA−5797と命名し
た。
スポラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はスト
レプトマイセス・ロゼオスポラスA−5797と命名し
た。
C,ノカルジア・オウトトロヒカN−1021)形態
栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地及びスター
チ無機寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡で観察
すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で胞子は直鎖
状に形成される。胞子は通常3個以上の連鎖が認められ
、培養の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑である。
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地及びスター
チ無機寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡で観察
すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で胞子は直鎖
状に形成される。胞子は通常3個以上の連鎖が認められ
、培養の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑である。
胞子の形状は円筒形で、その大きさは0.5〜0.8×
2.5〜4.3Pである。菌核、胞子のう、べん毛胞子
はfi察されない。
2.5〜4.3Pである。菌核、胞子のう、べん毛胞子
はfi察されない。
2)培地上での生育状態
各種培地で30°C514日間培養したときの肉眼的観
察結果を第3表に示す。
察結果を第3表に示す。
第3表
/
/′
/
、/
/
/
3)生理的性質
(1)生育温度範囲
栄養寒天培地上において20〜30°Cの範囲で良好に
生育する。
生育する。
10℃以下、40℃以上の温度範囲では生育しない。
(り生化学的性質
a)好気性、嫌気性の区別; 好気性b)ゼラチンの
液化; 陰性 C)脱脂乳の凝固; 陰性 d)脱脂乳のペプトン化; 陰性 C〉スターチの加水分解; 陰性 f)メラニン様色素生成; 陰性 g)硝酸還元能; 陰性 0)炭素源の利用 (ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地) 利用する=D−グルコース、L−アラビノース。
液化; 陰性 C)脱脂乳の凝固; 陰性 d)脱脂乳のペプトン化; 陰性 C〉スターチの加水分解; 陰性 f)メラニン様色素生成; 陰性 g)硝酸還元能; 陰性 0)炭素源の利用 (ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地) 利用する=D−グルコース、L−アラビノース。
シュクロース、D−キシロース。
L−イノシトール、D−マニトース。
D−フラクトース、ラムノース
わずかに利用する:ラフィノース
以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らかで
あり、上記諸性状を1.S、P、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」。
あり、上記諸性状を1.S、P、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」。
バージ−著「マニュアル・才ブ・ディターミナティブ・
バクテリオロジー、第8版(1974年)及びワックス
マン著1ジ・アクチノミセテス」第2巻(1961年)
に報告されている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はノカルジア・オウトトOヒ力に最も近い性状を示し
ていた。
バクテリオロジー、第8版(1974年)及びワックス
マン著1ジ・アクチノミセテス」第2巻(1961年)
に報告されている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はノカルジア・オウトトOヒ力に最も近い性状を示し
ていた。
以上の結果より、本菌株はノカルジア・オウトトロヒ力
と種を同じくするものと判断し、本菌株はノカルジア・
オウトトロヒカN−102と命名した。
と種を同じくするものと判断し、本菌株はノカルジア・
オウトトロヒカN−102と命名した。
本発明の方法は、放線菌の菌体又はその産生ずる酵素を
含有する溶液中で、基質ビタミンD類を好気的条件下で
反応きせることによって行うものである。
含有する溶液中で、基質ビタミンD類を好気的条件下で
反応きせることによって行うものである。
反応に必要な放線菌の菌体を得るためには、好気条件下
で本閑の培養を培地中で行う。
で本閑の培養を培地中で行う。
培地は主として液体培地を用い、炭素源としてグルコー
ス、マルトース、デキストロース、スターチ、アラビノ
ース、キシロースを単独又は混合して用いる。窒素源と
しては、ボリペブ)・ン。
ス、マルトース、デキストロース、スターチ、アラビノ
ース、キシロースを単独又は混合して用いる。窒素源と
しては、ボリペブ)・ン。
カサミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンステーブリ
カー及びソイビーンミールなどを単独又は混合して用い
る。その他、本菌株の生育を助け、1α−及び/又は2
5−ヒドロキシビタミンD類の生産を促進する有機物及
び無機塩を必要番こより添加することができる。培養方
法は振とう培養、通気攪拌培養などの好気培養が適して
おり、pH6〜7.4.28〜30℃で2〜8日間培養
する。
カー及びソイビーンミールなどを単独又は混合して用い
る。その他、本菌株の生育を助け、1α−及び/又は2
5−ヒドロキシビタミンD類の生産を促進する有機物及
び無機塩を必要番こより添加することができる。培養方
法は振とう培養、通気攪拌培養などの好気培養が適して
おり、pH6〜7.4.28〜30℃で2〜8日間培養
する。
この培養により得られた菌体を含有する溶液を、1α−
及び/又は25−ヒドロキシビタミンD類を生産する反
応に用いる。すなわち、培養中の菌体を含む培養液をそ
のまま用いるか、培養終了後、遠心分離又はU過により
分離した菌体を懸濁した溶液を用いる。また、培養後に
得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除い
た溶液を用いる。きらにまた、菌体は光架橋性I61詣
プレポリマー、たとえばENT3400[商品名;関西
ペイント(株)製]などや、ウレタン・プレポリマー、
たとえばPU−9[商品名;東洋ゴム(株)製]などや
に一カラギナンなどの多糖類に固定化してから溶液に添
加してもよい。
及び/又は25−ヒドロキシビタミンD類を生産する反
応に用いる。すなわち、培養中の菌体を含む培養液をそ
のまま用いるか、培養終了後、遠心分離又はU過により
分離した菌体を懸濁した溶液を用いる。また、培養後に
得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除い
た溶液を用いる。きらにまた、菌体は光架橋性I61詣
プレポリマー、たとえばENT3400[商品名;関西
ペイント(株)製]などや、ウレタン・プレポリマー、
たとえばPU−9[商品名;東洋ゴム(株)製]などや
に一カラギナンなどの多糖類に固定化してから溶液に添
加してもよい。
また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同様に用い
ることもできる。
ることもできる。
本発明において用いられる溶液は、前記培地であるか、
あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリ
ウムーフハク酸、フハク酸カリウムーフハク酸、クエン
酸ナトリウム−クエン酸、リン酸、カコジル酸ナトリウ
ム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの
緩衝液を弔独又は混合したものである。その他、緩衝液
には、目的のビタミンD類の生産を促進する界面活性剤
、有機物及び無機塩を必要により添加することができる
。
あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリ
ウムーフハク酸、フハク酸カリウムーフハク酸、クエン
酸ナトリウム−クエン酸、リン酸、カコジル酸ナトリウ
ム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの
緩衝液を弔独又は混合したものである。その他、緩衝液
には、目的のビタミンD類の生産を促進する界面活性剤
、有機物及び無機塩を必要により添加することができる
。
本発明の製造方法は、前記菌体を含有する溶液中で振と
う操作、通気攪拌操作などに付して好気条件下で行うこ
とが適しており、pH5〜8.20〜37°Cで5分間
〜96時間攪拌振とうする。また、酸素気流下で反応す
ることができる。基質のビタミンD類は攪拌振とう開始
時に適量添加する。
う操作、通気攪拌操作などに付して好気条件下で行うこ
とが適しており、pH5〜8.20〜37°Cで5分間
〜96時間攪拌振とうする。また、酸素気流下で反応す
ることができる。基質のビタミンD類は攪拌振とう開始
時に適量添加する。
また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は、基質
ビタミンD類を添加後、更に同条件下で24〜96時間
培養して本反応を行う。
ビタミンD類を添加後、更に同条件下で24〜96時間
培養して本反応を行う。
なお、1α及び25位に水素原子を有するビタミンD類
を原料とする場合、後記の高速液体クロマトグラフィー
等で生成物を確認して反応時間をさめ、25−ヒドロキ
シビタミンD類又は1α。
を原料とする場合、後記の高速液体クロマトグラフィー
等で生成物を確認して反応時間をさめ、25−ヒドロキ
シビタミンD類又は1α。
25−ジヒドロキシビタミンD類をそれぞれ製造するこ
とができる。
とができる。
これらの反応により製造されたビタミンD類を/It
PILするには、血液中からビタミンD類を採取する一
般的な方法に準じて行えばよい。たとえば、反応終了後
