JP3156735B2 - 新規胆汁酸変換微生物、及び胆汁酸の製造方法 - Google Patents
新規胆汁酸変換微生物、及び胆汁酸の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は胆汁酸変換能力を有する
新規微生物及びジ（又はトリ）ヒドロキシコラン酸の水
酸基の位置特異的な酸化方法に関する。更に詳しくは、
本発明はバチルス属に属する胆汁酸変換微生物、及びこ
れらの微生物を用いて３α，７α−ジ−ヒドロキシ−５
β−コラン酸（以下ケノデオキシコール酸という。）又
は、３α、７α、１２α−トリヒドロキシ−５β−コラ
ン酸（以下、コール酸という。）から利胆剤として有用
な３α、７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（以下、
ウルソデオキシコール酸という。）の製造中間体である
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸、又は３
α、１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸
若しくは３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−
コラン酸を製造する方法に関する。
新規微生物及びジ（又はトリ）ヒドロキシコラン酸の水
酸基の位置特異的な酸化方法に関する。更に詳しくは、
本発明はバチルス属に属する胆汁酸変換微生物、及びこ
れらの微生物を用いて３α，７α−ジ−ヒドロキシ−５
β−コラン酸（以下ケノデオキシコール酸という。）又
は、３α、７α、１２α−トリヒドロキシ−５β−コラ
ン酸（以下、コール酸という。）から利胆剤として有用
な３α、７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（以下、
ウルソデオキシコール酸という。）の製造中間体である
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸、又は３
α、１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸
若しくは３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−
コラン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ケノデオキシコール酸からウルソ
デオキシコール酸を合成する方法としては、ケノデオキ
シコール酸の７位のα水酸基を化学的にβ水酸基とする
方法、すなわち、ケノデオキシコール酸の７位のα水酸
基の選択的酸化で３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸とし、この７−ケト基を立体選択的に還元して
７位がβ水酸基であるウルソデオキシコール酸とする方
法が知られている。
デオキシコール酸を合成する方法としては、ケノデオキ
シコール酸の７位のα水酸基を化学的にβ水酸基とする
方法、すなわち、ケノデオキシコール酸の７位のα水酸
基の選択的酸化で３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸とし、この７−ケト基を立体選択的に還元して
７位がβ水酸基であるウルソデオキシコール酸とする方
法が知られている。
【０００３】又、微生物を用いてケノデオキシコール酸
から３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を製
造する方法としては、シュードモナス属に属する微生物
を用いる方法が知られている（特公昭６２−２５３５６
号公報）。
から３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を製
造する方法としては、シュードモナス属に属する微生物
を用いる方法が知られている（特公昭６２−２５３５６
号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、化学的
合成法は、反応性、選択性及び操作上の安全性に問題が
あり、収率や得られる製品の純度の点でも満足できるも
のでなかった。
合成法は、反応性、選択性及び操作上の安全性に問題が
あり、収率や得られる製品の純度の点でも満足できるも
のでなかった。
【０００５】又、微生物を用いた前記製造方法では、基
質であるケノデオキシコール酸の濃度が１％と低く、
又、変換率も30.5％と低いもので、満足のできるもので
はなかった。
質であるケノデオキシコール酸の濃度が１％と低く、
又、変換率も30.5％と低いもので、満足のできるもので
はなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる現
状に鑑み、微生物を用い、高濃度の化合物（Ｉ）
状に鑑み、微生物を用い、高濃度の化合物（Ｉ）
【化３】 （式中、Ｘは水素または水酸基を表す。）を基質とし
て、化合物（II）
て、化合物（II）
【化４】 （式中、Ｙ1およびＹ2は、Ｘが水素の場合にはＹ1およ
びＹ2は共に水素を表し、Ｘが水酸基の場合にはＹ1は水
酸基、Ｙ2は水素を表すか、Ｙ1Ｙ2が一緒になってケト
基を表す。）を製造する方法について鋭意研究を進めた
結果、バチルス属に属する新規微生物が、高濃度の化合
物（Ｉ）を基質として、高収率で化合物（II）を生産す
ることを見い出した。これらの微生物は山形県米沢市内
の土壌より単離されたもので、本発明者らによってバチ
ルス・エスピー TTUR 2-2 ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５１
(Bacillus sp. TTUR 2-2 FERM BP-3651, 微工研条寄第3
651号)（以下、単に「バチルス・エスピー TTUR 2-2」
と記す。）、バチルス・エスピー TTUR 4-1 ＦＥＲＭ
Ｐ−１１８６２(Bacillus sp. TTUR 4-1 FERM P-1186
2, 微工研菌寄第 11862号)（以下、単に「バチルス・エ
スピー TTUR 4-1」と記す。）、バチルス・エスピー TT
UR 4-2 ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６３(Bacillus sp. TTUR
4-2 FERM P-11863, 微工研菌寄第 11863号)（以下、単
に「バチルス・エスピー TTUR 4-2」と記す。）と命名
された。
びＹ2は共に水素を表し、Ｘが水酸基の場合にはＹ1は水
酸基、Ｙ2は水素を表すか、Ｙ1Ｙ2が一緒になってケト
基を表す。）を製造する方法について鋭意研究を進めた
結果、バチルス属に属する新規微生物が、高濃度の化合
物（Ｉ）を基質として、高収率で化合物（II）を生産す
ることを見い出した。これらの微生物は山形県米沢市内
の土壌より単離されたもので、本発明者らによってバチ
ルス・エスピー TTUR 2-2 ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５１
(Bacillus sp. TTUR 2-2 FERM BP-3651, 微工研条寄第3
651号)（以下、単に「バチルス・エスピー TTUR 2-2」
と記す。）、バチルス・エスピー TTUR 4-1 ＦＥＲＭ
Ｐ−１１８６２(Bacillus sp. TTUR 4-1 FERM P-1186
2, 微工研菌寄第 11862号)（以下、単に「バチルス・エ
スピー TTUR 4-1」と記す。）、バチルス・エスピー TT
UR 4-2 ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６３(Bacillus sp. TTUR
4-2 FERM P-11863, 微工研菌寄第 11863号)（以下、単
に「バチルス・エスピー TTUR 4-2」と記す。）と命名
された。
【０００７】これらの菌株は、ケノデオキシコール酸の
主として７位の水酸基をケト基に酸化する能力を有し、
併せて弱いながらも３位の水酸基をケト基に酸化する能
力を有しているが、基質のケノデオキシコール酸を資化
あるいは分解する性質を示さない。
主として７位の水酸基をケト基に酸化する能力を有し、
併せて弱いながらも３位の水酸基をケト基に酸化する能
力を有しているが、基質のケノデオキシコール酸を資化
あるいは分解する性質を示さない。
【０００８】本発明者らは基質としてのケノデオキシコ
ール酸をさらに高い収率で３α−ヒドロキシ−７−ケト
−５β−コラン酸に変換し得る微生物を得るためさらに
研究を進めた結果、上記バチルス・エスピー TTUR 2-2
菌株に通常の突然変異処理、例えば紫外線、Ｘ線若しく
はγ線等の照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイ
ド、アクリフラビン若しくはエチルメタンスルホネート
等突然変異誘発剤との接触を施すことにより、ケノデオ
キシコール酸を基質として、３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸をさらに高い収率（後記するごとく
100％又はほぼ 100％の収率）で生産する突然変異株を
分離することに成功した。
ール酸をさらに高い収率で３α−ヒドロキシ−７−ケト
−５β−コラン酸に変換し得る微生物を得るためさらに
研究を進めた結果、上記バチルス・エスピー TTUR 2-2
菌株に通常の突然変異処理、例えば紫外線、Ｘ線若しく
はγ線等の照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイ
ド、アクリフラビン若しくはエチルメタンスルホネート
等突然変異誘発剤との接触を施すことにより、ケノデオ
キシコール酸を基質として、３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸をさらに高い収率（後記するごとく
100％又はほぼ 100％の収率）で生産する突然変異株を
分離することに成功した。
【０００９】このような突然変異株として、次の菌株を
挙げることができる。
挙げることができる。
【００１０】（１）バチルス・エスピー TTUR 2-M4 Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−３３９３(Bacillus sp. TTUR 2-M4 FERM
BP-3393)菌株(微工研条寄第3393号)（以下、単に「バ
チルス・エスピー TTUR 2-M4」と記す。）。
ＥＲＭ ＢＰ−３３９３(Bacillus sp. TTUR 2-M4 FERM
