JP2719377B2 - ９α―ヒドロキシ―１７―ケトステロイドの微生物学的製法 - Google Patents
９α―ヒドロキシ―１７―ケトステロイドの微生物学的製法Info
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- JP2719377B2 JP2719377B2 JP63325731A JP32573188A JP2719377B2 JP 2719377 B2 JP2719377 B2 JP 2719377B2 JP 63325731 A JP63325731 A JP 63325731A JP 32573188 A JP32573188 A JP 32573188A JP 2719377 B2 JP2719377 B2 JP 2719377B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0003—Androstane derivatives
- C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、マイコバクテリウム属の新しい微生物を用
いた、９α−ヒドロキシ−17−ケトステロイド類の製造
法に関するものである。
いた、９α−ヒドロキシ−17−ケトステロイド類の製造
法に関するものである。
ステロイド分子は微生物によって変換されることが良
く知られている（W.シャーニー（Charney）、H.L.ハー
ゾク（Herzog）、ステロイド類の微生物による変換）。
繁雑で高価な化学過程と置換するために、微生物による
ステロイド類の変換を用いた多くの方法が開発されてき
た。有用なステロイド中間体の安価な製造源としては、
豊富に入手できるステロール類、例えばコレステロール
及びシトステロールがある。微生物としては、これらの
ステロイド類を炭素源として利用できるものが選ばれて
きた。例えばオランダ特許公報NL6513718およびNL67054
50など、いくつかの特許出願においては、ステロイド核
を保存した、Ｃ−17側鎖の微生物による分散が報告され
ている。米国特許第3684657号、第3759791号又は第4345
029号で報告されているように、特異的インヒビター化
合物およびその後に、特別に開発した変異株を用いて、
治療に有用なステロイド類の合成の原料となる、アンド
ロスト−４−エン−3,17−ジオンおよびアンドロスタ−
1,4−ジエン−3,17−ジオンを高収率で製造することが
可能である。
く知られている（W.シャーニー（Charney）、H.L.ハー
ゾク（Herzog）、ステロイド類の微生物による変換）。
繁雑で高価な化学過程と置換するために、微生物による
ステロイド類の変換を用いた多くの方法が開発されてき
た。有用なステロイド中間体の安価な製造源としては、
豊富に入手できるステロール類、例えばコレステロール
及びシトステロールがある。微生物としては、これらの
ステロイド類を炭素源として利用できるものが選ばれて
きた。例えばオランダ特許公報NL6513718およびNL67054
50など、いくつかの特許出願においては、ステロイド核
を保存した、Ｃ−17側鎖の微生物による分散が報告され
ている。米国特許第3684657号、第3759791号又は第4345
029号で報告されているように、特異的インヒビター化
合物およびその後に、特別に開発した変異株を用いて、
治療に有用なステロイド類の合成の原料となる、アンド
ロスト−４−エン−3,17−ジオンおよびアンドロスタ−
1,4−ジエン−3,17−ジオンを高収率で製造することが
可能である。
微生物学的に合成したステロイド類の中で、９−α−
ヒドロキシ−17−ケトステロイド類は、コルチコステロ
イド類の合成のための価値ある原料化合物であることか
ら重要である（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミ
ストリー（J.Org.Chem.）（1979年）44巻、1582頁）。
コルチコステロイド類に必要な、Ｃ−11への水酸基、及
び場合によっては、Ｃ−９へのハロゲン原子の導入は、
このタイプの化合物とは異なり、容易で、よく知られた
方法で行なわれる。
ヒドロキシ−17−ケトステロイド類は、コルチコステロ
イド類の合成のための価値ある原料化合物であることか
ら重要である（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミ
ストリー（J.Org.Chem.）（1979年）44巻、1582頁）。
コルチコステロイド類に必要な、Ｃ−11への水酸基、及
び場合によっては、Ｃ−９へのハロゲン原子の導入は、
このタイプの化合物とは異なり、容易で、よく知られた
方法で行なわれる。
上記タイプの好ましい化合物には、始めてジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J.Ame
r.Chem.Soc.）80巻（1958年）6148頁に報告された９α
−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17−ジオンが
ある。それは、抗アンドロゲン、及び抗エストロゲン活
性を有するが、これは主に医療的に価値のあるコルチコ
ステロイド類の合成中間体として用いられる（例えばヨ
ーロッパ特許出願EP−Ａ−0263569参照）。
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J.Ame
r.Chem.Soc.）80巻（1958年）6148頁に報告された９α
−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17−ジオンが
