JPS58138380A - 微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、シェードノカルディア属に属する微生物の新
規な突然変異株に関するものである。

従来、ステロール系化合物をアントロスタン系化合物へ
変換する能力を有する微生物としては、アルスロバクタ
−（ムｒｔｈｒｏｂａａｔ＠ｒ）馬、バシルス（Ｂａｃ
ｉｎｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｉｂ・マｉｂａ・
ｔ＠ｖ１ｕｍ　）属、コリネバクテリりム（Ｃｏｒｙｎ
＠ｂａｅｔ＠ｒ１ｍｍ　）馬、ミクロバタテリクム（組
ｅｒｏｂａｅｔｅｒｉｍｍ）属、々コバクテリウム（Ｍ
ｙｓｏ−ｂａｅｔ＠ｒｉｕｍ　）属、ノカルディア（）
！＠＠ａｒｄ１ｍ　）属、プロタミノバクタ−（Ｐｒ＠
ｔａｉｍｉｍｅｉ＋ａ＠ｔ＠ｒ）属、セラチア（ｇ＠ｒ
ａｔｉｍ）属、およびストレプトマイセス（ｇｔｒｓｐ
ｔｅ−ｍｙｃ＠ｓ）異などに属する微生物の存在が全知
であるが、これらの微生物の中でキレート剤などのアン
トロスタン系化合物の酸化を阻止するための阻害剤を添
加しなくてもアントロスタン系化合物を蓄積しうるもの
としては、ミコパクテリクム属（４Ｉ開昭５２−５４０
９３号、Ｍ５２−１０５２８９号）、ブレビバクテリウ
ム属（特−１１８５４−１５８１９２号）、ノカルディ
ア属し特−１Ｉ５５−１４８０８３号）およびアルスロ
バクタ−属（轡−１８５５−１５０８９５号）Ｋ属する
微生物の突然変異株が知られている。

ロール系化合物をアントロスタン系化合物へ変換してそ
れを蓄積できる株が存在することは既に本発明者等が特
願昭５６−１４１０９７号における明細書に記載した。

しかしながら、上記の微生物は、キレート剤あるいまニ
ッケル、コバルトなどの前記酸化阻害剤（以下単に阻害
剤と呼ぶ）を添加する場合にのみアントロスタン系化合
物の蓄積が可能であるに止まり、これらの阻害剤を添加
することなくアントロスタン系化合物を蓄積しうる突然
変異株は、シュードノカルディア属に属する微生物では
今まで全く見いだされていなかった。

本発明者らは、キレート剤等の阻害剤を添加することな
くアントロスタン系化合物を大量に蓄積せしめるべく鋭
意研究を進めた結果、シュードノカルディア属に属する
微生物を変異処理することＫより、アントロスタン系化
合物な大量に蓄積する突然変異株の取得に成功し１本発
明を完成するに到った。

すなわち本発明は、アントロスタン系化合物に対する感
受性が欠失し、しかもアントロスタン系化合物の分解酵
素系が欠損または低活性化したシェードノカルディア属
に属する微生物の突然変異株に関するものである。

以下に本発明を詳述する。

シェードノカルディア属に属する微生物としてはシェー
ドノカルデイプサーモフイラ（Ｐｔｅｍｄｅｍｏ＠ａｒ
ｄ１ｍｔｈ＠ｒｍ＊ｐｈｌ１ｍ　）ムＴＣＣ−１９２８
５、シェードノカルディア・スビノサ（Ｐ、　５ｐｌｓ
ｎｓａ　）ム”ｒｃｃ−２５９２４、シェードノカルデ
イ１ファスチジオナ（Ｐ、　ｆａｓＨｄｌｅｓ畠）ムＴ
ＣＣ−３１１８１、シ瓢−ドノヵルディ了すタノリグニ
カ（Ｐ、　ｍ＠ｔｈｖａｅｌ１ｇｍｌｓｍ　）ムチＣＣ
−４１５９１４（または黴工研薗寄第４７４７号）、シ
ェードノヵルデイＴニーコテイス（Ｐ、　ｙｕｋｏｔ＠
ｓ　）ム？ＣＣ−５１５９７（または黴工研菌寄第４７
４６号）、シュートソヵルディアエスビーＡＭ−５６９
６（Ｐ、ｍｐ、ムＭ−５６９６）が知られている。