BP-3393)菌株(微工研条寄第3393号)（以下、単に「バ
チルス・エスピー TTUR 2-M4」と記す。）。
【００１１】（２）バチルス・エスピー TTUR 2-M5 Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−３３９８(Bacillus sp. TTUR 2-M5 FERM
BP-3398)菌株(微工研条寄第3398号)（以下、単に「バ
チルス・エスピー TTUR 2-M5」と記す。）。
ＥＲＭ ＢＰ−３３９８(Bacillus sp. TTUR 2-M5 FERM
BP-3398)菌株(微工研条寄第3398号)（以下、単に「バ
チルス・エスピー TTUR 2-M5」と記す。）。
【００１２】（３）バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250
ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９５(Bacillus sp. TTUR 2-M4-
250 FERM BP-3395)菌株(微工研条寄第3395号)（以下、
単に「バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250」と記
す。）。
ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９５(Bacillus sp. TTUR 2-M4-
250 FERM BP-3395)菌株(微工研条寄第3395号)（以下、
単に「バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250」と記
す。）。
【００１３】（４）バチルス・エスピー TTUR 2-M4-294
ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９６(Bacillus sp. TTUR 2-M4-
294 FERM BP-3396)菌株(微工研条寄第3396号)（以下、
単に「バチルス・エスピー TTUR 2-M4-294」と記
す。）。
ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９６(Bacillus sp. TTUR 2-M4-
294 FERM BP-3396)菌株(微工研条寄第3396号)（以下、
単に「バチルス・エスピー TTUR 2-M4-294」と記
す。）。
【００１４】これらの突然変異株は、いずれもケノデオ
キシコール酸から 100％もしくはほぼ 100％の変換率か
つ 100％もしくはほぼ 100％の選択率で、すなわち 100
％もしくはほぼ 100％の収率で３α−ヒドロキシ−７−
ケト−５β−コラン酸を生産する能力を有する。
キシコール酸から 100％もしくはほぼ 100％の変換率か
つ 100％もしくはほぼ 100％の選択率で、すなわち 100
％もしくはほぼ 100％の収率で３α−ヒドロキシ−７−
ケト−５β−コラン酸を生産する能力を有する。
【００１５】即ち、本発明によれば、バチルス属に属
し、ケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をケ
ノデオキシコール酸を含む栄養培地で培養し、培養物中
に３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成
せしめ、これを採取することを特徴とする３α−ヒドロ
キシ−７−ケト−５β−コラン酸の製造方法が提供され
る。更に、本発明によれば、この場合に使用される微生
物として、前記バチルス・エスピー TTUR 2-2 、バチル
ス・エスピー TTUR 4-1 、バチルス・エスピー TTUR 4-
2 、バチルス・エスピー TTUR 2-M4、バチルス・エスピ
ー TTUR 2-M5、バチルス・エスピー TTUR2-M4-250又は
バチルス・エスピー TTUR 2-M4-294が提供される。
し、ケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をケ
ノデオキシコール酸を含む栄養培地で培養し、培養物中
に３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成
せしめ、これを採取することを特徴とする３α−ヒドロ
キシ−７−ケト−５β−コラン酸の製造方法が提供され
る。更に、本発明によれば、この場合に使用される微生
物として、前記バチルス・エスピー TTUR 2-2 、バチル
ス・エスピー TTUR 4-1 、バチルス・エスピー TTUR 4-
2 、バチルス・エスピー TTUR 2-M4、バチルス・エスピ
ー TTUR 2-M5、バチルス・エスピー TTUR2-M4-250又は
バチルス・エスピー TTUR 2-M4-294が提供される。
【００１６】又、本発明者らは、基質をケノデオキシコ
ール酸からコール酸に代えて上記突然変異株を培養した
ところ、バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌株又はバチル
ス・エスピー TTUR 2-M5菌株では、３α−ヒドロキシ−
７，１２−ジケト−５β−コラン酸をバチルス・エスピ
ー TTUR 2-M4-250菌株又はバチルス・エスピー TTUR2-M
4-294菌株では、３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸を変換生成物として得た。
ール酸からコール酸に代えて上記突然変異株を培養した
ところ、バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌株又はバチル
ス・エスピー TTUR 2-M5菌株では、３α−ヒドロキシ−
７，１２−ジケト−５β−コラン酸をバチルス・エスピ
ー TTUR 2-M4-250菌株又はバチルス・エスピー TTUR2-M
4-294菌株では、３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸を変換生成物として得た。
【００１７】即ち、本発明によれば、バチルス属に属
し、コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−
５β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をコール
酸を含む栄養培地で培養し、培養物中に３α−ヒドロキ
シ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸を生成せしめ、
これを採取することを特徴とする３α−ヒドロキシ−
７，１２−ジケト−５β−コラン酸の製造方法が提供さ
れる。更に、本発明によれば、この場合に使用される微
生物として前記バチルス・エスピー TTUR 2-M4又はバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M5が提供される。
し、コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−
５β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をコール
酸を含む栄養培地で培養し、培養物中に３α−ヒドロキ
シ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸を生成せしめ、
これを採取することを特徴とする３α−ヒドロキシ−
７，１２−ジケト−５β−コラン酸の製造方法が提供さ
れる。更に、本発明によれば、この場合に使用される微
生物として前記バチルス・エスピー TTUR 2-M4又はバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M5が提供される。
【００１８】又、本発明によれば、バチルス属に属し、
コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をコール酸
を含む栄養培地で培養し、培養物中に３α，１２α−ジ
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成せしめ、
これを採取することからなる３α，１２α−ジヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸の製造方法が提供され
る。更に本発明によれば、この場合に使用される微生物
として前記バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250又はバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-294が提供される。
コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をコール酸
を含む栄養培地で培養し、培養物中に３α，１２α−ジ
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成せしめ、
これを採取することからなる３α，１２α−ジヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸の製造方法が提供され
る。更に本発明によれば、この場合に使用される微生物
として前記バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250又はバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-294が提供される。
【００１９】次に本発明についてさらに詳しく説明す
る。
る。
【００２０】野生株バチルス・エスピー TTUR 2-2 、バ
チルス・エスピー TTUR 4-1 及びバチルス・エスピー T
TUR 4-2 の土壌からの分離は次の方法によった。
チルス・エスピー TTUR 4-1 及びバチルス・エスピー T
TUR 4-2 の土壌からの分離は次の方法によった。
【００２１】土壌を５％のコール酸ナトリウムを含むホ
リコシ培地Ｉ〔グルコース１％、イースト・エキス 0.5
％、リン酸一水素カリウム 0.1％、硫酸マグネシウム・
７水和物0.02％、炭酸ナトリウム１％、pH10〕に少量懸
濁し、30℃で５日間集積培養し、得られた培養液の１白
金耳量を５％のコール酸ナトリウムを含むホリコシ培地
Ｉ寒天平板に画線培養し、菌株を純粋分離した。これら
の菌株を、各々５％のケノデオキシコール酸ナトリウム
を含むホリコシ培地Ｉ中で30℃で２日間培養し、培養液