ある。それは、抗アンドロゲン、及び抗エストロゲン活
性を有するが、これは主に医療的に価値のあるコルチコ
ステロイド類の合成中間体として用いられる（例えばヨ
ーロッパ特許出願EP−Ａ−0263569参照）。
次に示す特許公報では、９α−ヒドロキシ−17−ケト
ステロイド類、特に、９α−ヒドロキシアンドロスト−
４−エン−3,17−ジオンを得るいくつかの方法が公開さ
れている。
ステロイド類、特に、９α−ヒドロキシアンドロスト−
４−エン−3,17−ジオンを得るいくつかの方法が公開さ
れている。
a.例えばノカルディア（Nocardia）属（米国特許439794
7）又は、コリネスポラ・カシコラ（Corynespora cassi
cola）株（ヨーロッパ特許出願EP−Ａ−0027829）を用
いて、アンドロスト−４−エン−3,17−ジオンから出発
する、９−α−ヒドロキシ基の微生物学的導入。
7）又は、コリネスポラ・カシコラ（Corynespora cassi
cola）株（ヨーロッパ特許出願EP−Ａ−0027829）を用
いて、アンドロスト−４−エン−3,17−ジオンから出発
する、９−α−ヒドロキシ基の微生物学的導入。
b.米国特許3759791（例６及び７）は、マイコバクテリ
ウム（Mycobacterium）株でのステロイド類の発酵後の
培地中に、９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−
3,17−ジオンが存在することを報告している。米国特許
4035236によれば、収率はかなり低いが、マイコバクテ
リウム・ホルツイタム（Mycobacterium fortuitum）NRR
L B−8119は、ステロール類のＣ−17側鎖及び同時に９
α−ヒドロキシ基の導入を行うことができる。インキュ
ベーション中、目的産物がさらに徐々に分解することを
主因とする低収率は別にして、この方法の欠点は、この
微生物が便宜的病原（opportunistic pathogen）である
ということである。
ウム（Mycobacterium）株でのステロイド類の発酵後の
培地中に、９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−
3,17−ジオンが存在することを報告している。米国特許
4035236によれば、収率はかなり低いが、マイコバクテ
リウム・ホルツイタム（Mycobacterium fortuitum）NRR
L B−8119は、ステロール類のＣ−17側鎖及び同時に９
α−ヒドロキシ基の導入を行うことができる。インキュ
ベーション中、目的産物がさらに徐々に分解することを
主因とする低収率は別にして、この方法の欠点は、この
微生物が便宜的病原（opportunistic pathogen）である
ということである。
c.東ドイツ特許232167は、マイコバクテリウム・ホルツ
イタム（Mycobacterium fortuitum）1510株（ZIMET1084
9）による９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−
3,17−ジオンの製造を公開している。特別な性質によ
り、よく分散させた疎水性有機ポリマーを発酵培地に加
えることにより、収率が40〜50％上昇した。
イタム（Mycobacterium fortuitum）1510株（ZIMET1084
9）による９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−
3,17−ジオンの製造を公開している。特別な性質によ
り、よく分散させた疎水性有機ポリマーを発酵培地に加
えることにより、収率が40〜50％上昇した。
d.マイコバクテリウム（Mycobacterium）株を用いるこ
とによる、ステロール類とは異なる９α−ヒドロキシア
ンドロスト−４−エン−3,17−ジオンの製法も、日本特
許出願JP55/85397に報告されているが、収率は低い。
とによる、ステロール類とは異なる９α−ヒドロキシア
ンドロスト−４−エン−3,17−ジオンの製法も、日本特
許出願JP55/85397に報告されているが、収率は低い。
e.1988年６月２日に公開させた英国特許出願GB-2197869
によると、９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−
3,17−ジオンの生産が、新しいマイコバクテリウム・ロ
セウム（Mycobacterium roseum）種の株を用いたステロ
ール発酵により効果的に行うことができる。100gのステ
ロールから28.5gの産物が得られた。
によると、９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−
3,17−ジオンの生産が、新しいマイコバクテリウム・ロ
セウム（Mycobacterium roseum）種の株を用いたステロ
ール発酵により効果的に行うことができる。100gのステ
ロールから28.5gの産物が得られた。
本発明は、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属
の新しい微生物を用い、５〜10個の炭素原子を含むＣ−
17炭素側鎖を特徴とするステロイド類を９α−ヒドロキ
シ−17−ケトステロイド類へ、特に種々のステロール類
から、９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17
−ジオンへ変換する発酵法を提供する。この発酵法によ
れば希望のステロイド類を選択的かつ高収率で生産でき
る。
の新しい微生物を用い、５〜10個の炭素原子を含むＣ−
17炭素側鎖を特徴とするステロイド類を９α−ヒドロキ
シ−17−ケトステロイド類へ、特に種々のステロール類
