JPS637795A - ７α−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は７α−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３
，１７−ジオンの製造方法に関し、詳しくは３α、７α
−ジヒドロキン−５β−コラン酸（以下、ＣＤＣＡと称
す）及び／又はその塩に微生物を作用させることＫよっ
て７α−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，１７
−ジオン（以下、　Ｔｅ１−ヒドロキシ４ＡＤと称す）
を製造する方法に関する。

本発明の方法により製造される７α−ヒドロキシ４ＡＤ
は、抗アルドステロン性利尿剤として知られている１７
β−ヒドロキシ−７α−メルカプト−３−オキソ−１７
α−プレグナ−４−エン−２１−カルボン酸−γ−ラク
トン−ｍ７α−アセテート（以下、スピロノラクトンと
称す）の合成中間体である１７β−ヒドロキシ−１７α
−（３−ヒドロキシプロピル）アンドロスタ−４，６−
シエンー３−オンを製造するための原料化合物として有
用である。

〔従来の技術〕

従来、ＣＤＣＡＩＣ微生物を作用させて７α−ヒドロキ
シ４ＡＤが得られた例がいくつか報告されて’／”）　
Ｏ側光ｔ？、テネ７　：ｙ　（Ｍ、　Ｅ、Ｔｅｎｎｅｓ
ｏｎ　）　Ｇ）は、ＣＤＣＡを含む無機塩培地でシュー
ドモナス・エスピーＮＣＩＢ　１０５９０　（Ｐｓｅｕ
ｄｏｒｎｏｎａｓ　　ｓｐ、ＮＣｌＢ１０５９０　）菌
株を好気的に培養して７α−ヒドロキシアンドロスタ−
１，４−ジエン−３，１７−ジオン（以下、７α−ヒド
ロキシＡＤＤと称す）、７α−ヒドロキシプレグナ−１
，４−ジエン−３−オン−２０−カルボン酸、７α−ヒ
ドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルボ
ン酸、アンドロスタ−１，４，６−）ジエン−３，１フ
ージオンなどを得たこと、またその生成物のうちの７α
−ヒドロキシＡＤＤ及びアンドロスタ−１，４，６−）
ジエン−３，１フージオンは代謝中間体として７α−ヒ
ドロキシ４ＡＤを経由して生成されたと予想されること
を報告している〔ジャーナル・オン・ステロイド・バイ
オケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｔｅｒｏｉ
ｄＢｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　）、第１０巻、第３１１
〜３１６頁（１９７９年）参照〕。オーウエン（ＲｏＷ
、Ｏｗｅｎ　）らは、上記のシュードモナス・エスピー
ＮＣＩＢ　１０５９０８株をＣＤＣＡを含む無機塩培地
で嫌気的に培養し、コラ−４，６−レニン−３−オン−
２４−散とアンドロスタ−４，６−ジニンー３．１７−
　シオントヲ主生成物として得、他に７α−ヒドロキシ
４ＡＤなどの種々の副生物を得たことを報告している〔
ジャーナル・オン・リビド・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ　）、第２４巻、
第１１０９〜１１１８頁（１９８３年）参照〕。なお、
テネンンらの方法及びオーウエンらの方法で使用されて
いるシュードモナス・エスピーＮＣＩＢ　１０５９０菌
株については、この菌株が動物糞便から採取されたシュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属する細
菌テあること以外には全く報告されていない〔ジャーナ
ル・オン・ザ・ケミカル・ソサエティー、ケミカル・コ
ミュニケーショ７ズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　）
、１９７４年、第３１１〜３１６頁参照〕。

また特表昭５７−５００２２６号公報には、シュードモ
ナス＊ｘｙ、ビーＡＴＣＣ３１７５２（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｇｐ、　ＡＴＣＣ３１７・５２）菌株を胆汁濃
縮物を含む培地で好気的に培養し、この培養液から７α
−ヒドロキシ４ＡＤなどの数多くのステロイド生成物が
得られたことが記載されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記の従来法はいずれも７α−ヒドロキン４ＡＤを工業
的に有利に製造するに適した方法とは言い難い。

しかして、本発明の目的は、ＣＤＣＡに微生物を作用さ
せることによって７α−ヒドロキシ４人りを高選択率で
かつ収率よ＜裏道する工業的に有利な方法を提供するこ
とにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば、上記の目的は、ＣＤＣＡ及び／又はそ
の塩を基質として７α−ヒドロキシ４ＡＤを生産する能
力を有するシュードモナス属プチダ種又はシュードモナ
ス属スツチェリ種に属する細菌をＣＤＣＡ及び／又はそ
の塩を含む培地に培養して７α−ヒドロキシ４ＡＤを生
成せしめ、これを採取することを特命とする７α−ヒド
ロキシ４ＡＤの製造方法を提供するととＫよって達成さ
れる。