中の３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸の定
量を行い、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン
酸の変換能の高い菌株を得た。
リコシ培地Ｉ〔グルコース１％、イースト・エキス 0.5
％、リン酸一水素カリウム 0.1％、硫酸マグネシウム・
７水和物0.02％、炭酸ナトリウム１％、pH10〕に少量懸
濁し、30℃で５日間集積培養し、得られた培養液の１白
金耳量を５％のコール酸ナトリウムを含むホリコシ培地
Ｉ寒天平板に画線培養し、菌株を純粋分離した。これら
の菌株を、各々５％のケノデオキシコール酸ナトリウム
を含むホリコシ培地Ｉ中で30℃で２日間培養し、培養液
中の３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸の定
量を行い、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン
酸の変換能の高い菌株を得た。
【００２２】これらの菌学的性質は下記表１−８に示す
通りであり、これらの試験及び分類方法は「バージエー
ズ・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロ
ジー（BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology)
」に準拠して行ったものであり、特に記載のない限
り、全て炭酸ナトリウムを添加し、pHを10に調整した培
地を使用した。
通りであり、これらの試験及び分類方法は「バージエー
ズ・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロ
ジー（BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology)
」に準拠して行ったものであり、特に記載のない限
り、全て炭酸ナトリウムを添加し、pHを10に調整した培
地を使用した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】以上の検索の結果、TTUR 2-2菌、TTUR 4-1
菌及びTTUR 4-2菌は好気性の有胞子細菌であることか
ら、バチルス(Bacillus)属に属する微生物であることは
明らかである。しかしながら、生育のための至適pHが10
前後のアルカリ側に存在することから一般のバチルス属
微生物とは異なる。
菌及びTTUR 4-2菌は好気性の有胞子細菌であることか
ら、バチルス(Bacillus)属に属する微生物であることは
明らかである。しかしながら、生育のための至適pHが10
前後のアルカリ側に存在することから一般のバチルス属
微生物とは異なる。
【００３２】また、これらの菌と好アルカリ性のバチル
ス属標準微生物として知られるバチルス・アルカロフィ
ルス(Bacillus alcalophilus) 及びバチルス・アルカロ
フィルス・サブスピーシス・ハロデュランス(Bacillus
alcalophilus subsp.halodurans)とを比較したときコロ
ニーの形状、コロニー周辺の様子において顕著に異なっ
ていた。
ス属標準微生物として知られるバチルス・アルカロフィ
ルス(Bacillus alcalophilus) 及びバチルス・アルカロ
フィルス・サブスピーシス・ハロデュランス(Bacillus
alcalophilus subsp.halodurans)とを比較したときコロ
ニーの形状、コロニー周辺の様子において顕著に異なっ
ていた。
【００３３】好アルカリ性でコロニーが不規則、かつ周
辺が裂片状の菌株としてバチルス・セレウス8-1 菌(Bac
illus cereus 8-1, FERM2885, 特公昭53-13708号) 及び
バチルス・アルカロフィルス 202-1菌(Bacillus alcalo
philus 202-1, FERM2674, 特公昭53-27786号) が報告さ
れているが、これらの菌と比較してもその性状は異なっ
ていた。
辺が裂片状の菌株としてバチルス・セレウス8-1 菌(Bac
illus cereus 8-1, FERM2885, 特公昭53-13708号) 及び
バチルス・アルカロフィルス 202-1菌(Bacillus alcalo
philus 202-1, FERM2674, 特公昭53-27786号) が報告さ
れているが、これらの菌と比較してもその性状は異なっ
ていた。
【００３４】表９に TTUR 2-2菌、TTUR 4-1菌及びTTUR
4-2菌の主な性状を、表10にバチルス・アルカロフィル
ス、バチルス・アルカロフィルス・サブスピーシス・ハ
ロデュランス、バチルス・セレウス8-1 菌及びバチルス
・アルカロフィルス 202-1菌の主な性状を示した。
4-2菌の主な性状を、表10にバチルス・アルカロフィル
ス、バチルス・アルカロフィルス・サブスピーシス・ハ
ロデュランス、バチルス・セレウス8-1 菌及びバチルス
・アルカロフィルス 202-1菌の主な性状を示した。
【００３５】
【表９】
【００３６】
【表１０】
【００３７】従って、本発明で使用されるTTUR 2-2菌、
TTUR 4-1菌及びTTUR 4-2菌は好気性の有胞子細菌である
が、上記の通り種々の菌学的性質において、特に生育の
ための至適pHが10付近のアルカリ性側に存在する点にお
いて、及びケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する点に
おいてバチルス属に属する公知の菌種とは区別されるこ
とから、これらを新菌種として設定することが適当であ
る。
TTUR 4-1菌及びTTUR 4-2菌は好気性の有胞子細菌である
が、上記の通り種々の菌学的性質において、特に生育の
ための至適pHが10付近のアルカリ性側に存在する点にお
いて、及びケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する点に
おいてバチルス属に属する公知の菌種とは区別されるこ
とから、これらを新菌種として設定することが適当であ
る。
【００３８】次に突然変異株バチルス・エスピー TTUR
2-M4、バチルス・エスピー TTUR 2-M5、バチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250及びバチルス・エスピー TTUR 2-M4
-294の具体的な取得方法を後述の実施例に示す。又、上
記突然変異株の菌学的性質を、参考のためそれらの親株
であるバチルス・エスピー TTUR 2-2 の菌学的性質と共
に表11〜表20に示した。
2-M4、バチルス・エスピー TTUR 2-M5、バチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250及びバチルス・エスピー TTUR 2-M4
-294の具体的な取得方法を後述の実施例に示す。又、上
記突然変異株の菌学的性質を、参考のためそれらの親株
であるバチルス・エスピー TTUR 2-2 の菌学的性質と共
に表11〜表20に示した。
【００３９】なお、親株の場合と同様、表中の試験及び
分類方法は、「バージエーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティックバクテリオロジー（BERGEY'S MANUAL OF S
ystematic Bacteriology) 」に準拠して行ったものであ
り、特に記載のない限り、全て炭酸ナトリウムを添加
し、pHを10に調整した培地を用いた。
分類方法は、「バージエーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティックバクテリオロジー（BERGEY'S MANUAL OF S
ystematic Bacteriology) 」に準拠して行ったものであ
り、特に記載のない限り、全て炭酸ナトリウムを添加
し、pHを10に調整した培地を用いた。
【００４０】
【表１１】
【００４１】
【表１２】
【００４２】
【表１３】
【００４３】
【表１４】
【００４４】
【表１５】
【００４５】
【表１６】
【００４６】
【表１７】
【００４７】
【表１８】
【００４８】
【表１９】
【００４９】
【表２０】
【００５０】一般に突然変異株は、その親株と同じ種に
属するものと考えられていることから、バチルス・エス
ピー TTUR 2-2 菌株の突然変異株は、いずれもその親株
と同じ新菌種に属するものと判定した。従って、本発明
に係る突然変異株は、バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌
株、TTUR 2-M5 菌株、TTUR 2-M4-250 菌株及び TTUR2-M
4-294菌株に限定されるものではなく、バチルス属に属
し、ケノデオキシコール酸を基質として３α−ヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸を生産する菌株、コール
酸を基質として３α−ヒドロキシ−７, １２−ジケト−
５β−コラン酸又は３α，１２α−ジヒドロキシ−７−
ケト−５β−コラン酸を生産する菌株であればいずれで
もよい。
属するものと考えられていることから、バチルス・エス
ピー TTUR 2-2 菌株の突然変異株は、いずれもその親株
と同じ新菌種に属するものと判定した。従って、本発明
に係る突然変異株は、バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌
株、TTUR 2-M5 菌株、TTUR 2-M4-250 菌株及び TTUR2-M
4-294菌株に限定されるものではなく、バチルス属に属
し、ケノデオキシコール酸を基質として３α−ヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸を生産する菌株、コール
酸を基質として３α−ヒドロキシ−７, １２−ジケト−
５β−コラン酸又は３α，１２α−ジヒドロキシ−７−
ケト−５β−コラン酸を生産する菌株であればいずれで
もよい。
【００５１】本発明によれば、バチルス属に属し、ケノ
デオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β
−コラン酸に変換する能力を有する微生物をケノデオキ
シコール酸を含む栄養培地で培養することにより、３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成させる
ことができる。
デオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β
−コラン酸に変換する能力を有する微生物をケノデオキ
シコール酸を含む栄養培地で培養することにより、３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成させる
ことができる。
【００５２】又、本発明によれば、バチルス属に属し、
コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β
−コラン酸に変換する能力を有する突然変異株をコール
酸を含む栄養培地で培養することにより、３α−ヒドロ
キシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸を生成させる
ことができる。
コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β
−コラン酸に変換する能力を有する突然変異株をコール
酸を含む栄養培地で培養することにより、３α−ヒドロ
キシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸を生成させる
ことができる。
【００５３】又、本発明によれば、バチルス属に属し、
コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸に変換する能力を有する突然変異株をコー
ル酸を含む栄養培地で培養することにより、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成さ
せることができる。
コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸に変換する能力を有する突然変異株をコー
ル酸を含む栄養培地で培養することにより、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成さ
せることができる。
【００５４】栄養培地中における基質、すなわちケノデ
オキシコール酸またはコール酸の濃度は、特に限定はな
いが、目的とする変換生成物の収量、培養条件から、５
〜500g/l、好ましくは40〜300g/lの範囲とするのが適当
である。
オキシコール酸またはコール酸の濃度は、特に限定はな
いが、目的とする変換生成物の収量、培養条件から、５
〜500g/l、好ましくは40〜300g/lの範囲とするのが適当
である。
【００５５】本発明において使用することができる培地
としては、本発明で使用する微生物が培養により増殖し
得るものであれば任意のものでよく、例えば炭素源とし
ては、グルコース、フラクトース、スクロース、グリセ
リン、澱粉、フスマ、廃糖蜜等の各種糖質原料を、窒素
源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
スティープリカー、大豆粉、菜種油粕、尿素、各種アミ
ノ酸、アミノ糖等の有機窒素含有物質や、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素
化合物を用いることができる。又、この他、微量の無機
金属塩類、ビタミン類、生長促進因子等を添加すること
が好ましい。
としては、本発明で使用する微生物が培養により増殖し
得るものであれば任意のものでよく、例えば炭素源とし
ては、グルコース、フラクトース、スクロース、グリセ
リン、澱粉、フスマ、廃糖蜜等の各種糖質原料を、窒素
源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
スティープリカー、大豆粉、菜種油粕、尿素、各種アミ
ノ酸、アミノ糖等の有機窒素含有物質や、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素
化合物を用いることができる。又、この他、微量の無機
金属塩類、ビタミン類、生長促進因子等を添加すること
が好ましい。
【００５６】本発明方法における培養は好気的条件下
に、例えば通気攪拌や往復振盪方法によって培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
いえば、温度20〜40℃、pH７〜11、１〜６日程度の条件
で実施する。
に、例えば通気攪拌や往復振盪方法によって培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
いえば、温度20〜40℃、pH７〜11、１〜６日程度の条件
で実施する。
【００５７】なお、高アルカリ側のpH、例えばpH10で培
養を行う場合には、培養中における雑菌混入のおそれが
少なく、通常行われる培地の滅菌操作を省略することが
できる。もっとも、かかる場合でも滅菌操作を行うこと
は何ら差し支えない。
養を行う場合には、培養中における雑菌混入のおそれが
少なく、通常行われる培地の滅菌操作を省略することが
できる。もっとも、かかる場合でも滅菌操作を行うこと
は何ら差し支えない。
【００５８】培養終了物から目的とする変換生成物、す
なわち、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン
酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラ
ン酸または３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸を採取するには、まず培養物中の菌及び不
溶成分を濾過又は遠心分離等により分離除去し、得られ
た培養濾液又は上清に塩酸又は硫酸を加えて酸性とす
る。これにより、生成した変換生成物が収率良く沈澱す
る。次に、この沈澱物を濾別し、再結晶操作を行うこと
により、高純度の変換生成物を回収することができる。
なわち、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン
酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラ
ン酸または３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸を採取するには、まず培養物中の菌及び不
溶成分を濾過又は遠心分離等により分離除去し、得られ
た培養濾液又は上清に塩酸又は硫酸を加えて酸性とす
る。これにより、生成した変換生成物が収率良く沈澱す
る。次に、この沈澱物を濾別し、再結晶操作を行うこと
により、高純度の変換生成物を回収することができる。
【００５９】これらの変換生成物は、いずれも更に微生
物変換に付し、又は化学反応と組み合わせることによ
り、ウルソデオキシコール酸に誘導することができる。
物変換に付し、又は化学反応と組み合わせることによ
り、ウルソデオキシコール酸に誘導することができる。
【００６０】
【実施例】以下、本発明を実施例をもって説明するが、
本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものでない
ことはいうまでもない。
本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものでない
ことはいうまでもない。
【００６１】各実施例において、生成物の同定は、以下
の条件による薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロ
マトグラフィーにより行った。
の条件による薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロ
マトグラフィーにより行った。
【００６２】（１）薄層クロマトグラフィー： 〔担体〕Kieselgel 60 (0.25mm厚、メルク社製） 〔展開溶媒〕（１） ベンゼン／イソプロピルアルコー
ル／酢酸(40/10/1 体積比) (2) クロロホルム／アセトン／酢酸(7/2/1 体積比) 〔発色〕リンモリブデン酸−硫酸試薬（リンモリブデン
酸1gをメタノール２0mlに溶解し、濃硫酸１mlを添加し
たもの) を噴霧し、胆汁酸スポットが濃青色となるまで
加熱発色する。
ル／酢酸(40/10/1 体積比) (2) クロロホルム／アセトン／酢酸(7/2/1 体積比) 〔発色〕リンモリブデン酸−硫酸試薬（リンモリブデン
酸1gをメタノール２0mlに溶解し、濃硫酸１mlを添加し
たもの) を噴霧し、胆汁酸スポットが濃青色となるまで
加熱発色する。
【００６３】［試料のチャージ］培養液１μl を添着す
る。
る。
【００６４】（２）高速液体クロマトグラフィー： (1) 〔カラム〕カプセルパックＣ18カラム（タイプ AG
120, S-5μm,カラムサイズ 4.6φ×150mm 、資生堂製) 〔移動相〕メタノール／精製水／リン酸（70/30/0.02M
重量比) 〔流速〕 1.7ml／min (2) 〔カラム〕イナートシルＯＤＳカラム（カラムサイ
ズ 4.6φ×250mm 、ジーエルサイエンス製) 〔移動相〕メタノール／精製水／リン酸（70/30/0.02M
重量比) 〔流速〕 1.0ml／min 〔検出〕ＲＩ 〔ピークの同定〕標準品と照合 各突然変異株の分離は次の方法によった。
120, S-5μm,カラムサイズ 4.6φ×150mm 、資生堂製) 〔移動相〕メタノール／精製水／リン酸（70/30/0.02M
重量比) 〔流速〕 1.7ml／min (2) 〔カラム〕イナートシルＯＤＳカラム（カラムサイ
ズ 4.6φ×250mm 、ジーエルサイエンス製) 〔移動相〕メタノール／精製水／リン酸（70/30/0.02M
重量比) 〔流速〕 1.0ml／min 〔検出〕ＲＩ 〔ピークの同定〕標準品と照合 各突然変異株の分離は次の方法によった。
【００６５】（１）バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌
株、及びバチルス・エスピー TTUR 2-M5菌株。
株、及びバチルス・エスピー TTUR 2-M5菌株。
【００６６】アルカリ性ＮＡ培地（組成：普通ブイヨン
‘栄研’（商品名）1.8%、寒天1.8%、炭酸ナトリウム0.
75% 、pH10) のスラントに生育させたバチルス・エスピ
ー TTUR 2-2 菌株を一白金耳量取り、ホリコシ培地Ｉ
（組成：グルコース1%、ペプトン0.5%、イーストエキス
0.5%、リン酸一水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム・
７水和物0.02% 、炭酸ナトリウム1%、pH10) 20ml入りの
試験管 (30φ×190mm)に接種し、30℃で16時間振盪培養
した。
‘栄研’（商品名）1.8%、寒天1.8%、炭酸ナトリウム0.