、反応液を有機溶媒により抽出し、濃縮乾固する。これ
を2−プロパノ−ルーn−ヘキサンなどの適当な溶媒に
溶解し、遠心分離により不溶物を除いた後、シリカゲル
順層カラム(たとえば、ゾルパックスSIL、米国デュ
ポン社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー又はシ
リカゲル逆層カラム(たとえば、ゾルパックスODS。
PILするには、血液中からビタミンD類を採取する一
般的な方法に準じて行えばよい。たとえば、反応終了後
、反応液を有機溶媒により抽出し、濃縮乾固する。これ
を2−プロパノ−ルーn−ヘキサンなどの適当な溶媒に
溶解し、遠心分離により不溶物を除いた後、シリカゲル
順層カラム(たとえば、ゾルパックスSIL、米国デュ
ポン社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー又はシ
リカゲル逆層カラム(たとえば、ゾルパックスODS。
米国デュポン社製)を用いた高速液体クロマトグラフィ
ーに付すことにより目的のヒドロキシビタミンD類を単
離することができる。
ーに付すことにより目的のヒドロキシビタミンD類を単
離することができる。
発明の効果
本発明の方法により、ビタミンD類のlα及び/又は2
5位へ直接水酸基を導入することが可能になった。すな
わち、本発明の微生物を用いる方法では、微生物や反応
溶液などの調製に手間がかからず、しかも1段階で短時
間に行うことができ、極めて容易かつ能率的である。
5位へ直接水酸基を導入することが可能になった。すな
わち、本発明の微生物を用いる方法では、微生物や反応
溶液などの調製に手間がかからず、しかも1段階で短時
間に行うことができ、極めて容易かつ能率的である。
及履刻
以下、実施例及び試験例をあげて本発明をきらに詳細に
説明する。
説明する。
実施例1
スターf1%、マルトース1%、デキストリン1%、ソ
イビーンミール1.5%、肉エキス0.3%、カザミノ
酸0.5%、炭酸カルシウム0.4%、 pH7,0の
無菌液体培地50dの入った500mQの三角フラスコ
5本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロデアラ
スT−J S 1を1白金耳ずつ接種し、30°Cで4
8時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心
分離して菌体を集め、この菌体を15mMトリス−酢酸
、25mMコハク酸ナトリウム、2mM酢酸マグネシウ
ム及び200mMシュクロースからなるpH7,4の緩
衝液(以下、緩衝液Aと略す)200dに懸濁し、il
Tびこの懸濁液を遠心分離して菌体を集めた。この菌体
をきらにtift衝液A 200mQに充分攪拌して懸
濁し、500m1lの三角フラスコ5本にそれぞれ40
r+tllずつ分注し、30℃で5分間保温した。その
三角フラスコ5木のそれぞれに400−のエタノールに
溶解した400題の基125−ヒドロキシビタミンD、
を添加し、30″Cで45分間攪拌振とうした。各三角
フラスコの反応液を集め、塩化メチレン11で抽出し、
塩化メチレン后を40°C以下で減圧乾固後、直ちに2
−プロパツール:n−ヘキtン;1:9の混合溶媒7.
5mlに溶解し、−20℃で3時間放置した。これを遠
心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清液
を40℃以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフ
ィー[ゾルバ・/クスSIL、米国デュポン社製]に付
した。
イビーンミール1.5%、肉エキス0.3%、カザミノ
酸0.5%、炭酸カルシウム0.4%、 pH7,0の
無菌液体培地50dの入った500mQの三角フラスコ
5本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロデアラ
スT−J S 1を1白金耳ずつ接種し、30°Cで4
8時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心
分離して菌体を集め、この菌体を15mMトリス−酢酸
、25mMコハク酸ナトリウム、2mM酢酸マグネシウ
ム及び200mMシュクロースからなるpH7,4の緩
衝液(以下、緩衝液Aと略す)200dに懸濁し、il
Tびこの懸濁液を遠心分離して菌体を集めた。この菌体
をきらにtift衝液A 200mQに充分攪拌して懸
濁し、500m1lの三角フラスコ5本にそれぞれ40
r+tllずつ分注し、30℃で5分間保温した。その
三角フラスコ5木のそれぞれに400−のエタノールに
溶解した400題の基125−ヒドロキシビタミンD、
を添加し、30″Cで45分間攪拌振とうした。各三角
フラスコの反応液を集め、塩化メチレン11で抽出し、
塩化メチレン后を40°C以下で減圧乾固後、直ちに2
−プロパツール:n−ヘキtン;1:9の混合溶媒7.
5mlに溶解し、−20℃で3時間放置した。これを遠
心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清液
を40℃以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフ
ィー[ゾルバ・/クスSIL、米国デュポン社製]に付
した。
’ffl 出m 媒; 2−プロパツール:n−ヘキサ
ン=1 : 9 。
ン=1 : 9 。
カラム温度;25°C2溶出速度;1.5ynQ/分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大揺電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた0次に
これを40″C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製]に
付した。
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた0次に
これを40″C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製]に
付した。
溶出溶媒;水:メタノール=1:9゜
カラム温度; 40”C、溶出速度;1.0m1l/分
。
。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大揺電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD、
を200(得た。 これは市販の1α、25−ジヒドa
キシビタミンD、(デュファー社製、オランダ)の標品
と液体クロマトグラフィ−の保持時間[ゾルバ・7クス
SIL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開
裂/くターンが完全に一致した。
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD、
を200(得た。 これは市販の1α、25−ジヒドa
キシビタミンD、(デュファー社製、オランダ)の標品
と液体クロマトグラフィ−の保持時間[ゾルバ・7クス
SIL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開
裂/くターンが完全に一致した。
最大紫外部吸収:
λmaz” 265 nm(エタノール)E I−MS
(m/z): 416(M”) 、 398(M”−H,O) 、 3
80(M”−2H!O) 。
(m/z): 416(M”) 、 398(M”−H,O) 、 3
80(M”−2H!O) 。
287 、269 、251 、152 、134 、
129 、116 、111 。
129 、116 、111 。
実施例2
実施例1と同様にして、24.25−ジヒドロキシビタ
ミンD、から1α、 24.25−トリヒドロキシビタ
ミンD、を得た。
ミンD、から1α、 24.25−トリヒドロキシビタ
ミンD、を得た。
実施例1と同条件の高速液体クロマトグラフィー[ゾル
パックスSIL]における保持時間は、29.4分であ
った。
パックスSIL]における保持時間は、29.4分であ
った。
最大紫外部吸収:
λ116z−265am(エタノール)E I −M
S(m/z): 432(M”) 、 414(M”−Hlo> 、 3
96(M”−2HfO) 。
S(m/z): 432(M”) 、 414(M”−Hlo> 、 3
96(M”−2HfO) 。
287.269.251.152,134.116.5
9実施例3 実施例1と同様にして、25−ヒドロキシビタミンD、
から1α、25−ジヒドロキシビタミンD、を得た。
9実施例3 実施例1と同様にして、25−ヒドロキシビタミンD、
から1α、25−ジヒドロキシビタミンD、を得た。
実施例1と同条件の高速液体クロマトグラフィー[ゾル
パックスSIL]における保持時間は、14.4分であ
った。
パックスSIL]における保持時間は、14.4分であ
った。
最大紫外部吸収:
λmaz= 265 nm(エタノール)E I−MS
(m/z): 428(M”) 、 410(M”−H*0) 、 3
92(M”−28tO) 。
(m/z): 428(M”) 、 410(M”−H*0) 、 3
92(M”−28tO) 。
287 、269 、251 、152 、134 、
116 、59実施例4 実施例1と同様にして、 24.24−ジフルオロ−2
5−ヒドロキシ−26,27−シメチルビタミンD、か
ら1α、25−ジヒドロキシ−24,24−ジフルオロ
−26,27−シメチルビタミンD、を得た。
116 、59実施例4 実施例1と同様にして、 24.24−ジフルオロ−2
5−ヒドロキシ−26,27−シメチルビタミンD、か
ら1α、25−ジヒドロキシ−24,24−ジフルオロ
−26,27−シメチルビタミンD、を得た。
最大紫外部吸収:
λwax” 265 nm(r、タノール)E I−M
S(m/z): 480(M”) 、 287 、269.251 、1
52.134 、116実施例5 実施例1と同様にして、25−ヒドロキシ−26,26
゜26、27.27.27−ヘキサフルオロビタミンD
、から1α、25−ジヒドロキシ−26,26,26,
27,27,27−ヘキサフルオロビタミンD、を得た
。
S(m/z): 480(M”) 、 287 、269.251 、1