から、９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17
−ジオンへ変換する発酵法を提供する。この発酵法によ
れば希望のステロイド類を選択的かつ高収率で生産でき
る。
（微生物） 米国特許3759791で報告されているように、マイコバ
クテリウム・スピーシーズ（Mycobacterium species）N
RRL−Ｂ−3805の培養物から新しいマイコバクテリウム
株が得られた。マイコバクテリウム・スピーシーズNRRL
−Ｂ−3805は、米国特許4345029第２欄、34〜40行から
明らかなように、マイコバクテリウム・バカエ（Mycoba
cterium vaccae）の一般的特徴を示す。マイコバクテリ
ウム・スピーシーズNRRL−Ｂ−3805は、高収率でステロ
ール類をアンドロスト−４−エン−3,17−ジオンに変換
する。
クテリウム・スピーシーズ（Mycobacterium species）N
RRL−Ｂ−3805の培養物から新しいマイコバクテリウム
株が得られた。マイコバクテリウム・スピーシーズNRRL
−Ｂ−3805は、米国特許4345029第２欄、34〜40行から
明らかなように、マイコバクテリウム・バカエ（Mycoba
cterium vaccae）の一般的特徴を示す。マイコバクテリ
ウム・スピーシーズNRRL−Ｂ−3805は、高収率でステロ
ール類をアンドロスト−４−エン−3,17−ジオンに変換
する。
NRRL−Ｂ−3805を、β−シトステロール及びアンドロ
スタ−1,4−ジエン−3,17−ジオンの混合物を含む培地
中で多世代増殖させることにより選択操作にかけた。こ
の操作により最終的にマイコバクテリウム・スピーシー
ズと命名した新しい株を調製し、1986年11月24日、セン
トラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに（Cent
raal Bureau voor Schimmelcultures,P.O.Box 273,3740
AG Baarn,The Netherlands）第CBS482.86号で寄託し
た。親株マイコバクテリウム・スピーシーズNRRL−Ｂ−
3805から新しい種を区別する最も顕著な特性は、ステロ
イド類を安定に９α−ヒドロキシステロイド類に変換す
る能力である。
スタ−1,4−ジエン−3,17−ジオンの混合物を含む培地
中で多世代増殖させることにより選択操作にかけた。こ
の操作により最終的にマイコバクテリウム・スピーシー
ズと命名した新しい株を調製し、1986年11月24日、セン
トラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに（Cent
raal Bureau voor Schimmelcultures,P.O.Box 273,3740
AG Baarn,The Netherlands）第CBS482.86号で寄託し
た。親株マイコバクテリウム・スピーシーズNRRL−Ｂ−
3805から新しい種を区別する最も顕著な特性は、ステロ
イド類を安定に９α−ヒドロキシステロイド類に変換す
る能力である。
新しいマイコバクテリウム・スピーシーズCBS482.86
は、コロニーの色や形で、上述のマイコバクテリウム・
ホルツイタムNRRLB-8119と明確に区別される。それら
は、通常のAPI-20Bテスト検定法を用いたとき、生化学
的性質に関し、わずか約75％の類似性しか有していない
ようだ。さらに第１表を参照せよ。さらに、上記マイコ
バクテリウム・ホルツイタムとは対照的に、新しいマイ
コバクテリウム株は、ステロール分子の80％にも昇る、
驚くべき高い変換率を示す。さらに、通常の発酵条件
下、それは主産物である９α−ヒドロキシアンドロスト
−４−エン−3,17−ジオンをさらに分解せず、従って、
その発酵液中に蓄積していき、それを従来法により高収
率で容易に単離することができる。
は、コロニーの色や形で、上述のマイコバクテリウム・
ホルツイタムNRRLB-8119と明確に区別される。それら
は、通常のAPI-20Bテスト検定法を用いたとき、生化学
的性質に関し、わずか約75％の類似性しか有していない
ようだ。さらに第１表を参照せよ。さらに、上記マイコ
バクテリウム・ホルツイタムとは対照的に、新しいマイ
コバクテリウム株は、ステロール分子の80％にも昇る、
驚くべき高い変換率を示す。さらに、通常の発酵条件
下、それは主産物である９α−ヒドロキシアンドロスト
−４−エン−3,17−ジオンをさらに分解せず、従って、
その発酵液中に蓄積していき、それを従来法により高収
率で容易に単離することができる。
（基質） ９α−ヒドロキシ−17−ケトステロイド類の製造のた
め、この新しいマイコバクテリウム・スピーシーズ（My
cobacterium species）は種々の基質、特に、コレステ
ロール、α1−又はβ−シトステロール、スチグマステ
ロール、カンペステロール、エルゴステロール、コール
類、リトコール酸、11,12−デヒドロ−リトコール酸、
及びコレスト−４−エン−３−オンのような、５〜10個
の炭素原子を有するＣ−17側鎖をもつステロイド類を利
用することができる。得られた発酵液中、例えば３−ケ
ト−デルタ−４ステロイド類又は３−ケト−デルタ−1,
4ステロイド類のようなそのいくつかはＣ−17上にヒド
ロキシイソプロピル基を有する、９α−ヒドロキシ基を
欠いた少量の副産物が見い出されることがある。基質の
種類に依存して、そのような副産物には、例えば、アン
ドロスト−４−エン−3,17−ジオン、アンドロスタ−1,
4−ジエン−3,17−ジオン、９α−ヒドロキシ−20−ハ
イドロキシメチルプレグン−４−エン−３−オンなどが
ある。また、上述のＣ−17−置換ステロイド類の混合
物、例えば、58％β−シトステロール、５％カンペステ