75% 、pH10) のスラントに生育させたバチルス・エスピ
ー TTUR 2-2 菌株を一白金耳量取り、ホリコシ培地Ｉ
（組成：グルコース1%、ペプトン0.5%、イーストエキス
0.5%、リン酸一水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム・
７水和物0.02% 、炭酸ナトリウム1%、pH10) 20ml入りの
試験管 (30φ×190mm)に接種し、30℃で16時間振盪培養
した。
【００６７】次に、対数増殖期にある上記菌体を遠心分
離操作により無菌的に集菌し、0.1Mトリス−マレイン酸
緩衝液（pH8.0)10mlで３回洗浄操作を行った。洗浄後の
菌体を同一緩衝液25mlに懸濁し、これに終濃度が60μg/
mlとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下、ＮＴＧという）を添加し、30℃で
30分間インキュベートして突然変異処理を行った。な
お、この処理条件下でのバチルス・エスピー TTUR 2-2
の死滅率は85％であった。
離操作により無菌的に集菌し、0.1Mトリス−マレイン酸
緩衝液（pH8.0)10mlで３回洗浄操作を行った。洗浄後の
菌体を同一緩衝液25mlに懸濁し、これに終濃度が60μg/
mlとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下、ＮＴＧという）を添加し、30℃で
30分間インキュベートして突然変異処理を行った。な
お、この処理条件下でのバチルス・エスピー TTUR 2-2
の死滅率は85％であった。
【００６８】次に、この菌懸濁液１mlを採取し、直ちに
９mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5) で希釈して遠
心分離操作により集菌し、さらに同一緩衝液による洗浄
操作を２回繰り返した後、アルカリ性ＮＢ培地（組成：
普通ブイヨン‘栄研’1.8%、炭酸ナトリウム0.75% 、pH
10) 10mlに懸濁した。得られた菌懸濁液をアルカリ性Ｎ
Ｂ培地で適宜希釈し、これをアルカリ性ＮＡ平板培地上
で10〜 100個のコロニーを出現させるように塗布した
後、30℃で２日間培養した。
９mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5) で希釈して遠
心分離操作により集菌し、さらに同一緩衝液による洗浄
操作を２回繰り返した後、アルカリ性ＮＢ培地（組成：
普通ブイヨン‘栄研’1.8%、炭酸ナトリウム0.75% 、pH
10) 10mlに懸濁した。得られた菌懸濁液をアルカリ性Ｎ
Ｂ培地で適宜希釈し、これをアルカリ性ＮＡ平板培地上
で10〜 100個のコロニーを出現させるように塗布した
後、30℃で２日間培養した。
【００６９】出現したコロニーのうち、２日後に生育
し、かつコロニーサイズが中程度のものを単離し、５％
ＣＡ寒天培地（組成：ホリコシ培地Ｉにコール酸５％、
水酸化ナトリウム0.5%、寒天1.8%を添加したもの、pH1
0) のスラントに移植し、30℃で３日間培養した。十分
生育した菌株を選択し、その一白金耳量を５％ＣＡ液体
培地（組成：５％ＣＡ寒天培地より寒天を除いたもの、
pH10) の入った試験管（培地量４ml、16.5φ×165mm)に
接種し、30℃で３日間振盪培養した。得られたそれぞれ
の培養液中の変換生成物を薄層クロマトグラフィーで検
討し、コール酸の３位水酸基をケト基に変換する能力を
完全に欠如した突然変異株（バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株及びバチルス・エスピー TTUR 2-M5菌株) をそ
れぞれ見い出した。以下、上述した突然変異株取得方法
を単にＮＴＧ処理と称する。
し、かつコロニーサイズが中程度のものを単離し、５％
ＣＡ寒天培地（組成：ホリコシ培地Ｉにコール酸５％、
水酸化ナトリウム0.5%、寒天1.8%を添加したもの、pH1
0) のスラントに移植し、30℃で３日間培養した。十分
生育した菌株を選択し、その一白金耳量を５％ＣＡ液体
培地（組成：５％ＣＡ寒天培地より寒天を除いたもの、
pH10) の入った試験管（培地量４ml、16.5φ×165mm)に
接種し、30℃で３日間振盪培養した。得られたそれぞれ
の培養液中の変換生成物を薄層クロマトグラフィーで検
討し、コール酸の３位水酸基をケト基に変換する能力を
完全に欠如した突然変異株（バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株及びバチルス・エスピー TTUR 2-M5菌株) をそ
れぞれ見い出した。以下、上述した突然変異株取得方法
を単にＮＴＧ処理と称する。
【００７０】（２）バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250
菌株、及びバチルス・エスピー TTUR2-M4-294菌株。
菌株、及びバチルス・エスピー TTUR2-M4-294菌株。
【００７１】（１）のＮＴＧ処理で得られたバチルス・
エスピー TTUR 2-M4を親株として、ＮＴＧ処理を繰り返
した。但し、初発菌体増殖培地として５％ＣＡ液体培地
を用い、ＮＴＧ処理時のＮＴＧ濃度を60μg/mlとした。
その結果、目的とするコール酸の３位水酸基及び１２位
水酸基をケト基に変換する能力を完全に欠如した突然変
異株（バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250菌株及びバチ
ルス・エスピー TTUR2-M4-294菌株) をそれぞれ見出し
た。なお、本操作におけるバチルス・エスピーTTUR 2-M
4 菌株の死滅率は、15％であった。
エスピー TTUR 2-M4を親株として、ＮＴＧ処理を繰り返
した。但し、初発菌体増殖培地として５％ＣＡ液体培地
を用い、ＮＴＧ処理時のＮＴＧ濃度を60μg/mlとした。
その結果、目的とするコール酸の３位水酸基及び１２位
水酸基をケト基に変換する能力を完全に欠如した突然変
異株（バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250菌株及びバチ
ルス・エスピー TTUR2-M4-294菌株) をそれぞれ見出し
た。なお、本操作におけるバチルス・エスピーTTUR 2-M
4 菌株の死滅率は、15％であった。
【００７２】（１）及び（２）のＮＴＧ処理で得られた
突然変異株を５％ケノデオキシコール酸を含むホリコシ
培地Ｉ中で30℃で３日間試験管振盪培養（培地量４ml、
試験管16.5φ×165mm)し、得られた変換生成物を薄層ク
ロマトグラフィーで検討したところ、目的とする３α−
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸が特異的に生成
していることを確認した。
突然変異株を５％ケノデオキシコール酸を含むホリコシ
培地Ｉ中で30℃で３日間試験管振盪培養（培地量４ml、
試験管16.5φ×165mm)し、得られた変換生成物を薄層ク
ロマトグラフィーで検討したところ、目的とする３α−
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸が特異的に生成
していることを確認した。
【００７３】〔実施例１〕バチルス・エスピー TTUR 2-
2(Bacillus sp. TTUR 2-2,微工研条寄第3651号)を以下
に示す方法で培養した。グルコース10g 、ペプトン5g、
イースト・エキス5g、リン酸一水素カリウム1g、硫酸マ
グネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに溶解し、ま
たケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウム5g、炭
酸ナトリウム10g を精製水500ml に溶解し、それぞれ 1
21℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(pH1
0)。
2(Bacillus sp. TTUR 2-2,微工研条寄第3651号)を以下
に示す方法で培養した。グルコース10g 、ペプトン5g、
イースト・エキス5g、リン酸一水素カリウム1g、硫酸マ
グネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに溶解し、ま
たケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウム5g、炭
酸ナトリウム10g を精製水500ml に溶解し、それぞれ 1
21℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(pH1
0)。
【００７４】この培地20mlを試験管（3 φ×19cm) に分
注後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール酸及
び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入りの
試験管中で30℃で20時間振盪培養して増殖させた菌液
0.1mlを無菌的に接種した。その後30℃で２日間振盪培
養した。
注後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール酸及
び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入りの
試験管中で30℃で20時間振盪培養して増殖させた菌液
0.1mlを無菌的に接種した。その後30℃で２日間振盪培
養した。
【００７５】培養後、遠心分離で菌体を除去し、得られ
た培養上清に希硫酸を添加して酸性にすると、３α−ヒ
ドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸及び未変換のケノ
デオキシコール酸が沈澱した。この沈澱物を採取し、乾
燥して白色粉末 0.98gを得た。この一部を取り、高速液
体クロマトグラフィーにより、ケノデオキシコール酸、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸及びその
他のケノデオキシコール酸酸化生成物( 以下「他の胆汁
酸」という。) の生成率を求めたところ、ケノデオキシ
コール酸2.8%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コ
ラン酸 85.9%及び他の胆汁酸11.3% であった。混合物を
メタノールから再結晶して、純粋な３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸を得た。
た培養上清に希硫酸を添加して酸性にすると、３α−ヒ
ドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸及び未変換のケノ
デオキシコール酸が沈澱した。この沈澱物を採取し、乾
燥して白色粉末 0.98gを得た。この一部を取り、高速液
体クロマトグラフィーにより、ケノデオキシコール酸、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸及びその
他のケノデオキシコール酸酸化生成物( 以下「他の胆汁
酸」という。) の生成率を求めたところ、ケノデオキシ
コール酸2.8%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コ
ラン酸 85.9%及び他の胆汁酸11.3% であった。混合物を
メタノールから再結晶して、純粋な３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸を得た。
【００７６】〔実施例２〕実施例１の菌体をバチルス・
エスピー TTUR 4-1(Bacillus sp. TTUR 4-1,微工研菌寄
第 11862号) とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸1.