52.134 、116実施例5 実施例1と同様にして、25−ヒドロキシ−26,26
゜26、27.27.27−ヘキサフルオロビタミンD
、から1α、25−ジヒドロキシ−26,26,26,
27,27,27−ヘキサフルオロビタミンD、を得た
。
最大紫外部吸収:
λmax−265nm(エタノール)
E I−MS(m/z):
524(M”) 、 287 、269 、251 、
152 、134 、116実施例6 グルコース1.5%、ソイビーンミール1.5%、コー
ンスチーブリ力−0,5%、塩化ナトリウム05デ≦、
炭酸カルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地5
0m1の入った500m1lの三角フラスコ5本のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスA −57
97を1白金耳ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を15mM トリス−酢酸、25mM
フハク酸ナトリウム及び2mM酢酸マグネシウムからな
るpH7,4の緩衝液(以下、緩衝液Bと略す)200
mlに懸濁し、ストレプトマイセス・ロゼオスポラスA
−5797の菌懸濁液を調製した。この菌懸渭液を再び
遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液B
200m1lに充分攪拌して懸濁し、500m1lの
三角フラスコ5本にそれぞれ40m1lずつ分注し、3
0°Cで5分間保温した。その三角フラスコ5本のそれ
ぞれに1004のエタノールに溶解したzoo、gの基
質25−ヒドロキシビタミンD、をfli 加し、30
°Cで90分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応
液を集め、塩化メチレン11で抽出し、塩化メチレン層
を40’C以下で減圧乾固後、直ちに2−プロパツール
:n−ヘキサン−1:9の混合溶媒7.5mlに溶解し
、−20℃で3時間放置した。
152 、134 、116実施例6 グルコース1.5%、ソイビーンミール1.5%、コー
ンスチーブリ力−0,5%、塩化ナトリウム05デ≦、
炭酸カルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地5
0m1の入った500m1lの三角フラスコ5本のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスA −57
97を1白金耳ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を15mM トリス−酢酸、25mM
フハク酸ナトリウム及び2mM酢酸マグネシウムからな
るpH7,4の緩衝液(以下、緩衝液Bと略す)200
mlに懸濁し、ストレプトマイセス・ロゼオスポラスA
−5797の菌懸濁液を調製した。この菌懸渭液を再び
遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液B
200m1lに充分攪拌して懸濁し、500m1lの
三角フラスコ5本にそれぞれ40m1lずつ分注し、3
0°Cで5分間保温した。その三角フラスコ5本のそれ
ぞれに1004のエタノールに溶解したzoo、gの基
質25−ヒドロキシビタミンD、をfli 加し、30
°Cで90分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応
液を集め、塩化メチレン11で抽出し、塩化メチレン層
を40’C以下で減圧乾固後、直ちに2−プロパツール
:n−ヘキサン−1:9の混合溶媒7.5mlに溶解し
、−20℃で3時間放置した。
これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。こ
の上清液を40’C以下で減圧下濃縮し、高速ン1クロ
マトグラフィー[ジノしパックスSIL。
の上清液を40’C以下で減圧下濃縮し、高速ン1クロ
マトグラフィー[ジノしパックスSIL。
米国デュポン社製]に付した。
rN 出m 媒; 2−プロパツール:n−ヘキサン−
1:9I カラム温度;25“C9溶出速度;1.5d/分。
1:9I カラム温度;25“C9溶出速度;1.5d/分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大極電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間15.4分付近のピークの画分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製]に
付した。
保持時間15.4分付近のピークの画分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製]に
付した。
溶出溶媒;水:メタノール−1:9゜
カラム温度、 40’C、溶出速度;1.0m97分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大極電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間5.6分付近のピークの画分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD、
を200尾得九0 これは市販の1α、25−ジヒドロ
キシビタミンD、(デュファー社製2オンンダ)の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパックスS
IL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。
保持時間5.6分付近のピークの画分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD、
を200尾得九0 これは市販の1α、25−ジヒドロ
キシビタミンD、(デュファー社製2オンンダ)の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパックスS
IL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。
最大紫外部吸収:
λll16x” 265 no+(エタノ−ル)E r
−MS(m/z): 416(M”) 、 39J3(M”−H,O) 、
380(M”−2H,O) 。
−MS(m/z): 416(M”) 、 39J3(M”−H,O) 、
380(M”−2H,O) 。
287 、269 、251 、152 、134 、
129 、116 、111 。
129 、116 、111 。
実施例7
グルコース1.5%、ソイビーンミール1.5%、コー
ンスデーブリカ−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、
炭酸カルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地5
0m1の入った500mQの三角フラスコ5本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカN−102を1白金耳
ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振とう培養した。
ンスデーブリカ−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、
炭酸カルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地5
0m1の入った500mQの三角フラスコ5本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカN−102を1白金耳
ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振とう培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、この菌
体を緩衝液B 200mHに懸濁し、ノカルジア・オウ
トトロヒカN−102の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさら
に緩衝液B 200mQに充分攪拌して懸濁し、500
mQの三角フラスコ5本にそれぞれ40m1ずつ分注し
、30℃で5分間保温した。その三角フラスコ5本のそ
れぞれに100μのエタノールに溶解した200尾の基
質25−ヒドロキシビタミンD、を添加し、30’Cで
45分間攪拌振とうした。
体を緩衝液B 200mHに懸濁し、ノカルジア・オウ
トトロヒカN−102の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさら
に緩衝液B 200mQに充分攪拌して懸濁し、500
mQの三角フラスコ5本にそれぞれ40m1ずつ分注し
、30℃で5分間保温した。その三角フラスコ5本のそ
れぞれに100μのエタノールに溶解した200尾の基
質25−ヒドロキシビタミンD、を添加し、30’Cで
45分間攪拌振とうした。
各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレン11で抽
出し、塩化メチレン届を40°C以下で減圧乾固後、直
ちに2−プロパツール:n−ヘキサン=1=9の混合溶
媒7.5mQに溶解し、−20°Cで3時間放置した。
出し、塩化メチレン届を40°C以下で減圧乾固後、直
ちに2−プロパツール:n−ヘキサン=1=9の混合溶
媒7.5mQに溶解し、−20°Cで3時間放置した。
これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。こ
の上清液を40°C以下で減圧下濃縮し、高速液体クロ
マトグラフィー[ゾルバ・ZクスSIL、米国デュポン
社製]に付した。
の上清液を40°C以下で減圧下濃縮し、高速液体クロ
マトグラフィー[ゾルバ・ZクスSIL、米国デュポン
社製]に付した。
溶出?11[;2−プロパツール:n−へキサ7 。
1=9゜
カラム温度;25°C1溶出速度H1,5m1l/分。
)オドダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大極電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンDMの紫外部吸収パターンと一致する
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS 、米国デュポン社製]
に付した。
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS 、米国デュポン社製]
に付した。
溶出溶媒;水:メタノール−1:9゜
カラム温度;40℃、溶出速度;1.(1mQ/分。
)オドダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大極電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD、
を100尾得尾得 これは市販の1α、25−ジヒドロ
キシビタミンD、(デュファ−社製、オランダ)の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパックスS
IL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD、
を100尾得尾得 これは市販の1α、25−ジヒドロ
キシビタミンD、(デュファ−社製、オランダ)の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパックスS
IL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。
最大紫外部吸収:
λmax= 265 nm(エタノール)E I −M
S(m/z)H 416(M”) 、 398(M”−11ffiO)
、 380(M”−2H!O) 。
S(m/z)H 416(M”) 、 398(M”−11ffiO)
、 380(M”−2H!O) 。
287 、269 、251 、152 、134 、
129 、116 、111 。
129 、116 、111 。
実施例8
スクーチ1%、マルトース1%、デキストリン1%、ソ
イビーンミール1.5%、肉エキス0.3%、カブミノ
酸0.5%、次階カルシウム0.4%、 1)H7,0
の無菌液体培地50m1lの入った500−の三角フラ
スコ5本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレi]
チアラスT−J S 1を1白金耳ずつ接種し、30°
Cで48時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌体を緩衝液A 20
0mQに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離して菌体を
集めた。 この菌体をきらに緩衝液B200m11に充
分攪拌して懸濁し、500m11の三角フラスコ5本に
それぞれ40dずつ分注し、30°Cで5分間保温した
。 その三角フラスコ5本のそれぞれに100μのエタ
ノールに溶解した200題の基質1α−ヒドロキシビタ
ミンD、を添加し、30℃で90分間攪拌振とうした。
イビーンミール1.5%、肉エキス0.3%、カブミノ
酸0.5%、次階カルシウム0.4%、 1)H7,0
の無菌液体培地50m1lの入った500−の三角フラ
スコ5本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレi]
チアラスT−J S 1を1白金耳ずつ接種し、30°
Cで48時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌体を緩衝液A 20
0mQに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離して菌体を
集めた。 この菌体をきらに緩衝液B200m11に充
分攪拌して懸濁し、500m11の三角フラスコ5本に
それぞれ40dずつ分注し、30°Cで5分間保温した
。 その三角フラスコ5本のそれぞれに100μのエタ
ノールに溶解した200題の基質1α−ヒドロキシビタ
ミンD、を添加し、30℃で90分間攪拌振とうした。
各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレン11で抽
出し、塩化メチレン層を40℃以下で減圧乾固後、直ち
に2−プロパツール:n−ヘキサン−1=9の混合溶媒
7.5mQに溶解し、−20°Cで3時間放置した。こ
れを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この
上清液を40°C以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー[ツルパックスSIL、米国デュポン社製
]に付した。
出し、塩化メチレン層を40℃以下で減圧乾固後、直ち
に2−プロパツール:n−ヘキサン−1=9の混合溶媒
7.5mQに溶解し、−20°Cで3時間放置した。こ
れを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この
上清液を40°C以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー[ツルパックスSIL、米国デュポン社製
]に付した。
溶出i媒;2−プロパツール:n−ヘキサン=1=9゜
カラム温度;25°C1溶出速度;1.5mQ/分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大扉電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製]に
付した。
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製]に
付した。
溶出溶媒;水:メタノール=1:9゜
カラム温度;40℃、溶出速度;1.0+nll/分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大扉電子社製)で1′!+q定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40″C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒド[1キシビタミンD
、を20Pg得た。 これは市販の1α、25−ジヒ
ドロキシビタミンD、(デュファー社製、オランダ)の
標品と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパック
ス5ILI、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40″C以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒド[1キシビタミンD
、を20Pg得た。 これは市販の1α、25−ジヒ
ドロキシビタミンD、(デュファー社製、オランダ)の
標品と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパック
ス5ILI、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。
最大紫外部吸収:
λ、ax= 265 nm(エタノール)E I−MS
(m/z): 416(M”) 、 398(M”−HtO) 、 3
80(M”−2H,O) 。
(m/z): 416(M”) 、 398(M”−HtO) 、 3
80(M”−2H,O) 。
287、269.251.152.134.129.1
16.111 。
16.111 。
実施例9
グルツース1.5%、ソイビーンミール1.5%、コー
ンスチーブリカ−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、
次階カルシウムO62%、pH7,0の無菌液体培地5
0m1lの入った500rdの三角フラスコ5木のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスA −57
97を1白金耳ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を緩衝液B 200rdに懸濁し、ス
トレプトマイセス・ロゼオスポラスA −5797の菌
懸濁液を調製した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌
体を集めた。この菌体をさらに緩衝液B200m1に充
分攪拌して懸濁し、 500m1lの三角フラスT15
本にそれぞれ40mQずつ分注し、30°Cで5分間保
温した。 その三角フラスコ5本のそれぞれに100−
のエタノールに溶解した200Pgの基質1α−ヒドロ
キシビタミンD、を添加し、30°Cで180分間攪拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチ
レン11で抽出し、塩化メチレン層を40°C以下で減
圧乾固後、直ちに2−プロパツール=n−ヘキサン=1
:9の混合溶媒7.5mQに溶解し、−20°Cで3時
間放置した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清
液を得た。この上清液を40°C以ドで減圧上濃縮し、
高速液体クロマトグラフィー[ゾルパックスSIL、米
国デュポン社製]に付した。
ンスチーブリカ−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、
次階カルシウムO62%、pH7,0の無菌液体培地5
0m1lの入った500rdの三角フラスコ5木のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスA −57
97を1白金耳ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を緩衝液B 200rdに懸濁し、ス
トレプトマイセス・ロゼオスポラスA −5797の菌
懸濁液を調製した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌
体を集めた。この菌体をさらに緩衝液B200m1に充
分攪拌して懸濁し、 500m1lの三角フラスT15
本にそれぞれ40mQずつ分注し、30°Cで5分間保