ロール及び25％スチグマステロールと12％のその他の化
合物を含む、大豆由来の既知混合物なども基質に適して
いる。９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17
−ジオン製造のための好ましい基質は、ステロール、特
にβ−シトステロールであるが、リトコール酸も適して
いる。その他の種々のＣ−17−置換ステロイド基質も、
新しいマイコバクテリウム株を用いて、相当する９α−
ヒドロキシ−17−ケトステロイド類に変換される。
め、この新しいマイコバクテリウム・スピーシーズ（My
cobacterium species）は種々の基質、特に、コレステ
ロール、α1−又はβ−シトステロール、スチグマステ
ロール、カンペステロール、エルゴステロール、コール
類、リトコール酸、11,12−デヒドロ−リトコール酸、
及びコレスト−４−エン−３−オンのような、５〜10個
の炭素原子を有するＣ−17側鎖をもつステロイド類を利
用することができる。得られた発酵液中、例えば３−ケ
ト−デルタ−４ステロイド類又は３−ケト−デルタ−1,
4ステロイド類のようなそのいくつかはＣ−17上にヒド
ロキシイソプロピル基を有する、９α−ヒドロキシ基を
欠いた少量の副産物が見い出されることがある。基質の
種類に依存して、そのような副産物には、例えば、アン
ドロスト−４−エン−3,17−ジオン、アンドロスタ−1,
4−ジエン−3,17−ジオン、９α−ヒドロキシ−20−ハ
イドロキシメチルプレグン−４−エン−３−オンなどが
ある。また、上述のＣ−17−置換ステロイド類の混合
物、例えば、58％β−シトステロール、５％カンペステ
ロール及び25％スチグマステロールと12％のその他の化
合物を含む、大豆由来の既知混合物なども基質に適して
いる。９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17
−ジオン製造のための好ましい基質は、ステロール、特
にβ−シトステロールであるが、リトコール酸も適して
いる。その他の種々のＣ−17−置換ステロイド基質も、
新しいマイコバクテリウム株を用いて、相当する９α−
ヒドロキシ−17−ケトステロイド類に変換される。
（方法） 発酵は当分野でよく知られている方法で行なう。その
媒体は、インキュベーション中、培養物中に選択したス
テロイドを添加するか、または、接種前、栄養培地中に
それを添加しておくことにより、マイコバクテリウム・
スピーシーズCBS482.86を培養して作る。ステロイド基
質は単独で添加することもあるし、また、他のステロイ
ドと組合せて用いることもできる。基質は、懸濁物とし
てか、又は、例えばジメチルホルムアミドのような、適
用な有機溶媒中に溶かして混合物に加えることができ
る。培養培地中のステロイド濃度は0.1〜100g/l、好ま
しくは、0.5/50g/lであることが望ましい。培養物は、
同化可能な炭水化物のような炭素源及び同化可能な窒素
化合物又はタンパク質性物質のような窒素源を含む栄養
培地中で増殖される。好ましい炭素源には、グルコー
ス、赤砂糖、ショ糖、グリセリン、デンプン、特にコー
ンスターチ、ラクトース、デキストリン及び糖みつが含
まれている。好ましい窒素源には、コーンスチープ液、
イースト、固型ミルクを含む自己分解した醸造イース
ト、大豆粉、綿実粉、コーン粉、固型ミルク、カゼイン
のパンクレア消化物、魚粉、酒蒸留固型分、動物ペプト
ンリカー、肉及び骨破片及びアンモニア塩酸が含まれ
る。これら炭素源及び窒素源を組合せて使用した方が良
い。培地の滅菌前に培地成分として水道水及び未精製原
料を用いるなら、例えば亜鉛、マグネシウム、マンガ
ン、コバルト及び鉄のような微量金属を発酵培地に加え
る必要はない。
媒体は、インキュベーション中、培養物中に選択したス
テロイドを添加するか、または、接種前、栄養培地中に
それを添加しておくことにより、マイコバクテリウム・
スピーシーズCBS482.86を培養して作る。ステロイド基
質は単独で添加することもあるし、また、他のステロイ
ドと組合せて用いることもできる。基質は、懸濁物とし
てか、又は、例えばジメチルホルムアミドのような、適
用な有機溶媒中に溶かして混合物に加えることができ
る。培養培地中のステロイド濃度は0.1〜100g/l、好ま
しくは、0.5/50g/lであることが望ましい。培養物は、
同化可能な炭水化物のような炭素源及び同化可能な窒素
化合物又はタンパク質性物質のような窒素源を含む栄養
培地中で増殖される。好ましい炭素源には、グルコー
ス、赤砂糖、ショ糖、グリセリン、デンプン、特にコー
ンスターチ、ラクトース、デキストリン及び糖みつが含
まれている。好ましい窒素源には、コーンスチープ液、
イースト、固型ミルクを含む自己分解した醸造イース
ト、大豆粉、綿実粉、コーン粉、固型ミルク、カゼイン
のパンクレア消化物、魚粉、酒蒸留固型分、動物ペプト
ンリカー、肉及び骨破片及びアンモニア塩酸が含まれ
る。これら炭素源及び窒素源を組合せて使用した方が良
い。培地の滅菌前に培地成分として水道水及び未精製原
料を用いるなら、例えば亜鉛、マグネシウム、マンガ
ン、コバルト及び鉄のような微量金属を発酵培地に加え
る必要はない。
基質の所望の生成物への変換法は通常48時間から12日
間で終了する。この方法におけるインキュベーション温
度は、20℃から35℃の温度範囲、好ましくは30℃が用い
られる。培養容器の内容物を好ましくは滅菌空気で通気
し、撹拌することにより微生物を増殖させ、そうするこ
とにより、変換プロセスの効率を高揚した。
間で終了する。この方法におけるインキュベーション温
度は、20℃から35℃の温度範囲、好ましくは30℃が用い
られる。培養容器の内容物を好ましくは滅菌空気で通気