6%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸75.3
％及び他の胆汁酸 23.1%であった。
エスピー TTUR 4-1(Bacillus sp. TTUR 4-1,微工研菌寄
第 11862号) とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸1.
6%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸75.3
％及び他の胆汁酸 23.1%であった。
【００７７】〔実施例３〕実施例１の菌株をバチルス・
エスピー TTUR 4-2(Bacillus sp. TTUR 4-2,微工研菌寄
第 11863号) とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸０
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸87.7
％及び他の胆汁酸 12.3%であった。
エスピー TTUR 4-2(Bacillus sp. TTUR 4-2,微工研菌寄
第 11863号) とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸０
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸87.7
％及び他の胆汁酸 12.3%であった。
【００７８】〔実施例４〕グルコース 10g、ペプトン5
g、イースト・エキス5g、リン酸一水素カリウム1g、硫
酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに溶解
し、またケノデオキシコール酸100g、水酸化ナトリウム
10g 、炭酸ナトリウム10g を精製水500ml に溶解し、そ
れぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地と
した(pH10)。
g、イースト・エキス5g、リン酸一水素カリウム1g、硫
酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに溶解
し、またケノデオキシコール酸100g、水酸化ナトリウム
10g 、炭酸ナトリウム10g を精製水500ml に溶解し、そ
れぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地と
した(pH10)。
【００７９】この培地 100mlを坂口フラスコ(500ml容)
に分注後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール
酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入
りの試験管（3 φ×19cm) 中で30℃で20時間振盪培養し
て増殖させたバチルス・エスピー TTUR 2-2 の菌液 0.1
mlを無菌的に接種した。その後30℃で４日間振盪培養し
た。
に分注後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール
酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入
りの試験管（3 φ×19cm) 中で30℃で20時間振盪培養し
て増殖させたバチルス・エスピー TTUR 2-2 の菌液 0.1
mlを無菌的に接種した。その後30℃で４日間振盪培養し
た。
【００８０】以下実施例１と同様に処理して粗製の３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を得た。生成
比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸は4.2%、３
α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸88.5% 及び
他の胆汁酸7.3%であった。
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を得た。生成
比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸は4.2%、３
α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸88.5% 及び
他の胆汁酸7.3%であった。
【００８１】〔実施例５〕実施例２の水酸化ナトリウム
を7g(pH10.5)とした以外は、実施例２と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸4.
2%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸85.9
% 及び他の胆汁酸9.9%であった。
を7g(pH10.5)とした以外は、実施例２と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸4.
2%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸85.9
% 及び他の胆汁酸9.9%であった。
【００８２】〔実施例６〕実施例３のケノデオキシコー
ル酸を150g、水酸化ナトリウムを 15gとし、培養日数を
４日間とした以外は、実施例３と同様に操作した。生成
比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸22.2% 、３
α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸65.3% 及び
他の胆汁酸12.5% であった。
ル酸を150g、水酸化ナトリウムを 15gとし、培養日数を
４日間とした以外は、実施例３と同様に操作した。生成
比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸22.2% 、３
α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸65.3% 及び
他の胆汁酸12.5% であった。
【００８３】〔実施例７〕バチルス・エスピー TTUR 2-
M4(Bacillus sp. TTUR 2-M4)菌株（微工研条寄第3393
号) を以下に示す方法で培養した。グルコース 10g、ペ
プトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリウム1
g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水500mlに溶
解し、又ケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウム
5g 、炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、そ
れぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地と
した(pH10)。
M4(Bacillus sp. TTUR 2-M4)菌株（微工研条寄第3393
号) を以下に示す方法で培養した。グルコース 10g、ペ
プトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリウム1
g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水500mlに溶
解し、又ケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウム
5g 、炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、そ
れぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地と
した(pH10)。
【００８４】この培地20mlを試験管(3φ×19cm) に分注
後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール酸及び
水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入りの試
験管中30℃で一夜振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを
無菌的に接種した。その後30℃で３日間振盪培養した。
後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール酸及び
水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入りの試
験管中30℃で一夜振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを
無菌的に接種した。その後30℃で３日間振盪培養した。
【００８５】培養後、遠心分離で菌体を除去し、得られ
た培養上清に希硫酸を加えて酸性にすると、沈澱物が生
成した。この沈澱物を採取し、乾燥して白色粉末0.999g
を得た。この一部を採り、高速液体クロマトグラフィー
により、ケノデオキシコール酸及び３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸の生成比率を求めたところ、
ケノデオキシコール酸 0% 、３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸100%（回収率99.9%)であった。
た培養上清に希硫酸を加えて酸性にすると、沈澱物が生
成した。この沈澱物を採取し、乾燥して白色粉末0.999g
を得た。この一部を採り、高速液体クロマトグラフィー
により、ケノデオキシコール酸及び３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸の生成比率を求めたところ、
ケノデオキシコール酸 0% 、３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸100%（回収率99.9%)であった。
【００８６】〔実施例８〕実施例７の菌株をバチルス・
エスピー TTUR 2-M5(Bacillus sp. TTUR 2-M5)菌株（微
工研条寄第3398号) とした以外は、実施例７と同様に操
作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸0%、３α−
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸100%（回収率9
9.9%)であった。
エスピー TTUR 2-M5(Bacillus sp. TTUR 2-M5)菌株（微
工研条寄第3398号) とした以外は、実施例７と同様に操
作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸0%、３α−
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸100%（回収率9
9.9%)であった。
【００８７】〔実施例９〕実施例７の菌株をバチルス・
エスピー TTUR 2-M4-250 (Bacillus sp. TTUR 2-M4-25
0) 菌株（微工研条寄第3395号) とした以外は、実施例
７と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール
酸0%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸10
0%（回収率99.9%)であった。
エスピー TTUR 2-M4-250 (Bacillus sp. TTUR 2-M4-25
0) 菌株（微工研条寄第3395号) とした以外は、実施例
７と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール
酸0%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸10
0%（回収率99.9%)であった。
【００８８】〔実施例１０〕実施例７の菌株をバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-294 (Bacillus sp. TTUR 2-M4-2
94) 菌株（微工研条寄第3396号) とした以外は、実施例
７と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール
酸1.4%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸
98.6% （回収率99.9%)であった。
・エスピー TTUR 2-M4-294 (Bacillus sp. TTUR 2-M4-2
94) 菌株（微工研条寄第3396号) とした以外は、実施例
７と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール
酸1.4%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸
98.6% （回収率99.9%)であった。
【００８９】〔実施例１1 〕実施例７の培地からグルコ
ースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例７と同
様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100
％であった。
ースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例７と同
様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100
％であった。
【００９０】〔実施例１２〕実施例１０の培地からグル
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例１０
と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸
０％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 1
00％であった。
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例１０
と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸
０％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 1
00％であった。
【００９１】〔実施例１３〕バチルス・エスピー TTUR
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。イーストエキス
5g、リン酸一水素カリウム1g、硫酸マグネシウム・７水
和物0.2gを精製水 500mlに溶解し、又ケノデオキシコー
ル酸 50g、水酸化ナトリウム 5g 、炭酸ナトリウム 4g
を精製水 500mlに溶解し、それぞれ 121℃で15分間滅菌
した。冷却後混合し、培地とした(pH9.7) 。
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。イーストエキス
5g、リン酸一水素カリウム1g、硫酸マグネシウム・７水
和物0.2gを精製水 500mlに溶解し、又ケノデオキシコー
ル酸 50g、水酸化ナトリウム 5g 、炭酸ナトリウム 4g
を精製水 500mlに溶解し、それぞれ 121℃で15分間滅菌
した。冷却後混合し、培地とした(pH9.7) 。
【００９２】以下、実施例８と同様に操作した。生成比
率は、ケノデオキシコール酸０％、３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸 100％であった。
率は、ケノデオキシコール酸０％、３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸 100％であった。
【００９３】〔実施例１４〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例１３と同様
に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０％、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％で
あった。
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例１３と同様