これらのうち、ステロール系化合物からアントロスタン
系化合物をキレート剤あるいはニッケル、コバルトなど
の阻害剤が存在する場合にのみ蓄積能力を有するものと
しては、シュートソカルデイ子メタノリグニカに極めて
類似した菌学的性質を有するシュードノカルディチメタ
ノリグニカバラエティＬＭ−１４５（微工研菌寄第６０
５７号）およびシェードノカルディア・メタノリグニカ
バラエティＬＭ−１２５８（黴工研薗寄６０５８号）が
あげられる（％願昭５６−１４１０９７号）。

本発明に係る突然変異株は、阻害剤の存在を必須としな
い点においてこれらの微生物とは原着に相違する。そし
て本発明における新規突然変異株の野生株は、シ二−ド
ノヵルディア・メタノリグニカム？ＣＣ−５１５９６で
ある。

シェードノカルディ予メタノリグニカは、本発明者勢ら
がメタノール資化能な有する放線菌を自然界より分離検
索した際に発見した各種微生物中の１種であり、メタノ
ールを主たる炭素源として好んで資化するとともに、メ
タノールに対する菌体収率も真野であり、かつ最適生育
温度が３７〜４５℃と比較的高温域にあるという特徴を
有している。

その他の菌学的性質については本出願人の出願に係る特
公昭５６−５５５５２号（４１１１１１５５−９４０９
１号）公報の明細書に詳述されている公知の性質と同一
であり、煩雑を避けるためＫその配置を省略する。

このシュートソカルディア・メタノリグエヵムＴＣＣ−
５１５９６（または黴工研曹寄第４７４７号）（以下野
生株と称する）は、ステロール系化合物に対する極めて
高い分解能を有しているＫもかかわらず、上記のシュー
トソヵルディ７メタノリグニカバラエティＬＭ−１４５
あるいはＬＭ−１２５８とは異なり、キレート剤等の阻
害剤の存在下においても全くアントロスタン系化合物の
蓄積能を有せず、しかもこの野生株はアントロスタン系
化合物に対する耐性が非常に低く、そのためこれらの化
合物の分解能を全く持たないのは言うまでもないという
特徴を有している。

従って、本発明者等は、まず野生株にアントロスタン系
化合物を耐性あるいは分解能を獲得せしめ、ついでアン
トロスタン系化合物着非分解性を付与せしめる２段階変
異法により本発明の突然変異株を取得した。

本発明の突然変異株の具体的な敗得方法は以下のとおり
である。

すなわち、通常の変異誘発操作、例えば紫外線照射ある
い１化学的薬剤（Ｎ−メチル−Ｗ−ニドμ−に一ニトロ
ソグアニジン、エチルメタンスルホネート等）４６１１
により野生株に変異を一発せしめ、これをアントロスタ
ン系化会物例エバアンドロスタ−１，４−ジエン−、！
、１７−／オン（以下ムＤＤと略称する）またはアンド
ロスト−４−エン−５、１７−ジオン（以下４ムＤと略
称する）を主たる炭Ｘ源とした平板培地に５〜１０日間
培養し、生じた大きなコロニーを分離取得する。

このようＫして得た突然変異株はアントロスタン系化合
物に対し耐性でありしかも資化分解能をも有するもので
ある。従ってこれらに対して上記と同様通電の変異誘発
操作により変異を誘発せしめ、アントロスタン系化合物
、例えばＡＤＤまたは４ムＤを主たる炭素源とした平板
培地と、他の炭素源、例えばダルー−スあるいはメタノ
ール、ｍ−アルカン勢とともにアントロスタン系化合物
１例えばムＤＤまたは４ムＤを同時添加した平板培地の
両者で培養し、前者において全く生育しないかまたは生
育が非常に遅く、かつ後者において良好な生育を示すコ
ロニーを分離取得する。

―、４ムＤの蓄積に耐える突然変異株については、その
中から更に選択を行い、４ムＤからムＤＤへ変換する能
力を持たないもの、即ち１．２位間脱水素酵素の欠損株
を分゛離することＫより、４ＡＤを単独に生産し蓄積す
る突然変異株となる。