し、撹拌することにより微生物を増殖させ、そうするこ
とにより、変換プロセスの効率を高揚した。
変換プロセスの完了がシリカゲルプレートによる薄層
クロマトグラフィーにより示されたら（E.メルク（Mer
k）、タルムスタット（Darmstadt））、変換した目的産
物を当分野でよく知られている手法で回収する。例え
ば、発酵液及び細胞を含む発酵（変換）反応混合物か
ら、非水溶性有機溶媒を用いて、ステロイドを抽出する
ことができる。溶媒には、メチレンクロライド（好まし
い）、クロロホルム、四塩化炭素、エチレングロライ
ド、トリクロロエチレン、ジエチルエーテル、酢酸ペン
チル、ベンゼン及びイソブチルメチルケトンが適してい
る。
クロマトグラフィーにより示されたら（E.メルク（Mer
k）、タルムスタット（Darmstadt））、変換した目的産
物を当分野でよく知られている手法で回収する。例え
ば、発酵液及び細胞を含む発酵（変換）反応混合物か
ら、非水溶性有機溶媒を用いて、ステロイドを抽出する
ことができる。溶媒には、メチレンクロライド（好まし
い）、クロロホルム、四塩化炭素、エチレングロライ
ド、トリクロロエチレン、ジエチルエーテル、酢酸ペン
チル、ベンゼン及びイソブチルメチルケトンが適してい
る。
それとは別に、発酵液と細胞を、例えば濾過や遠心な
どの従来法で分離し、それからそれを別々に適当な溶媒
で抽出することができる。細胞は水溶性又は非水溶性溶
媒で抽出することができる。細胞を含まない発酵液は、
次いで当分野でよく知られている方法で抽出することが
できる。
どの従来法で分離し、それからそれを別々に適当な溶媒
で抽出することができる。細胞は水溶性又は非水溶性溶
媒で抽出することができる。細胞を含まない発酵液は、
次いで当分野でよく知られている方法で抽出することが
できる。
抽出物をケイソウ土で濾過し、その濾液を乾燥するま
で蒸留することができる。変換した目的とするステロイ
ドを含む残査を10％クロロホルムメタノール溶液に溶か
し、つづいて、結晶が出現するまで、スチーム浴上、窒
素を通気して濃縮していくこともできる。その溶液を室
温にまで冷却し、濾過して純粋な沈殿ステロイドを取り
出す。変換された目的ステロイドは、残りの上清から溶
媒を蒸発することによってさらに得ることができる（粗
産物）。
で蒸留することができる。変換した目的とするステロイ
ドを含む残査を10％クロロホルムメタノール溶液に溶か
し、つづいて、結晶が出現するまで、スチーム浴上、窒
素を通気して濃縮していくこともできる。その溶液を室
温にまで冷却し、濾過して純粋な沈殿ステロイドを取り
出す。変換された目的ステロイドは、残りの上清から溶
媒を蒸発することによってさらに得ることができる（粗
産物）。
変換の進行は、薄層プレートで追跡できるが、一方、
定量的データは、高速液体クロマトグラフィーカラムを
用い、メタノールで、培養液の混合物を分離することに
よって得ることができる。
定量的データは、高速液体クロマトグラフィーカラムを
用い、メタノールで、培養液の混合物を分離することに
よって得ることができる。
得られた化合物の構造はNMR分析で確認することもで
きる。
きる。
発酵過程の生きたマイコバクテリウム（Mycobaxteriu
m）細胞を用いる代りに、上述のマイコバクテリウム株
の細胞から誘導される酵素調製物によっても、目的とす
る変換を行うことができる。その調製物の１つとして回
収が容易な固定化された酵素がある。同様の変換を行い
得る新規株マイコバクテリウム・スピーシーズ（Mycoba
cterium species）CBS482.86の変異株又は突然変異株も
同様に本発明に用いることができる。
m）細胞を用いる代りに、上述のマイコバクテリウム株
の細胞から誘導される酵素調製物によっても、目的とす
る変換を行うことができる。その調製物の１つとして回
収が容易な固定化された酵素がある。同様の変換を行い
得る新規株マイコバクテリウム・スピーシーズ（Mycoba
cterium species）CBS482.86の変異株又は突然変異株も
同様に本発明に用いることができる。
本発明はさらに、次に示す例で証明されるが、これは
本発明を制限するものとして理解すべきではない。
本発明を制限するものとして理解すべきではない。
例の中では、次の略号を用いている。
AD ：アンドロスト−４−エン−3,11−ジオン ADD ：アンドロスト−1,4−ジエン−3,17−ジ
オン ９−OH−AD :9α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン
−3,17−ジオン ９−OH−HMP :9α−ヒドロキシ−20−ヒドロキシメチル
プレグン−４−エン−３−オン 実施例１ 三角フラスコ（500ml）中に、100mlの培地Ａを調製す
る。
オン ９−OH−AD :9α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン
−3,17−ジオン ９−OH−HMP :9α−ヒドロキシ−20−ヒドロキシメチル
プレグン−４−エン−３−オン 実施例１ 三角フラスコ（500ml）中に、100mlの培地Ａを調製す
る。
培地Ａ 10g イースト抽出物（ディフコ） 3.4g リン酸２水素カリウム 4.0g トウィーン80TM 1000ml 蒸留水 pH7.0に調整 このフラスコを滅菌（120℃、20分）し、30℃に冷却
後、マイコバクテリウム・スピーシーズCBS482.86の懸
濁液を接種する。接種した培地を、280rpmのロータリー
シェーカー上、30℃で48〜72時間インキュベートする。
つづいて、この培養物10mlをコレステロール（100mg）
を補った100mlの新しい培地Ａに接種する。コレステロ
ールは次のように調製した、懸濁液として、培地Ａに添
加した。
後、マイコバクテリウム・スピーシーズCBS482.86の懸