温した。 その三角フラスコ5本のそれぞれに100−
のエタノールに溶解した200Pgの基質1α−ヒドロ
キシビタミンD、を添加し、30°Cで180分間攪拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチ
レン11で抽出し、塩化メチレン層を40°C以下で減
圧乾固後、直ちに2−プロパツール=n−ヘキサン=1
:9の混合溶媒7.5mQに溶解し、−20°Cで3時
間放置した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清
液を得た。この上清液を40°C以ドで減圧上濃縮し、
高速液体クロマトグラフィー[ゾルパックスSIL、米
国デュポン社製]に付した。
溶出溶媒;2−プロバノールニn−ヘキサンエ1:9゜
カラム温度;25°C1溶出速度:1.5mQ/分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大揺電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間15.4分付近のピークの画分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスOD5.米国デュポン社製]に
付した。
保持時間15.4分付近のピークの画分を集めた。次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスOD5.米国デュポン社製]に
付した。
溶出溶媒;水:メタノール=1 : 9 。
カラム温度;40°C1溶出速度; L、Od/分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大揺電子社製〉で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD8を
50尾得た。 これは市販の1α、25−ジヒドロキ
シビタミンpm(デュファー社製、オランダ)の標品と
液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパックスSI
L]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂バ
クーンが完全に一致した。
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、1α、25−ジヒドロキシビタミンD8を
50尾得た。 これは市販の1α、25−ジヒドロキ
シビタミンpm(デュファー社製、オランダ)の標品と
液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルパックスSI
L]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂バ
クーンが完全に一致した。
最大紫外部吸収:
λmB−265r+m(エタノール)
E I −M S(m/z):
416(M”) 、 398(M”−Hlo) 、 3
80(M”−2H,O) 。
80(M”−2H,O) 。
287.269.251.152.134.129.1
16.111 。
16.111 。
実施@lO
グルコース1.5%、ソイビーンミール1.5%、フン
スチーブリ力−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、次
階カルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地50
m1lの入った500mQの三角フラスコ5本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカN−102を1白金耳
ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振とう培養した。
スチーブリ力−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、次
階カルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地50
m1lの入った500mQの三角フラスコ5本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカN−102を1白金耳
ずつ接種し、30°Cで48時間攪拌振とう培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、この菌
体を緩衝液B 200mQに懸濁し、ノカルシア・オウ
トトロヒカN−102の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をきら
に緩衝液B 200mQに充分攪拌して懸濁し、500
mQの三角フラスコ5木にそれぞれ40mQずつ分注し
、30°Cで5分間保温した。その三角フラスコ5本の
それぞれに100−のエタノールに溶解した200尾の
基質1α−ヒドロキシビタミンD、を添加し、30°C
で90分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応液を
集め、塩化メチレン11で抽出し、塩化メチレン層を4
0°C以下で減圧乾固後、直ちに2−プロパツール:n
−ヘキサン;1:9の混合溶媒7.5mlに溶解し、−
20℃で3時間放置した。これを遠心分離し不溶性画分
を除き、上清液を得た。この上清液を40°C以下で減
圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフィーしゾルパック
スSIL、米国デュポン社製コに付した。
体を緩衝液B 200mQに懸濁し、ノカルシア・オウ
トトロヒカN−102の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をきら
に緩衝液B 200mQに充分攪拌して懸濁し、500
mQの三角フラスコ5木にそれぞれ40mQずつ分注し
、30°Cで5分間保温した。その三角フラスコ5本の
それぞれに100−のエタノールに溶解した200尾の
基質1α−ヒドロキシビタミンD、を添加し、30°C
で90分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応液を
集め、塩化メチレン11で抽出し、塩化メチレン層を4
0°C以下で減圧乾固後、直ちに2−プロパツール:n
−ヘキサン;1:9の混合溶媒7.5mlに溶解し、−
20℃で3時間放置した。これを遠心分離し不溶性画分
を除き、上清液を得た。この上清液を40°C以下で減
圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフィーしゾルパック
スSIL、米国デュポン社製コに付した。
il[媒;2−プロパツール:n−へ−1−サン−1:
9゜ カラム温度;25°C1溶出速度;1.5mQ/分2)
オドダイオードアレイ検出器(MCPD 3500 。
9゜ カラム温度;25°C1溶出速度;1.5mQ/分2)
オドダイオードアレイ検出器(MCPD 3500 。
大揺電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた0次に
これを40°C以下で減圧atifiシ、高速液体クロ
マトグラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社
製]に付した。
保持時間15.4分付近のピークの両分を集めた0次に
これを40°C以下で減圧atifiシ、高速液体クロ
マトグラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社
製]に付した。
溶出溶媒;水:メタノール−1:9゜
カラム温度;4o’c、is出速度; 1.0m97分
。
。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
火源電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40’C以下で、窒素ガス置換しながら減圧a縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒド[1キンビタミンD
、を350尾得九0 これは市販の1α、25−ジヒド
ロキシビタミンDi(デュファー社製、オランダ)の標
品と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルバ・Zク
スSIL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。
保持時間5.6分付近のピークの両分を集めた。これを
40’C以下で、窒素ガス置換しながら減圧a縮乾固す
ることにより、1α、25−ジヒド[1キンビタミンD
、を350尾得九0 これは市販の1α、25−ジヒド
ロキシビタミンDi(デュファー社製、オランダ)の標
品と液体クロマトグラフィーの保持時間[ゾルバ・Zク
スSIL]、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。
最大紫外部吸収:
^□z= 265 nm(エタノール)E I−MS(
ffi/Z): 416(M”) 、 398(M”−HlO)、
380(M’−28*0)。
ffi/Z): 416(M”) 、 398(M”−HlO)、
380(M’−28*0)。
287、259.251.152.134.129.1
16.111゜実施例11 実施例8と同様にして、1α、24−ジヒドロキシビタ
ミンD、から1α、24.25− トリヒドロキシビタ
ミンD、を得た。
16.111゜実施例11 実施例8と同様にして、1α、24−ジヒドロキシビタ
ミンD、から1α、24.25− トリヒドロキシビタ
ミンD、を得た。
実施例1と同条件の高速液体クロ7トグラフイー[ゾル
パックスSILコにおける保持時間は、29.4分であ
った。
パックスSILコにおける保持時間は、29.4分であ
った。
最大紫外部吸収:
λmax’1! 265 nm(エタノール)E I−
MS(m/z): 432(M”) 、 414(M”−HlO) 、 3
96(M”−2H10) 。
MS(m/z): 432(M”) 、 414(M”−HlO) 、 3
96(M”−2H10) 。
287 、269 、251 、152 、134 、