このようにして得た本発明の突然変異株は、アントロス
タン系化合物の分解酵素系が欠損または低活性下し、か
つアントロスタン系化合物の蓄積に耐えうるものであり
、通常の培養条件下でステロール系化合物より大量のア
ントロスタン系化合物を生産し５る極めて有用な微生物
である。

又、本発明の突然変異株は、野生株に比し上述の性質に
おいてのみ明確に区別され、その他の菌学的性質には全
く差違が認められない。

野生株から本発明の実態変異株が誘導された過＠におけ
るステロール系化合物の代謝生理的変化の原因について
は以下の考え方が成り立つ。

■　野生株は１元来ステロール系化合物の分解代謝経絡
として一般に知られている４ムＤ、ムＤＤを経由する経
路のみならず、他の未知の分解経路も有しているが、前
者の酵素系の発現はほば完全に抑制されているため後者
の経路（即ち未知経路）のみが働いていると考える。こ
れに対し、第１段階の変異誘導操作で取得したアントロ
スタン系化合物耐性１分解性突然変異株では、逆に後者
が欠損したため例らかの形で前者の酵素系発現に対する
脱抑制が生じたものと推定するｊ ■　野生株は、４ムＤ、ムＤＤを経由するステロール系
化合物の分解代謝経絡を有しているが、その経路で働く
一連の酵素の量あるいｉ活性が着しく高いため、４ＡＤ
、ムＤＤ等アントロスタン系化合物が中間体として存在
しえない程分解代謝速度が速く、従ってキレート剤等の
阻害剤の存在下においてさえこれらがほとんど蓄積され
ないと考える。これに対し、第１段階の変異誘発操作で
取得したアントロスタン系化合物耐性、分解性集熱変異
株では、４ムＤあるいはＡＤＤ以降の分解酵素系が律速
化したものと考える。

いずれにしても、この様なことを主とした原因として、
野生株がアントロスタン系化合物耐性１分解性突然変異
株となり、これに対する再度の変異誘発操作によりアン
トロスタン系化合物非分解性が導入された結果、本発明
の実態変異株が実現されるに到ったものである。

この様にして得られた本発明集熱変異株のうち、シェー
ドノカルデイチメタノリグニカＤＩ０９４１２５株は、
主としてムＤＤの高蓄積能を有することＫより極めて重
要性を有する微生物の１つであり、これは工業技ａｍ黴
生物工業技術研究所へ微生物受託書号黴工研曹書第６２
５０号として寄託されている。

また、シェードノカルディア・メタノリダエカＤＩＣ−
９４１２７株は、１．２位間脱水素酵素が欠損され４ム
Ｄの高蓄積能を有することにより極めて重要な微生物の
他の１つである。これも同じく黴工研菌寄第６２５１号
として寄託されている。

しかしながら、本発明における微生物は、上記菌株に限
定されるものではなく、シェードノカルディア属に属し
、かつ、ステロール系化合物より中レート剤等の阻害剤
を添加することなくアントロスタン系化合物を着量蓄積
しうる微生物であれば人工集然賓異株、自然集熱変異株
を問わずいずれも包含するものである。

尚、本発明における実態変異株は、そのアントロスタン
系化合物に対する分解酵素系の欠損または低活性化した
ものである故、必然的にプレグナン系化合物、プラン系
化合物、コレスタン系化合物に対しても分解活性が欠損
あるいは低下し【いると考えられる。従って１例えばシ
ュートソカルデイｐメタノリグニー＃ＤＩ０９４１２５
株では、ノ・イドロコーチゾンを変換基質とした場合、
４ムＤ１ムＤＤと同様に１．２位間脱水素酵素によりプ
レドニソロンへ変換されるが、その後の分解が抑制され
ているためプレドニソロン収率の著しい向上につながる
ことを付記する。

本発明における実態変異株の生育培地としては、生育に
必要とする栄養源を含む培地ならばいずれも使用可能で
ある。

炭素源としては同化しうるものであればいかなるもので
もよく、例えばブドウ糖、シヨ糖、ラムノース、澱粉、
麦１糖、糖密轡の糖類、メタノール、エタノール、グリ
セリン勢のアルコール類、ｌ−アルカン、ａ−オレフィ
ン、キシレン等の炭化水素さらには酢酸、クエン酸、フ
マル酸部の有機酸類があげられる。