濁液を接種する。接種した培地を、280rpmのロータリー
シェーカー上、30℃で48〜72時間インキュベートする。
つづいて、この培養物10mlをコレステロール（100mg）
を補った100mlの新しい培地Ａに接種する。コレステロ
ールは次のように調製した、懸濁液として、培地Ａに添
加した。
2.5g コレステロール 40g ガラスビーズ（直径0.5cm） 50g 蒸留水 0.25 トウィーン80TM を入れたセラムボトムを滅菌（120℃、20分）し、室温
で200時間、ロータリーシェーカー（280rpm）上で振盪
する。接種した混合物を280rpmのロータリーシェーカー
上、30℃で144時間インキュベートする。インキュベー
ションにつづいて、その培養物をメタノールと混合し、
濾過する。その濾液をHPLCで分析する。
で200時間、ロータリーシェーカー（280rpm）上で振盪
する。接種した混合物を280rpmのロータリーシェーカー
上、30℃で144時間インキュベートする。インキュベー
ションにつづいて、その培養物をメタノールと混合し、
濾過する。その濾液をHPLCで分析する。
培養培地中には、 25mg ９−OH-AD 6mg AD 1mg ADD及び 1mg ９−OH-HMP が同定された。
実施例２ 実施例１の操作におけるコレステロールを種々のステ
ロイドに置き換えることにより、主産物として９−OH-A
Dを得ることができる。その収量を第II表に示す。
ロイドに置き換えることにより、主産物として９−OH-A
Dを得ることができる。その収量を第II表に示す。
実施例３ 先の例（実施例１及び２）で述べたステロイド基質を
例えば実施例５の混合物のように、種々組合せて、発酵
培地に添加し、実施例１で述べたような操作を行った。
主産物は、９−OH-ADであった。
例えば実施例５の混合物のように、種々組合せて、発酵
培地に添加し、実施例１で述べたような操作を行った。
主産物は、９−OH-ADであった。
実施例４ 実施例１のコレステロール懸濁液の代りに、コレステ
ロール溶液（2.5mlエタノール中、50mg）を用い、実施
例と同様の操作により、主産物として９−OH-ADが得ら
れた。
ロール溶液（2.5mlエタノール中、50mg）を用い、実施
例と同様の操作により、主産物として９−OH-ADが得ら
れた。
5mg ９−OH-AD 2mg AD ＜1mg ADD ＜1mg ９−OH-HMP 実施例５ 実施例１のコレステロール懸濁液の代りに、β−シト
ステロール、カンペステロール及びスチグマステロール
（および10:5:1の比率で、総ステロール含量90％）を含
む、粗シトステロール混合物の溶液（2.5mlアセトン中5
0mg）を用い、実施例１と同様の操作により主産物とし
て９−OH-ADが得られた。収量は： 13mg ９−OH-AD 1mg AD ＜1mg ADD ＜1mg ９−OH-HMP であった。
ステロール、カンペステロール及びスチグマステロール
（および10:5:1の比率で、総ステロール含量90％）を含
む、粗シトステロール混合物の溶液（2.5mlアセトン中5
0mg）を用い、実施例１と同様の操作により主産物とし
て９−OH-ADが得られた。収量は： 13mg ９−OH-AD 1mg AD ＜1mg ADD ＜1mg ９−OH-HMP であった。
実施例６ 実施例１のコレステロール懸濁液の代りに、コール酸
を用い、実施例１と同様の操作により、７α,9α、12α
−トリヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17−ジオ
ンが主産物として得られ、またいくつかの少量の副産物
も生成していることが、薄層クロマトグラフィーで明ら
かとなった。主産物の構造は、NMR分析で確認した。
を用い、実施例１と同様の操作により、７α,9α、12α
−トリヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17−ジオ
ンが主産物として得られ、またいくつかの少量の副産物
も生成していることが、薄層クロマトグラフィーで明ら
かとなった。主産物の構造は、NMR分析で確認した。
実施例７ 実施例１のコレステロールの代りに11,12−デヒドロ
ーリトコール酸を用いると、９−α−ヒドロキシアンド
ロスト−４−,11−ジエン−3,17−ジオンが主産物とし
て得られ、またいくつかの少量の副産物も生成している
ことが、薄層クロマトグラフィーで明らかとなった。主
産物の構造は、NMR分析で確認した。
ーリトコール酸を用いると、９−α−ヒドロキシアンド
ロスト−４−,11−ジエン−3,17−ジオンが主産物とし
て得られ、またいくつかの少量の副産物も生成している
ことが、薄層クロマトグラフィーで明らかとなった。主
産物の構造は、NMR分析で確認した。
実施例８ 実施例１で述べたように培地Ａ（2000ml三角フラスコ
中500ml）に、マイコバテリウム・スピーシーズCBS482.
86の培養液10mlを接種した。この接種した混合物を、20
0rpmのロータリーシェーカー上、30℃で48時間インキュ
ベートした。この培養物を10lファーメンター用の接種
物として用いる。このファーメンター中の培地は、 50g イースト抽出物（ディフコ） 20g トウィーン80TM 2500ml 蒸留水 （pH6.8に調整） この培地を滅菌し（120℃、45分）、約30℃に冷却し
てから、リン酸２水素カリウム（蒸留水500ml中17g）及
び硫酸アンモニウム（蒸留水500ml中15g）の滅菌（120
℃、20分）溶液を添加した。この混合物に、例５で述べ
た粗β−シトステロール混合物の懸濁液2000gを添加し
た。ステロール懸濁液は次のように調製した。
中500ml）に、マイコバテリウム・スピーシーズCBS482.