116 、59実施例12 ノカルジア・オウトトロヒカN −102を、グルツー
ス1.5%、ソイビーンミール1.5%、コーンスチー
ブリ力−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、次階カル
シウム0.2%、pH7,0(7)無菌液体培地5o+
Tll1ノ入った500m1lの三角フラスコ1本に1
白金耳接種し、30゛Cで48時間攪拌振とぅ培養した
。対数増殖期中にあるノカルジア・オウトトロヒカN
−102の培養液中に2504のエタノールに溶解した
基質ビタミン0.5■及び0.5mQのツイーン80を
添加し、これを再び30°Cで48時間攪拌振とう培養
した。培養終了後、この培養液を塩化メ゛チレン200
m1で抽出し、塩化メチレン層を40’C以下で減圧乾
固後、直ちに2−プロパノール二〇−ヘキサン=1=9
の混合溶媒3m11に溶解し、−20°Cで3時間放置
した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得
た。この上清液を40’C以下で減圧下濃縮し、高速液
体クロマトグラフィー[ゾルパックスSIL、米国デュ
ポン社製]に付した。
116 、59実施例12 ノカルジア・オウトトロヒカN −102を、グルツー
ス1.5%、ソイビーンミール1.5%、コーンスチー
ブリ力−0,5%、塩化ナトリウム0.5%、次階カル
シウム0.2%、pH7,0(7)無菌液体培地5o+
Tll1ノ入った500m1lの三角フラスコ1本に1
白金耳接種し、30゛Cで48時間攪拌振とぅ培養した
。対数増殖期中にあるノカルジア・オウトトロヒカN
−102の培養液中に2504のエタノールに溶解した
基質ビタミン0.5■及び0.5mQのツイーン80を
添加し、これを再び30°Cで48時間攪拌振とう培養
した。培養終了後、この培養液を塩化メ゛チレン200
m1で抽出し、塩化メチレン層を40’C以下で減圧乾
固後、直ちに2−プロパノール二〇−ヘキサン=1=9
の混合溶媒3m11に溶解し、−20°Cで3時間放置
した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得
た。この上清液を40’C以下で減圧下濃縮し、高速液
体クロマトグラフィー[ゾルパックスSIL、米国デュ
ポン社製]に付した。
m 出rRB ; 2−プロパツール:n−へキサン=
3:22゜ カラノ・温度;25℃、 溶出速度HL5mll/分。
3:22゜ カラノ・温度;25℃、 溶出速度HL5mll/分。
フォトダイオードアレイ検出器(ウォーターズM 99
0 、日本ウォーターズ社製)で測定。
0 、日本ウォーターズ社製)で測定。
溶出後、ビタミンDyAの紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間4.0分付近のピークの両分を集めた。次に
これを40℃以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグラ
フィー[ゾルパックスops、米国デュポン社製コに付
した。
る保持時間4.0分付近のピークの両分を集めた。次に
これを40℃以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグラ
フィー[ゾルパックスops、米国デュポン社製コに付
した。
溶出溶媒;水:メタノール=1:9゜
カラム温度;40℃、溶出速度; 1.Od/分。
フォトダイオードアレイ検出器(ウォーターズM 99
0 、日本ウォーターズ社製)で測定。
0 、日本ウォーターズ社製)で測定。
溶出後、ビタミンD[の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間8,0分付近のピークの両分を集めた。これを
40℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、25−ヒドロキシビタミンD、を500尾
得九0これは市販の25−ヒドロキシビタミンD、(デ
ュファー社製、オランダ〉の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間[ゾルパックスSIL]、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。
保持時間8,0分付近のピークの両分を集めた。これを
40℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、25−ヒドロキシビタミンD、を500尾
得九0これは市販の25−ヒドロキシビタミンD、(デ
ュファー社製、オランダ〉の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間[ゾルパックスSIL]、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。
最大紫外部吸収:
λ、、xx 265 am(エタノール〉E I−MS
(m/z): 400(M+)、 382(M”−H,O) 、 27
1 、253 、136 。
(m/z): 400(M+)、 382(M”−H,O) 、 27
1 、253 、136 。
118.59
実施例13
ノカルジア・オウトトロヒカN −102を、グルフー
ス1,5%、ソイビーンミール1.5%、コーンスゲ・
−ブリカー〇、5%、塩化ナトリウム0.5%、炭酸カ
ルシウム0.2%、硫酸マグネシウム0.05%、pH
7,0の無菌液体培地50ITIllの入った500r
Itl!の三角フラスコ1本に1白金耳液種し、30℃
で48時間攪拌振とう”;5Rした。対数増殖期中にあ
るノカルジア・オウトトロヒカN −102の培養液中
に250Pf1のエタノールに溶解した基質ビタミンD
、5■及び0.05m1のツイーン80を添加し、これ
を再び30℃で60時間攪拌振とう培養した。培養終了
後、この培養液を塩化メチレン200r+tllで抽出
し、塩化メチレン層を40°C以下で減圧乾固後、直ち
に2−プロパノール二〇−ヘキサン−1:9の混合溶媒
3rdに溶解し、−20°Cで3時間放置した。これを
遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清
液を40°C以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスSIL、米国デュポン社製コに
付した。
ス1,5%、ソイビーンミール1.5%、コーンスゲ・
−ブリカー〇、5%、塩化ナトリウム0.5%、炭酸カ
ルシウム0.2%、硫酸マグネシウム0.05%、pH
7,0の無菌液体培地50ITIllの入った500r
Itl!の三角フラスコ1本に1白金耳液種し、30℃
で48時間攪拌振とう”;5Rした。対数増殖期中にあ
るノカルジア・オウトトロヒカN −102の培養液中
に250Pf1のエタノールに溶解した基質ビタミンD
、5■及び0.05m1のツイーン80を添加し、これ
を再び30℃で60時間攪拌振とう培養した。培養終了
後、この培養液を塩化メチレン200r+tllで抽出
し、塩化メチレン層を40°C以下で減圧乾固後、直ち
に2−プロパノール二〇−ヘキサン−1:9の混合溶媒
3rdに溶解し、−20°Cで3時間放置した。これを
遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清
液を40°C以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスSIL、米国デュポン社製コに
付した。
溶出溶媒;2−プロパツール:n−ヘキサン=3:22
゜ カラム温度;25°C1溶出速度H1,5mQ/分。
゜ カラム温度;25°C1溶出速度H1,5mQ/分。
)オドダイオードアレイ検出器(ウォーターズM990
.日本つォーターズ社製)で測定。
.日本つォーターズ社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間14,5分付近のピークの両分を集めた6次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製コに
付した。
保持時間14,5分付近のピークの両分を集めた6次に
これを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製コに
付した。
溶出溶媒;水:メタノール−1:9゜
カラム温度;40°b
フォトダイオードアレイ検出器(つオーターズM990
.日本ウォーターズ社製)で測定6溶出後、ビタミンD
類の紫外部吸収パターンと一致する保持時間5.6分付
近のピークの両分を集めた。これを40℃以下で、窒素
ガス置換しながら減圧濃縮乾固することにより、1α、
25−ジヒドロキシビタミンD、を50題得た。 こ
れは市販の1α、25−ジヒドロキシビタミンD、(ア
ユファー社製。オランダ)の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間[ゾルパックスSIL]、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。
.日本ウォーターズ社製)で測定6溶出後、ビタミンD
類の紫外部吸収パターンと一致する保持時間5.6分付
近のピークの両分を集めた。これを40℃以下で、窒素
ガス置換しながら減圧濃縮乾固することにより、1α、
25−ジヒドロキシビタミンD、を50題得た。 こ
れは市販の1α、25−ジヒドロキシビタミンD、(ア
ユファー社製。オランダ)の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間[ゾルパックスSIL]、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。
最大紫外部吸収:
λm8x=265 nm(エタノール)El−MS(m
/z): 416(M”) 、 398(M”−H!O) 、 3
80(M”−2HtO) 。
/z): 416(M”) 、 398(M”−H!O) 、 3
80(M”−2HtO) 。
287 、269 、251 、152 、134 、
129 、116 。
129 、116 。
111.59
実施例14
実施例12と同様にして、ビタミンDJから25−ヒト
【コキシビタミンD、を得た。
【コキシビタミンD、を得た。