窃素源としては、硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウム
、尿素、ペプトン、カゼイン勢の無機又は有機物が使用
できる。無機塩類としてはカリウム、マダネシウム、亜
鉛、鉄、マンガン、銅、カルシウム等の各塩類が使用で
きる。また微量栄養素として必要に応じて酵母エキス、
崗エキス、味液、麦芽エキス、コーンスチープリカー、
急場、ビタ々ン類、核酸類、ア建ノ酸頽勢を添加しても
よい。

培養は好気条件下に行なうことが望ましく、一般に通気
攪拌培養、振盪培豐を行なうのが有利である。培養温度
は通常２５℃〜５０℃の範囲で可能であるが、好ましく
は５７℃〜４′５℃の範囲である。培地のｐＨは通常４
５〜９０の範囲で可能であるが、好ましくは６．５〜Ｚ
５の範囲である。

消泡剤が必要な場合は、一般に使用されるいずれをも添
加可能である。

界面活性剤は、特にステロール系化合物の乳化剤として
有効であり、培地中に適宜添加される。

次に、本発明における集熱変異株を用いてステロール系
化合物よりアントロスタン系化合物を生産せしめる事例
について述べる。

まず、変換基質としてのステロール系化合物としては、
例エバコレステロール、デスモスチロール、カンペステ
ロール、ハリクロナスチロール、フラジカスチロール、
エルゴステロール、β−シトステロール、スチグマステ
ロール、コルビスチロール、クリオナステロール、ポリ
フェラスチロール、フコステロール等があげられるが、
中でもコレステロール、カンペステロールおヨヒβ−シ
トステロールが好適である。また、上記ステロール類の
有機酸または無機酸とのエステル誘導体も使用できる。

これらのステロール系化合物は、精製物、粗製物、漉金
物を問わずいずれも使用でき、ステロール含有天然物、
例えば羊毛脂、魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク
油等の使用も同様に可能である。

さらには、各種ステロールあるいはステロールのエステ
ル銹導体の酸化中間体も変換基質として使用され、上記
のものも含め全て本明細書におけるステロール系化合物
の中に包含される。このような酸化中間体としては１例
えばコレスト−４−エン−３−オン、コレスタ−１，４
−−、）エン−３−オン、コレスタ−４，２２−ジエン
−５−オン、２２．２３−ビスノルコラ−５−コレエツ
タアシツドー３β−オール、２２．２５−ビスノルコラ
−１，４−ジエン−３−オン−２２−オイックアシッド
、ハイドロコーチシン、プレグネノロン、プロゲステロ
ン勢があげられる。

変換基質としてのステロール系化合物の添加は、多くの
場合、菌体生育後に行なう。その添加濃度は１５〜５゜
１／Ｉの範囲であり、好ましくは１〜１０ｆｉ／Ｉの範
囲である。

添加方法は、乾熱殺菌あるい１オートクレーブ加熱した
後、粉体のまま添加してもよいが、菌体とステロール類
との接触機会を増加させる必要があり、従ってより好ま
しくは、あらかじめ、例えばアセトン、メタノール、エ
タノール、インクロパノール、ベンジルアルコール、エ
ーテル等の溶液または懸濁液とした後、添加、分散させ
る。反応終了後、培養液から目的物であるアントロスタ
ン系化合物を通常の方法にて分離採取する。

すなわち、反応終了後の培養液を酢酸エチル、クロロホ
ルム、ｎ−へキサン、シクロヘキサン等の有機＊Ｓで抽
出し、抽出液を濃縮したのち、シリカゲル、アルミナ等
の吸着剤を充填したカラ五に吸着させ、エーテル、ベン
ゼン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、エタノ
ール勢の溶媒を用いて溶出分版する。このようにして溶
出されたアントロスタン系化合物は溶出液を濃縮し、溶
媒を留去したのち、酢酸エチル、ペン（ン等の有機Ｓ媒
から結晶化させて得られる。勿論、再結晶して精製して
も良い。