86の培養液10mlを接種した。この接種した混合物を、20
0rpmのロータリーシェーカー上、30℃で48時間インキュ
ベートした。この培養物を10lファーメンター用の接種
物として用いる。このファーメンター中の培地は、 50g イースト抽出物（ディフコ） 20g トウィーン80TM 2500ml 蒸留水 （pH6.8に調整） この培地を滅菌し（120℃、45分）、約30℃に冷却し
てから、リン酸２水素カリウム（蒸留水500ml中17g）及
び硫酸アンモニウム（蒸留水500ml中15g）の滅菌（120
℃、20分）溶液を添加した。この混合物に、例５で述べ
た粗β−シトステロール混合物の懸濁液2000gを添加し
た。ステロール懸濁液は次のように調製した。
４個のセラムボトル（2000ml）は各々次のものを含ん
でいる 25g 粗β−シトステロール 200g ガラスビース（直径0.5cm） 500ml 蒸留中 4g トウィーン80TM この混合物を45分間、120℃で滅菌し、ついで150rpm
のロータリーシェーカー上、室温で400時間振盪した。
接種した混合物を撹拌反応器（600rpm）中、300℃で培
養し、その間無菌空気を100l/hの流量で培地に通気し、
かつそのpHを、NH4OH（蒸留水中５％、メンブレンフィ
ルターで除菌）を用いて、自動的にpH7.0に保持した。7
2時間後、トウィーン80TM（500gを蒸留水で2500gとした
もの）の供給を、15g/hの速度で開始した。この発酵を2
16時間続け、その後、この発酵培地をメチレンクロライ
ドで抽出した。抽出物をケイソウ土で濾過し、その濾液
を乾燥するまで減圧蒸留した。残査を10％クロロホルム
メタノール溶液にとかし、それから結晶が析出するま
で、スチームバス上で窒素を通気して濃縮した。その溶
液を室温にまで冷却し、沈殿したステロール類を濾過し
て取り除いた。上清から、溶媒をエバポレートすると粗
β−OH-AD結晶が得られた。粗結晶には 37.9g ９−OH-AD 2.9g AD ＜0.1g ADD 0.2g ９−OH-HMP が含まれていた（HPLC検定）。
でいる 25g 粗β−シトステロール 200g ガラスビース（直径0.5cm） 500ml 蒸留中 4g トウィーン80TM この混合物を45分間、120℃で滅菌し、ついで150rpm
のロータリーシェーカー上、室温で400時間振盪した。
接種した混合物を撹拌反応器（600rpm）中、300℃で培
養し、その間無菌空気を100l/hの流量で培地に通気し、
かつそのpHを、NH4OH（蒸留水中５％、メンブレンフィ
ルターで除菌）を用いて、自動的にpH7.0に保持した。7
2時間後、トウィーン80TM（500gを蒸留水で2500gとした
もの）の供給を、15g/hの速度で開始した。この発酵を2
16時間続け、その後、この発酵培地をメチレンクロライ
ドで抽出した。抽出物をケイソウ土で濾過し、その濾液
を乾燥するまで減圧蒸留した。残査を10％クロロホルム
メタノール溶液にとかし、それから結晶が析出するま
で、スチームバス上で窒素を通気して濃縮した。その溶
液を室温にまで冷却し、沈殿したステロール類を濾過し
て取り除いた。上清から、溶媒をエバポレートすると粗
β−OH-AD結晶が得られた。粗結晶には 37.9g ９−OH-AD 2.9g AD ＜0.1g ADD 0.2g ９−OH-HMP が含まれていた（HPLC検定）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:32）
Claims (6)
- 【請求項１】５〜10個の炭素原子を含む、Ｃ−17側鎖を
少なくとも１個有する１個以上のステロイド化合物を、
好気培養条件下、栄養培地中、Ｃ−17側鎖分解微生物又
はその１個以上の酵素と反応させる作用に付し、かつ培
養液から９α−ヒドロキシ−17−ケトステロイドを回収
する工程を含む９α−ヒドロキシ−17−ケトステロイド
類の製造法であって、上記微生物がマイコバクテリウム
種（Mycobacterium species）CBS482.86、又はその突然
変異株あるいは変異株であって、それと同じ変換を行い
うるものであることを特徴とする上記製造法。 - 【請求項２】ステロイド化合物が、α1−又はβ−シト
ステロール、スチグマステロール、コレステロール、コ
レスト−４−エン−３−オン、カンペステロール、エル
ゴステロール、コール酸、リトコール酸、11,12−デヒ
ドロ−リトコール酸又はこれらの混合物から選ばれるこ
とを特徴とする、請求項（１）記載の方法。 - 【請求項３】９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン
−3,17−ジオンを、好ましくはβ−シトステロールから
製造することを特徴とする、請求項（１）もしくは
（２）記載の方法。 - 【請求項４】７α,9α,12α−トリヒドロキシアンドロ
スト−４−エン−3,17−ジオンをコール酸から製造する
ことを特徴とする、請求項（２）記載の方法。 - 【請求項５】９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン
−3,17−ジオンを11,12−デヒドロリトコール酸から製
造することを特徴とする、請求項（２）記載の方法。 - 【請求項６】ステロイド類を安定に９α−ヒドロキシス
テロイド類に変換する能力を有するマイコバクテリウム
・スピーシーズCBS482.86。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP87202619.0 | 1987-12-23 | ||
| EP87202619 | 1987-12-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022395A JPH022395A (ja) | 1990-01-08 |
| JP2719377B2 true JP2719377B2 (ja) | 1998-02-25 |
Family
ID=8197730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63325731A Expired - Lifetime JP2719377B2 (ja) | 1987-12-23 | 1988-12-23 | ９α―ヒドロキシ―１７―ケトステロイドの微生物学的製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5166055A (ja) |
| EP (1) | EP0322081B1 (ja) |
| JP (1) | JP2719377B2 (ja) |
| DE (1) | DE3876769T2 (ja) |
| ES (1) | ES2052693T3 (ja) |
| GR (1) | GR3006578T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5298398A (en) * | 1987-12-23 | 1994-03-29 | Gist-Brocades Nv | Preparation of 9-α-hydroxy-17-keto steroids using Mycobacterium species CBS 482.86 |
| EP0322081B1 (en) * | 1987-12-23 | 1992-12-16 | Roussel-Uclaf | Microbiological preparation of 9-alpha-hydroxy-17-keto steroids |
| DE59108700D1 (de) * | 1990-08-18 | 1997-06-12 | Schering Ag | Verfahren zur herstellung von 17-oxosteroiden |
| US5472854A (en) * | 1990-08-18 | 1995-12-05 | Schering Aktiengesellschaft | Process for the production of 17-oxosteroids via the fermentative oxidation of 17β-hydroxysteroids by Mycobacterium |
| EP0496854B1 (de) * | 1990-08-18 | 2000-03-15 | Schering Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung von 20-METHYL-5,7-PREGNADIEN-3$g(b),21-DIOL-DERIVATIVEN |
| ATE473759T1 (de) | 1998-05-22 | 2010-07-15 | Univ Leland Stanford Junior | Bifunktionelle moleküle sowie darauf basierende therapien. |
| GB0003231D0 (en) * | 2000-02-11 | 2000-04-05 | Medi Cult As | Cell culture media |