に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０％、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％で
あった。
【００９４】〔実施例１５〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白(アシ゛フ゜ロン
E3;商品名、味の素社製)10g、リン酸一水素カリウム1
g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに
溶解し、又ケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウ
ム 5g 、炭酸ナトリウム 2g を精製水 500mlに溶解し、
それぞれ121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地
とした(pH10.2)。
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白(アシ゛フ゜ロン
E3;商品名、味の素社製)10g、リン酸一水素カリウム1
g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに
溶解し、又ケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウ
ム 5g 、炭酸ナトリウム 2g を精製水 500mlに溶解し、
それぞれ121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地
とした(pH10.2)。
【００９５】以下、実施例７と同様に操作した。生成比
率は、ケノデオキシコール酸０％、３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸 100％であった。
率は、ケノデオキシコール酸０％、３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸 100％であった。
【００９６】〔実施例１６〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M5を用いた以外は、実施例１５と同様に操
作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０％、３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％であっ
た。
ピー TTUR 2-M5を用いた以外は、実施例１５と同様に操
作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０％、３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％であっ
た。
【００９７】〔実施例１７〕バチルス・エスピー TTUR
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又ケノデオキシコール酸100g、水酸化ナト
リウム10g 、炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解
し、それぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、
培地とした(pH10)。
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又ケノデオキシコール酸100g、水酸化ナト
リウム10g 、炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解
し、それぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、
培地とした(pH10)。
【００９８】この培地 100mlを坂口フラスコ(500ml容)
に分注後、あらかじめ上記と同一組成の培地20ml入りの
試験管（3 φ×19cm) 中30℃で48時間振盪培養して増殖
させた菌液２mlを無菌的に接種した。その後30℃で６日
間振盪培養した。
に分注後、あらかじめ上記と同一組成の培地20ml入りの
試験管（3 φ×19cm) 中30℃で48時間振盪培養して増殖
させた菌液２mlを無菌的に接種した。その後30℃で６日
間振盪培養した。
【００９９】以下、実施例８と同様に操作した。生成比
率は、ケノデオキシコール酸 5.8％、３α−ヒドロキシ
−７−ケト−５β−コラン酸94.2％であった。
率は、ケノデオキシコール酸 5.8％、３α−ヒドロキシ
−７−ケト−５β−コラン酸94.2％であった。
【０１００】〔実施例１８〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又コール酸 50g、水酸化ナトリウム 5g 、
炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、それぞれ
121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(p
H10)。
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又コール酸 50g、水酸化ナトリウム 5g 、
炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、それぞれ
121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(p
H10)。
【０１０１】この培地20mlを試験管（3 φ×19cm) に分
注後、あらかじめ上記培地からコール酸及び水酸化ナト
リウムを除いた同一組成の培地20ml入りの試験管中30℃
で一夜振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを無菌的に接
種した。その後30℃で３日間振盪培養した。
注後、あらかじめ上記培地からコール酸及び水酸化ナト
リウムを除いた同一組成の培地20ml入りの試験管中30℃
で一夜振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを無菌的に接
種した。その後30℃で３日間振盪培養した。
【０１０２】以下、実施例７と同様に操作してコール酸
及び３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラ
ン酸の生成比率を求めたところ、コール酸0%、３α−ヒ
ドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸100%（回
収率99.7%)であった。
及び３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラ
ン酸の生成比率を求めたところ、コール酸0%、３α−ヒ
ドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸100%（回
収率99.7%)であった。
【０１０３】〔実施例１９〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M5を用い、培養日数を２日間とした以外
は、実施例１８と同様に操作した。生成比率は、コール
酸０％、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−
コラン酸98.2％、３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸1.4%、３α，７α−ジヒドロキシ−
１２−ケト−５β−コラン酸0.3%（回収率99.6%)であっ
た。
ピー TTUR 2-M5を用い、培養日数を２日間とした以外
は、実施例１８と同様に操作した。生成比率は、コール
酸０％、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−
コラン酸98.2％、３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸1.4%、３α，７α−ジヒドロキシ−
１２−ケト−５β−コラン酸0.3%（回収率99.6%)であっ
た。
【０１０４】〔実施例２０〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例１８と同様
に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α，１２α
−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％であ
った。
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例１８と同様
に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α，１２α
−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％であ
った。
【０１０５】〔実施例２１〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-294を用いた以外は、実施例１８と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 0.8％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.2％で
あった。
ピー TTUR 2-M4-294を用いた以外は、実施例１８と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 0.8％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.2％で
あった。
【０１０６】〔実施例２２〕実施例１９の培地からグル
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例１９
と同様に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α−
ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸 100％
であった。
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例１９
と同様に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α−
ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸 100％
であった。
【０１０７】〔実施例２３〕実施例２１の培地からグル
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例２１
と同様に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α，
１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100
％であった。
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例２１
と同様に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α，
１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100
％であった。
【０１０８】〔実施例２４〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白（エス
サンミート；商品名、味の素社製）10g 、リン酸一水素
カリウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水
500mlに溶解し、又コール酸 50g、水酸化ナトリウム 5
g 、炭酸ナトリウム２g を精製水 500mlに溶解し、それ
ぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とし
た(pH10.2)。
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白（エス
サンミート；商品名、味の素社製）10g 、リン酸一水素
カリウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水
500mlに溶解し、又コール酸 50g、水酸化ナトリウム 5
g 、炭酸ナトリウム２g を精製水 500mlに溶解し、それ
ぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とし
た(pH10.2)。
【０１０９】以下、実施例１８と同様に操作した。生成
比率は、コール酸０％、３α−ヒドロキシ−７, １２−
ジケト−５β−コラン酸99.5% 、３α，１２α−ジヒド
ロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 0.3％、３α，７α
−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸 0.2% で
あった。
比率は、コール酸０％、３α−ヒドロキシ−７, １２−
ジケト−５β−コラン酸99.5% 、３α，１２α−ジヒド
ロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 0.3％、３α，７α
−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸 0.2% で
あった。
【０１１０】〔実施例２５〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２４と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 0.5％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.5％で
あった。
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２４と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 0.5％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.5％で
あった。
【０１１１】〔実施例２６〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又コール酸100g、水酸化ナトリウム10g 、
炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、それぞれ
121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(p
H10)。
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又コール酸100g、水酸化ナトリウム10g 、
炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、それぞれ
121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(p
H10)。
【０１１２】この培地20mlを試験管(3φ×19cm) に分注
後、あらかじめ上記と同一組成の培地20ml入りの試験管
中30℃で24時間振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを無
菌的に接種した。その後30℃で４日間振盪培養した。
後、あらかじめ上記と同一組成の培地20ml入りの試験管
中30℃で24時間振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを無
菌的に接種した。その後30℃で４日間振盪培養した。
【０１１３】以下、実施例１９と同様に操作した。生成
比率は、コール酸 2.0％、３α−ヒドロキシ−７，１２
−ジケト−５β−コラン酸74.0％、３α，１２α−ジヒ
ドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸12.8% 、３α，７
α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸11.2%