前述のとと（、従来、ステロール系化合物からアントロ
スタン系化合物を蓄積する突然変異株としては、既述の
如くミコバクテリウム属、ノカルディア属およびアルス
ロバクタ−楓等に属する微生物が知られているが、〜イ
れもＡＤＤ、４ＡＤの他に■酸物を多量に蓄積する。

すなわち、ξコバクテリウム属実態変異株の場合、２０
α−ハイドロキシーメチループレダナー１．４ｉジエン
−３−オンや２０α−ハイドロキシ−メチル−プレグナ
−４−エン−３−オンなどの中間体を−生じ、又、〕貴
ルディア属あるＬＨ！アルスロバクタ−属の突然変異株
においても、テストステロン、デヒドロテストステロン
、デヒドロエピアンドロステロンなどをかなりの量副生
ずる。これに対し本発明のシェードノカルディア属実態
変異咋ではこれらが全く副生ぜず、主生成物としてはム
ＤＤに４ＡＤが僅かに混じったものまたは４ＡＤのみで
ある。

従って、本発明のシュートソカルディア属実態変異株は
従来のいずれの突然変異株よりも分離・精製工程におい
て極めて有利な条件を有するものである。

また、同じくシュートソカルディア属に属する微生物で
あるシェードノｔルディア・メタノリグニカバラエティ
ＬＭ３ニ ー１４５およびシュートソカルディア・メタノリグニカ
バラエティＬＭ−１２５８は、キレート剤なとの阻害剤
を添加することによりステロール類よりアントロスタン
系化合物を蓄積することが本出願人の前記先願明細書に
述ぺられているが、いずれもムＤＤ、４ムＤの他に、デ
ヒドロテストステロン、テストステロンをかなりの量−
生しており、しかもムＤＤ、４ムＤ、生産量が本発明の
突然変異株に比較して低い。

また、従来知られている微生物のうち、４ムＤを比較的
主たる生成物として蓄積することのできるミコバクテリ
ウム・バラフォーライタム・コンプレックス（Ｍｙｅｅ
ｌｓａ＠ｔ＠ｒｉｕｍｐａｒａｆｏｒｔｕ口ｕｒｎ　ｅ
ｅｍｐｌ・ｘ）ＭＣＩ−０８０７菌においてもＡＤＤの
副生が認められ、４ムＤの１．２位間脱水素酵素が完全
には欠損していないと考えられる。

これに対し、本発明の微生物のうちシェードノカルデイ
方メタノリグニカＤＩ０９４１２７株は、４ムＤの１．
２位間脱水素酵素が完全に欠損し【いるため、ステロー
ル系化合物から４ＡＤのみを選択的かつ大量に生産蓄積
する能力を持ち、優れた特異性を有する。従って、この
突然変異株は、多くの男性ホルモン、蛋日岡化ホルモン
、降圧利尿剤たるスピロノラクトンあるいは抗炎症剤の
製造のためにより好適な４ムＤを選択的に製造する目的
にかなうものとして極めて有用な微生物である。このよ
うに１本発明のシェードノカルディア属実態変異株は多
くの点で他のアントロスタン系化合物生産微生物よりは
るかに有利な性質を有しているものである。

次に本発明の突然変異株に関し、応用例をあげてさらに
具体的に説明するが１本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

肖、以下の応用例においてステロール系化合物およびア
ントロスタン系化合物の定性と定量は、薄層クロマトグ
ラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマト
グラフィー、赤外吸収スペタトル、核磁気共鳴および質
量分析により確認された。

応用例１ グルコース２０，９．リン酸１ナトリクム３ＩＩ％リン
酸２カリウム７１ｉ、ペプトン５Ｎ、コーンスチープリ
カーＢ。

水１ノよりなる種培地（ｐＨ７，０）１００−を５０〇
−容肩付きフラスコに分注し、１２１℃１５分間殺菌後
、シュートラカルディ１メタノリダニカＤＩ０９４１２
５株（歓工研菌寄第６２５０号）を１白金罵接種した。

４０℃で約４８時間通気下に振盪し、種培養を行なった
。この種培養む５０〇−容肩付きフラスコに接種する０
本培養は４０℃で１１５往復／分、振幅７信の往復振盪
条件で行い、培養開始後４８時間目にメタノール５１１
７Ｋｌｌ濁したコレステロール５００卯を添加した。コ
レステロール添加後、１２０時間時間項養を停止し、培
養康を全て併せ、酢酸エチル１００ｄで２回抽出した。