| KR100418657B1 (ko) * | 2001-10-16 | 2004-02-11 | 주식회사 엘지생명과학 | 마이코박테리움 에스피를 사용하는9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법 |
| EP2392258B1 (en) | 2005-04-28 | 2014-10-08 | Proteus Digital Health, Inc. | Pharma-informatics system |
| US9062126B2 (en) | 2005-09-16 | 2015-06-23 | Raptor Pharmaceuticals Inc. | Compositions comprising receptor-associated protein (RAP) variants specific for CR-containing proteins and uses thereof |
| AU2010216512B2 (en) | 2009-02-20 | 2016-06-30 | 2-Bbb Medicines B.V. | Glutathione-based drug delivery system |
| WO2010129819A2 (en) | 2009-05-06 | 2010-11-11 | Laboratory Skin Care, Inc. | Dermal delivery compositions comprising active agent-calcium phosphate particle complexes and methods of using the same |
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Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE232167C (ja) * | ||||
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| NL6513718A (ja) * | 1965-10-22 | 1967-04-24 | ||
| US3684657A (en) * | 1970-05-11 | 1972-08-15 | Searle & Co | Selective microbiological degradation of steroidal 17-alkyls |
| US3759791A (en) * | 1970-12-10 | 1973-09-18 | Searle & Co | Selective microbiological preparation of androst-4-ene-3,17-dione |
| US4035236A (en) * | 1975-10-24 | 1977-07-12 | The Upjohn Company | Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione |
| US4293645A (en) * | 1976-03-01 | 1981-10-06 | The Upjohn Company | Process for preparing androsta-1,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione |
| JPS5326391A (en) * | 1976-07-26 | 1978-03-11 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Preparation of l-lysine by fermentation |
| US4345033A (en) * | 1976-10-22 | 1982-08-17 | The Upjohn Company | Mycobacterium fortuitum mutant |
| US4226936A (en) * | 1977-10-21 | 1980-10-07 | The Upjohn Company | Process for preparing 9α-OH BN alcohol |
| AT362086B (de) * | 1978-04-17 | 1981-04-27 | Henkel Kgaa | Verfahren zur herstellung von 17-c-steroid- -alpha-propionsaeureverbindungen durch mikro- biellen seitenkettenabbau an 17-c-seitenketten- -steroidsubstraten |
| US4358538A (en) * | 1978-08-07 | 1982-11-09 | The Upjohn Company | Mycobacterium fortuitum mutant |
| JPS5585397A (en) * | 1978-12-21 | 1980-06-27 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Microbiological preparation of 9alpha-hydroxyandrostenedione |
| ATE3991T1 (de) * | 1979-10-26 | 1983-07-15 | Schering Aktiengesellschaft Berlin Und Bergkamen | Verfahren zur herstellung von 9-alpha-hydroxy-4- androsten-3,17-dion. |
| JPS578794A (en) * | 1980-06-17 | 1982-01-18 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Preparation of androstane-type steroid |
| US4397947A (en) * | 1981-06-12 | 1983-08-09 | G. D. Searle & Co. | Microbial process for 9α-hydroxylation of steroids |
| JPS60114187A (ja) * | 1983-11-25 | 1985-06-20 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規微生物 |
| KR960010793B1 (ko) * | 1986-10-10 | 1996-08-08 | 루쎌 위클라프 소시에떼 아노님 | 9-알파-히드록시 스테로이드 및 그의 제조방법 |
| HU196627B (en) * | 1986-11-18 | 1988-12-28 | Gyogyszerkutato Intezet | Microbiological process for producing y alpha-hydroxy-4-androstene-3,17-dione |
| EP0322081B1 (en) * | 1987-12-23 | 1992-12-16 | Roussel-Uclaf | Microbiological preparation of 9-alpha-hydroxy-17-keto steroids |
-
1988
- 1988-12-23 EP EP88202997A patent/EP0322081B1/en not_active Expired
- 1988-12-23 DE DE8888202997T patent/DE3876769T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-23 JP JP63325731A patent/JP2719377B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-23 ES ES88202997T patent/ES2052693T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-07-15 US US07/729,892 patent/US5166055A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-12-18 GR GR920402330T patent/GR3006578T3/el unknown
Also Published As
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| EP0322081A1 (en) | 1989-06-28 |
| JPH022395A (ja) | 1990-01-08 |
| EP0322081B1 (en) | 1992-12-16 |
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