であった。
比率は、コール酸 2.0％、３α−ヒドロキシ−７，１２
−ジケト−５β−コラン酸74.0％、３α，１２α−ジヒ
ドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸12.8% 、３α，７
α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸11.2%
であった。
【０１１４】〔実施例２７〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２６と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 5.0％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸95.0％で
あった。
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２６と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 5.0％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸95.0％で
あった。
【０１１５】〔実施例２８〕バチルス・エスピー TTUR
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白（アジ
プロン E3)10g 、イーストエキス1g、リン酸一水素カリ
ウム2g、硫酸マグネシウム・７水和物0.4gを精製水1000
mlに溶解し、又ケノデオキシコール酸100g、水酸化ナト
リウム10g 、炭酸ナトリウム５g を精製水1000mlに溶解
した。これらを滅菌することなく、5l容の卓上型ジャー
ファーメンター装置内で混合し、培地とした(pH10.4)。
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白（アジ
プロン E3)10g 、イーストエキス1g、リン酸一水素カリ
ウム2g、硫酸マグネシウム・７水和物0.4gを精製水1000
mlに溶解し、又ケノデオキシコール酸100g、水酸化ナト
リウム10g 、炭酸ナトリウム５g を精製水1000mlに溶解
した。これらを滅菌することなく、5l容の卓上型ジャー
ファーメンター装置内で混合し、培地とした(pH10.4)。
【０１１６】あらかじめ上記培地からケノデオキシコー
ル酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml
入りの試験管中30℃で20時間振盪培養して増殖させたバ
チルス・エスピー TTUR 2-M5菌液40mlをこの培地に接種
した。その後、通気量2l/min、30℃で３日間攪拌（300r
pm) 培養した。
ル酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml
入りの試験管中30℃で20時間振盪培養して増殖させたバ
チルス・エスピー TTUR 2-M5菌液40mlをこの培地に接種
した。その後、通気量2l/min、30℃で３日間攪拌（300r
pm) 培養した。
【０１１７】培養後、遠心分離(3500rpm×15min)で菌体
を除去し、得られた培養上清に希硫酸を加えてpH2.5 に
すると、沈澱物が生成した。この沈澱物を濾別、水洗
し、得られた結晶を50℃で乾燥して白色粉末 99.2gを得
た。この一部を採り、高速液体クロマトグラフィーによ
り、生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸0
%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸100%
（回収率99.1%)であった。
を除去し、得られた培養上清に希硫酸を加えてpH2.5 に
すると、沈澱物が生成した。この沈澱物を濾別、水洗
し、得られた結晶を50℃で乾燥して白色粉末 99.2gを得
た。この一部を採り、高速液体クロマトグラフィーによ
り、生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸0
%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸100%
（回収率99.1%)であった。
【０１１８】〔実施例２９〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２８と同様
に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸 0.5
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.5
％（回収率99.0%)であった。
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２８と同様
に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸 0.5
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.5
％（回収率99.0%)であった。
【０１１９】
【発明の効果】本発明に係るバチルス属の新規微生物を
用いる場合には高濃度の基質ケノデオキシコール酸また
はコール酸を、高収率で、ウルソデオキシコール酸の製
造中間体である、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β
−コラン酸または３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸に変換することができる。
用いる場合には高濃度の基質ケノデオキシコール酸また
はコール酸を、高収率で、ウルソデオキシコール酸の製
造中間体である、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β
−コラン酸または３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸に変換することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９６ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/20 C12P 33/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】バチルス属に属し、以下の化学式で示され
る化合物（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｘは水素または水酸基を表す。）を以下の化学
式で示される化合物（II） 【化２】 （式中、Ｙ1およびＹ2は、Ｘが水素の場合にはＹ1およ
びＹ2は共に水素を表し、Ｘが水酸基の場合にはＹ1は水
酸基、Ｙ2は水素を表すか、Ｙ1Ｙ2が一緒になってケト
基を表す。）に変換する能力を有する微生物を化合物
（Ｉ）を含む栄養培地で培養して培養物中に化合物（I
I）を生成せしめ、これを採取することを特徴とする化
合物（II）の製造方法。 - 【請求項２】ケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキシ
−７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有するバ
チルス属に属するバチルス・エスピー TTUR 2-2ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３６５１（微工研条寄第３６５１号）、バチ
ルス・エスピーTTUR 4-1 ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６２
（微工研菌寄第１１８６２号）、バチルス・エスピー T
TUR 4-2 ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６３（微工研菌寄第１
１８６３号）、バチルス・エスピー TTUR 2-M4 ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３３９３（微工研条寄第３３９３号）、バチ
ルス・エスピー TTUR 2-M5 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９８
（微工研条寄第３３９８号）、バチルス・エスピー TTU
R 2-M4-250 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９５（微工研条寄第
３３９５号）又はバチルス・エスピー TTUR 2-M4-294
ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９６（微工研条寄第３３９６
号）。 - 【請求項３】 請求項１記載の製造方法であって、バチ
ルス属に属し、ケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する
微生物をケノデオキシコール酸を含む栄養培地で培養し
て培養物中に３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラ
ン酸を生成せしめ、これを採取することを特徴とする３
α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸の製造方
法。 - 【請求項４】微生物が、バチルス・エスピー TTUR 2-2
ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５１（微工研条寄第３６５１
号）、バチルス・エスピー TTUR 4-１ ＦＥＲＭＰ−１
１８６２（微工研菌寄第１１８６２号）、バチルス・エ
スピー TTUR 4-2ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６３（微工研菌
寄第１１８６３号）、バチルス・エスピー TTUR 2-M4
ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９３（微工研条寄第３３９３
号）、バチルス・エスピー TTUR 2-M5 ＦＥＲＭ ＢＰ
−３３９８（微工研条寄第３３９８号）、バチルス・エ
スピー TTUR 2-M4-250 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９５（微
工研条寄第３３９５号）又はバチルス・エスピー TTUR
2-M4-294 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９６（微工研条寄第３
３９６号）である請求項３の製造方法。 - 【請求項５】コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−
ジケト−５β−コラン酸に変換する能力を有するバチル
ス・エスピー TTUR 2-M4 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９３
（微工研条寄第３３９３号）又はバチルス・エスピー T
TUR 2-M5 ＦＥＲＭＢＰ−３３９８（微工研条寄第３３
９８号）。 - 【請求項６】請求項１記載の製造方法であって、バチル
ス属に属するコール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−
ジケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する微生物
をコール酸を含む栄養培地で培養して培養物中に３α−
ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸を生成
せしめ、これを採取することを特徴とする３α−ヒドロ
キシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸の製造方法。 - 【請求項７】微生物が、バチルス・エスピー TTUR 2-M4
ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９３（微工研条寄第３３９３
号）又はバチルス・エスピー TTUR 2-M5 ＦＥＲＭＢＰ
−３３９８（微工研条寄第３３９８号）である請求項６
記載の製造方法。 - 【請求項８】コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有するバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-250 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３
９５（微工研条寄第３３９５号）又はバチルス・エスピ
ー TTUR 2-M4-294ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９６（微工研条
寄第３３９６号）。 - 【請求項９】請求項１記載の製造方法であって、バチル
ス属に属し、コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する微生
物をコール酸を含む栄養培地で培養して培養物中に３
α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸
を生成せしめ、これを採取することを特徴とする３α，
１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸の製
造方法。 - 【請求項１０】微生物が、バチルス・エスピー TTUR 2-
M4-250 ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９５（微工研条寄第３３
９５号）又はバチルス・エスピー TTUR 2-M4-294ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３３９６（微工研条寄第３３９６号）である
請求項９記載の製造方法。 - 【請求項１１】栄養培地のpHが７〜11であることを特徴
とする請求項３、６又は９記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15102892A JP3156735B2 (ja) | 1991-06-12 | 1992-06-11 | 新規胆汁酸変換微生物、及び胆汁酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23674091 | 1991-06-12 | ||
| JP4-11598 | 1992-01-27 | ||
| JP3-236740 | 1992-01-27 | ||
| JP1159892 | 1992-01-27 | ||
| JP15102892A JP3156735B2 (ja) | 1991-06-12 | 1992-06-11 | 新規胆汁酸変換微生物、及び胆汁酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268944A JPH05268944A (ja) | 1993-10-19 |
| JP3156735B2 true JP3156735B2 (ja) | 2001-04-16 |
Family
ID=27279492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15102892A Expired - Fee Related JP3156735B2 (ja) | 1991-06-12 | 1992-06-11 | 新規胆汁酸変換微生物、及び胆汁酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3156735B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007058027A1 (ja) | 2005-11-18 | 2007-05-24 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | バチルス・チューリンゲンシスを含む有害菌の防除剤 |
-
1992
- 1992-06-11 JP JP15102892A patent/JP3156735B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05268944A (ja) | 1993-10-19 |
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