実施例12と同条件の高速液体クロマトグラフィー[ゾ
ルパックスSIL]における保持時間は、3.9分であ
った。
ルパックスSIL]における保持時間は、3.9分であ
った。
最大紫外部吸収:
λmax= 265 nm(エタノール)E I −M
S(m/z>: 412(M”) 、 394(M”−H!O) 、 2
71 、253 、136 。
S(m/z>: 412(M”) 、 394(M”−H!O) 、 2
71 、253 、136 。
118.59
実施例15
実施例13と同様にして、ビタミンD、から1α。
25−ジヒドロキシビタミンD、を得た。
実施例13と同条件の高速液体クロマトグラフィー[ゾ
ルパックスSIL]における保持時間は、13,8分で
あった。
ルパックスSIL]における保持時間は、13,8分で
あった。
最大紫外部吸収:
λ(BBz−265nm(エタノール)E I −MS
(m/z): 428(M”) 、 410(H”−H,O) 、 3
92(M”−28,O) 。
(m/z): 428(M”) 、 410(H”−H,O) 、 3
92(M”−28,O) 。
287 、269 、251 、152 、134 、
116 、59実施例16 (1)ノカルジア・オウトトロヒカN−102を、グル
ツース1.5%、ソイビーンミール1.5%、フ−ンス
チーブリ力−05%、塩化ナトリウム0.5%、炭酸カ
ルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地50mQ
の入った500mMの三角フラスコ1本に1白金耳接種
し、28°Cで96時間撹拌振とう培養した。
116 、59実施例16 (1)ノカルジア・オウトトロヒカN−102を、グル
ツース1.5%、ソイビーンミール1.5%、フ−ンス
チーブリ力−05%、塩化ナトリウム0.5%、炭酸カ
ルシウム0.2%、pH7,0の無菌液体培地50mQ
の入った500mMの三角フラスコ1本に1白金耳接種
し、28°Cで96時間撹拌振とう培養した。
(2)以下の操作は2°Cないし8°Cの間で行った。
(1)で得られた菌体をlomM トリス−酢酸、2m
MM酸マグネシウム、7mM2−メツしカプトエタノー
ル及び20%グリセリンからなるpH7,4の緩衝液(
以下、緩衝液Cと略す)200mMに懸濁し閉部濁液と
してこれを遠心分離して得られた菌体を再び100mM
のia衝液Cに懸濁して閉部濁液とした。この懸濁ン夜
をディスパーザ−(ULTRA−TUR−RAX■:商
品名、IKA−WERK社製)で2分間処理して菌体を
破砕し、菌体破砕、液とし、次にこれを遠心分離してそ
の上清液を得た。得られた−に清液にポリエチレングリ
コール6000を終濃度25%になるように攪拌しなが
ら少しづつ加えてこれを溶解した後、30分間4°Cで
放置した6次に、この溶液を遠心骨はし、上清液を捨て
た後、粗酵素沈殿物を得た。
MM酸マグネシウム、7mM2−メツしカプトエタノー
ル及び20%グリセリンからなるpH7,4の緩衝液(
以下、緩衝液Cと略す)200mMに懸濁し閉部濁液と
してこれを遠心分離して得られた菌体を再び100mM
のia衝液Cに懸濁して閉部濁液とした。この懸濁ン夜
をディスパーザ−(ULTRA−TUR−RAX■:商
品名、IKA−WERK社製)で2分間処理して菌体を
破砕し、菌体破砕、液とし、次にこれを遠心分離してそ
の上清液を得た。得られた−に清液にポリエチレングリ
コール6000を終濃度25%になるように攪拌しなが
ら少しづつ加えてこれを溶解した後、30分間4°Cで
放置した6次に、この溶液を遠心骨はし、上清液を捨て
た後、粗酵素沈殿物を得た。
(3) (2)で得られた沈殿物の約50017g蛋白
質含量に相当する粗酵素を含む20mM トリス−酢酸
、70mWニコチンアミド、 2mM fh酸マグネシ
ウム、100mM N A D P 、 5 mM
A T P 、 6 mMグルコース−6−リン酸、
pH7,4から成る酵素反応溶液15m1lにグルコー
ス−6−リン酸デヒドロゲナーゼ5ユニット及び150
μのエタノールに溶かしたビタミンD m 3■を加え
、28°Cで30分間攪拌振とうし、酵素反応を行なっ
た。
質含量に相当する粗酵素を含む20mM トリス−酢酸
、70mWニコチンアミド、 2mM fh酸マグネシ
ウム、100mM N A D P 、 5 mM
A T P 、 6 mMグルコース−6−リン酸、
pH7,4から成る酵素反応溶液15m1lにグルコー
ス−6−リン酸デヒドロゲナーゼ5ユニット及び150
μのエタノールに溶かしたビタミンD m 3■を加え
、28°Cで30分間攪拌振とうし、酵素反応を行なっ
た。
(4)クロロホルム:メタノール=1=2の混合溶媒4
5m1を(3)の酵素反応溶液に加え、反応を停止させ
た後、反応生成物をブライ・アンド・ダイヤ−(bli
gh & deyer)法で抽出した。抽出後、得られ
たクロロホルム画分を40℃以下で減圧乾固後、直ちに
2−プロパツール:n−ヘキサン=1=9の混合溶媒2
50−に溶解し、これを高速液体クロマトグラフィー[
ゾルパックスSIL、米国デュポン社製]に付した。
5m1を(3)の酵素反応溶液に加え、反応を停止させ
た後、反応生成物をブライ・アンド・ダイヤ−(bli
gh & deyer)法で抽出した。抽出後、得られ
たクロロホルム画分を40℃以下で減圧乾固後、直ちに
2−プロパツール:n−ヘキサン=1=9の混合溶媒2
50−に溶解し、これを高速液体クロマトグラフィー[
ゾルパックスSIL、米国デュポン社製]に付した。
溶出[K;2−プロパツール:n−ヘキサン−3:22
゜ カラム温度;25°C1溶出速度;1.5m1l/分。
゜ カラム温度;25°C1溶出速度;1.5m1l/分。
)すトダ・fオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
火源゛IE子社製)で4!り定。
(5) <4)の高速液体クロマトグラフィーの溶出後
、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間4.0分付近のピークの両分を集めた。
、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間4.0分付近のピークの両分を集めた。
次にこれを40’C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー[ツルパックスODS、米[1デュポン社
製]に付した。
トグラフィー[ツルパックスODS、米[1デュポン社
製]に付した。
溶出溶媒:水:メタノール=1:9゜
カラム温度;40°C1溶出速度、 1.0mQ/分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
大間電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間8.0分付近のピークの両分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しなから減圧濃縮乾固す
ることにより、25−ヒドロキシビタミンD、を116
P1g得た。これは市販の25−ヒドロヤシビタミンD
m(デュファー社製、オランダ)の標品と液体クロマト
グラフィーの保持時間[ゾルパックスS I L]、紫
外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが
完全に一致した。
保持時間8.0分付近のピークの両分を集めた。これを
40°C以下で、窒素ガス置換しなから減圧濃縮乾固す
ることにより、25−ヒドロキシビタミンD、を116
P1g得た。これは市販の25−ヒドロヤシビタミンD
m(デュファー社製、オランダ)の標品と液体クロマト
グラフィーの保持時間[ゾルパックスS I L]、紫
外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが
完全に一致した。
最大紫外部吸収:
λmBz= 265 run(エタノール)E I−M
S(m/z): 400(M”) 、 382(M”−H*O) 、 2
71 、253 、136 。
S(m/z): 400(M”) 、 382(M”−H*O) 、 2
71 、253 、136 。
118.59
(6) (4)の高速液体クロマトグラフィーの溶出後
、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間14.5分付近のピークの両分を集めた。
、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間14.5分付近のピークの両分を集めた。
次にこれを40°C以下で減圧濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製
]に付した。
トグラフィー[ゾルパックスODS、米国デュポン社製
]に付した。
溶出溶媒;水:メタノール=1 : 9 。
カラム温度;40℃、溶出速度; 1.0m97分。
フォトダイオードアレイ検出器(MCPD 3500
。
。
天場電子社製)で測定。
溶出後、ビタミンD類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間5.6分付近のピークの画分を集めた。 これ
を40°C以下で、窒素ガス置換しながら1f−I I
E e4¥J乾固することにより、1α、25−ジヒド
ロキシビタミンD、を20Pg得た。これは市販の1α
、25−ジヒドロキシビタミンDm(デュファー社袈、
オランダ)の標品と液体クロマトグラフィの保持時間[
ゾルパックスSIL]、紫外線吸収スペクトラム、マス
スペクトル開裂パターンが完全に一致した。
保持時間5.6分付近のピークの画分を集めた。 これ
を40°C以下で、窒素ガス置換しながら1f−I I
E e4¥J乾固することにより、1α、25−ジヒド
ロキシビタミンD、を20Pg得た。これは市販の1α
、25−ジヒドロキシビタミンDm(デュファー社袈、
オランダ)の標品と液体クロマトグラフィの保持時間[
ゾルパックスSIL]、紫外線吸収スペクトラム、マス
スペクトル開裂パターンが完全に一致した。
最大紫外部吸収:
λmB−265nm(エタノール)
EI−MS(m/z):
416(M”) 、 398(M”−HfiOン
、 380(M”−2H,0ン 。
、 380(M”−2H,0ン 。
287、269.251 、152.134.129.