この抽出液をあわせて菌体などの不溶物を濾過後、ステ
ロイド含量をガスクロマトグラフィーおよび高速液体ク
ロマトグラフィーにより分析した結果、ムＤＤ１２５ｍ
ｙおよび４ムＤ１５ｍｙが生成していた。他のアントロ
スタン系化合物は生成しておらず、コレステロール分解
中間体であるコレスト−４−工ン−６−オン、コレスタ
−１，４−ジエン−３−オンｔ）’ソｔＬソｔＬ９５■
、２５ダ生成していた。

応用例２ 応用例１において原料コレステロールの代りにβ−シト
ステロールとカンペステロールの２　：　１ｉ合物、ス
チグマステロール、エルゴステロール、コレス）−４−
エン−３−オン、コレス）−１，４−ジエン−５−オン
ヲ用いた事以外は全て同様にして応用例１を繰返す。蓄
積された生成物の量を表１に示す。

表１ 応用例Ｓ 応用例１において、シェードノカルデイ７メタノ号ダニ
カＤＩ０９４１２７株（徽工研曹寄第６２５１号）を用
い。

コレステロール添加後の培養時間を１４４時間とした以
外は全て同様にして応用例１を繰返す。

その結果、４ムＤ１５４１！Ｐが生成し、他のアントロ
スタン系化合物は全く生成していない。コレステロール
の分解中間体は、コレスト−４−エン−３−オンのみが
２４智生成した。

応用例４ 応用例３において原料コレステロールの代りに、β−シ
Ｉノ／ トスチロールとカンペステロールの２：１混合物、スチ
グマステロール、エルゴステロール、コレス）−４−エ
ン−３−オンを用いた事以外は全て同様にして応用例５
を繰返した。その結果、蓄積された４ＡＤの量を表２に
示す。

表　２ 応用例５ グルコース１０ｐ、ペプトン５１１コーンスチープリカ
−５１，水１ｊより成る種培地（ｐＨ１）１００ｉ１を
５００−容肩付フラスコに分注し、１２１℃、１５分間
殺菌後、シェードノカルディア・メタノリグニカＤＩ０
９４１２５株（黴工研薗寄第６２５０号）を１白金耳績
種した。３７℃で約４８時間通気下に振盪し、種培養を
行なった。この種培養２−を種培地と同一の組成からな
る本培養培地１００ｄを含む、５００ｄ容肩付きフラス
コＫ１１種する。本培養は３７℃で１１５往復／分、振
幅７１の往復振盪条件で行ない、培養開始後２４時間目
にメタノール５１１ｊＫ懸濁したハイドロコーチシン５
ｏｎｎＩＦを添加した。ハイドロコーチシン添加後、４
８時間目に培養を停止し、培養液を全て併せ酢酸エチル
１００１１１で２ａ抽出した。この抽出液をあわせて菌
体などの不溶物を濾過後、ステ四イド含量をガスクロス
トグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにより
分析した結果、プレドニソロン４２２ダが生成していた
。

特許出願人 大日本インキ化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　ステロール系化合物をアントロスタン系化合物へ変
   換する能力を有し、変換されたアントロスタン系化舎−
   に対する酸化阻害剤の無存在下に該化合物を培地中に蓄
   積する能力を有することを特徴とするシェードノカルデ
   ィア属に属する微生物のＩ！然変異株。 ２　シェードノカルデイ１メタノリダニカに属するもの
   である特許請求の範８＃１１項記載の突然変異株。 五　アントロスタン系化合物がアンドロスタ−１，４−
   ジエン−５，１７−ジオンである特許請求の範−第１ま
   たは２項記載の突然変異株。 ４　アントロスタン系化合物がアンドロスト−４−エン
   −３゜１７−ジオンである特許請求の範囲第１または２
   項記載の突然変異株。 翫　シェードノカルディア・メタノリグニカＤＩＣ９４
   １２５である特許請求の範囲第１，２または３項記載の
   突然変異株。 ４　シェードノカルディア・メタノリグニカＤＩＣ９４
   １２７である特許請求の範囲第１．２または４項記載の
   突然変異株。