116゜111.59 、−(験例 1α、25−ジヒドロキシビタミンD、のインビトロ薬
理活性試験[ラジオリセブターアッセイ法]ニワトリの
胎児の腸管より調製された1α、25−ジヒドロキシビ
タミンD、リセブタ−[ヤマサ醤油(株)]を110m
M)リス−塩酸、0.5mM EDTA、1mMジチオ
スレイトール、10mMモリブデン酸ナトリウム、pH
7,4の緩衝液に懸濁させ、これをノセブター溶液(プ
ロティン約0.5mg/ mQ )として使用した。
116゜111.59 、−(験例 1α、25−ジヒドロキシビタミンD、のインビトロ薬
理活性試験[ラジオリセブターアッセイ法]ニワトリの
胎児の腸管より調製された1α、25−ジヒドロキシビ
タミンD、リセブタ−[ヤマサ醤油(株)]を110m
M)リス−塩酸、0.5mM EDTA、1mMジチオ
スレイトール、10mMモリブデン酸ナトリウム、pH
7,4の緩衝液に懸濁させ、これをノセブター溶液(プ
ロティン約0.5mg/ mQ )として使用した。
このリセブター溶液に、50%エタノールに溶解した被
検薬[1α、25−ジヒドロキシビタミンD。
検薬[1α、25−ジヒドロキシビタミンD。
の標品(デュファー社製、オランダ)]及び実施例1で
得られた1α、25−ジヒドロキシビタミンDIを3又
は10−1101〜10−’Mになるように添加した0
次いで1H−1α、25−ジヒドロキシビタミンD、(
約0.4μM)を添加し、0°Cで3時間インキュベー
ションして反応を行った。リセブター結合物と非結合物
の分離はチャコール法を用いた。特異的結合量は、上記
反応より得られる総語合量から10μMの1α、25−
ジヒドロキシビタミンD、存在下に得られる非特異的結
合量を差し引いて求めた。被検薬の結合能は、リセブタ
ーへのIH−1α、25−ジヒドロキシビタミンD、の
結合を50%阻害する濃度(tcse)で示した。
得られた1α、25−ジヒドロキシビタミンDIを3又
は10−1101〜10−’Mになるように添加した0
次いで1H−1α、25−ジヒドロキシビタミンD、(
約0.4μM)を添加し、0°Cで3時間インキュベー
ションして反応を行った。リセブター結合物と非結合物
の分離はチャコール法を用いた。特異的結合量は、上記
反応より得られる総語合量から10μMの1α、25−
ジヒドロキシビタミンD、存在下に得られる非特異的結
合量を差し引いて求めた。被検薬の結合能は、リセブタ
ーへのIH−1α、25−ジヒドロキシビタミンD、の
結合を50%阻害する濃度(tcse)で示した。
以上、実施例1.6.7.8.13及び16で得られた
lα、25−ジヒドロキシビタミンD、は、ラジオクセ
ブタ−アッセイ法によるインビトロ薬理試験において、
市販の標品と同一の活性を示した。
lα、25−ジヒドロキシビタミンD、は、ラジオクセ
ブタ−アッセイ法によるインビトロ薬理試験において、
市販の標品と同一の活性を示した。
Claims (6)
- (1)ビタミンD類を水酸化する放線菌菌体又はその産
生する酵素を含有する溶液中に1α又は25位に水素原
子を有するビタミンD類を加えて、それぞれその水素原
子を水酸基に変換することを特徴とする1α−ヒドロキ
シビタミンD類又は25−ヒドロキシビタミンD類の製
造方法 - (2)ビタミンD類を水酸化する放線菌菌体又はその産
生する酵素を含有する溶液中に1α及び25位に水素原
子を有するビタミンD類を加えて、その水素原子を水酸
基に変換することを特徴とする25−ヒドロキシビタミ
ンD類又は1α,25−ジヒドロキシビタミンD類の製
造方法 - (3)放線菌がストレプトマイセス属又はノカルジア属
に属する菌である請求項(1)又は(2)に記載の製造
方法 - (4)放線菌がストレプトマイセス・スクレロチアラス
T−JS1(¥Streptomyces¥¥scle
rotialus¥T−JS1)である請求項(1)又
は(2)に記載の製造方法 - (5)放線菌がストレプトマイセス・ロゼオスポラスA
−5797(¥Streptomyces¥¥rose
osporus¥A−5797)である請求項(1)又
は(2)に記載の製造方法 - (6)放線菌がノカルジア.オウトトロヒカN−102
(¥Nocardia¥¥autotrophica¥
N−102)である請求項(1)又は(2)に記載の製
造方法
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63108337A JPH02469A (ja) | 1987-07-08 | 1988-04-30 | ビタミンd類の製造方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62-170669 | 1987-07-08 | ||
JP17066987 | 1987-07-08 | ||
JP62-331323 | 1987-12-26 | ||
JP63108337A JPH02469A (ja) | 1987-07-08 | 1988-04-30 | ビタミンd類の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02469A true JPH02469A (ja) | 1990-01-05 |
JPH0464678B2 JPH0464678B2 (ja) | 1992-10-15 |
Family
ID=26448256
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63108337A Granted JPH02469A (ja) | 1987-07-08 | 1988-04-30 | ビタミンd類の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02469A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994000576A1 (en) * | 1992-06-25 | 1994-01-06 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Vitamin d hydroxylase gene |
WO2007138894A1 (ja) | 2006-05-31 | 2007-12-06 | Mercian Corporation | 水酸化酵素遺伝子及びその用途 |
CN100465134C (zh) * | 2007-02-09 | 2009-03-04 | 上海大学 | 低温无压烧结制备致密Ti3AlC2陶瓷的方法 |
-
1988
- 1988-04-30 JP JP63108337A patent/JPH02469A/ja active Granted
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994000576A1 (en) * | 1992-06-25 | 1994-01-06 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Vitamin d hydroxylase gene |
WO2007138894A1 (ja) | 2006-05-31 | 2007-12-06 | Mercian Corporation | 水酸化酵素遺伝子及びその用途 |
CN100465134C (zh) * | 2007-02-09 | 2009-03-04 | 上海大学 | 低温无压烧结制备致密Ti3AlC2陶瓷的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0464678B2 (ja) | 1992-10-15 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
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