本発明の方法において便用するＣＤＣＡ及び／又はその
塩を基質として７α−ヒドロキシ４ＡＤを生産する能力
を有するシュードモナス属プチダ種に属する細菌として
は、例えばシュードモナス・プチダＤ　４０１４−　Ａ
ｌ　６１５　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ
Ｄ４０１４−Ａ１６１５）菌株（微工研菌寄第６５７２
号）があり、またＣＤＣＡ及び／又はその塩を基質とし
て７α−ヒドロキシ４ＡＤを生産する能力を有するシュ
ードモナス属スツチェリ種に４属する細菌としては、例
えばシュードモナス・スッチェリＭ−１４９２（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｇ　５ｔｕｔｚｅｒｉ　Ｍ　−１４９２
）菌株（微工研菌寄第８７７１号）がある。シュードモ
ナス・プチダＤ４０１４−Ａ１６１５菌株は土壌中よシ
採取したシュードモナス伊プｆＦ　Ｄ　４０１４　（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｇｐｕｔｉｄａ　Ｄ４０１４　）菌
株（微工研条寄第、２ＱＳ号）に突然変異処理を施して
得られた変異株であシ、これらの菌株の菌学的性買は特
開昭５８−１４９６９８号公報又は特開昭５９−３９２
９８号公報に記載されているとおりである。また、シュ
ードモナス・スツチェリＭ−１４・９２菌株は土壌中よ
り採取したシュードモナス・スツチェリＣ−３７−２（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｇｔｕｔｚｅｒｉ　Ｃ−３７−
２）菌株（微工研薗寄第８７７０号）に突然変異処理を
施して得られた変異株であり、これらの菌株の菌学的性
質を次表に示す。

（注１）：生理学的性質において、＋、士及び−は次の
ことを意味する。

＋・・・・・・その性質又はその生成あシ士・・・・・
・その性質又はその生成の有無が判定し難い−・・・・
・・その性質又はその生成なしく注２）、ヒユー・アン
ド・ライフノン培地の炭素源をそれぞれ糖類１〜１５と
代えた培地での菌による糖類からの酸の生成及びガスの
発生を観察したものであるっ＋・・・・・・酸の生成又
はガスの発生あシ士・・・・・・酸の生成又はガスの発
生の有無が判定し難い−・・・・・・酸の生成又はガス
の発生なし上記の表に示した菌学的性質に基づき、シュ
ードモナス・スツチェ＋ｊＣ−３７−２菌ａ及びシュー
ドモナス・スツチェリＭ−１４９２菌株の同定を行ナツ
タ。７ユードモナス命スツチェＩＪＣ−３７−２菌株は
桿菌であること、極単鞭毛を有していること、ダラム染
色が陰性であることなどの顕微鏡的所見、並びにオキシ
ダーゼ反応及びカメラーゼ反応がともに陽性であること
、好気性であること、０−Ｆテストの結果が酸化的（ｏ
ｘｉｄａｔｉｖｅ　）であることなどの生理学的性質か
らパージエイズ・マニュアル・オン・デイターミネイテ
ィブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版に基づき、シュードモナス属
に属する細菌であると同定した。さらにシュードモナス
・スツチェリＣ−３７−２菌株は可溶性色素を生産しな
い点、脱窒反応を行なう点、ゼラチンを分解しない点、
デンプンを分解する点などからシュードモナス属のスツ
チェリ穏に属する細菌であると同定した。また、−般に
突然変異株はその親株と同じ種に属するものと考えられ
ており、シュードモナス・スツチェリＭ−１４９２菌株
はシュードモナス属のスツチェリ種に属する細菌である
と判定した。

本発明の方法による７α−ヒドロキシ４ＡＤの生産は、
ＣＤＣＡ及び／又はその塩を！５質として７α−ヒドロ
キシ４人りを生産する能力を有するシュードモナス属プ
チダ種又はシュードモナス属スツチェリ種に属する細菌
を、ＣＤＣＡ及び／又はその塩を含む培地で培養するこ
とによシ行なわれる。

ＣＤＣＡの塩としては具体的にはＣＤＣＡのナトリウム
、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシウム、マ
グネシウムなどのアルカリ土類金属の塩が挙げられる。

０００人及び／又はその塩の培地中の濃度は通常的１〜
１００．ｐ／Ｊの範囲でよいが、７α−ヒドロキシ４Ａ
Ｄを穏和な条件下で容品Ｋかつ高収量で得る観点からは
約１０〜５０１／Ｊの範囲が好ましい。培養方法は原則
的には一般微生物の好気培養で採用される方法と同じで
あるが、通常は液体培地による振とり培養法又は通気攪
拌培養法が用いられる。培地としては上記のＣＤＣＡ及
び／又はその塩を基質として７α−ヒドロキシ４ＡＤを
生産する能力を有するシュードモナス属プチダ種又はシ
ュードモナス属スツチェリ種に属する細菌が資化利用で
きる栄養源を含有するものであればよい。炭素源として
はＣＤＣＡ及び／又拡その塩を単一炭素源としてもよく
、或いはＣＤＣＡ及び／又はその塩にアラビノースなど
のペン）　−ス類；グルコース、マンノース、７ラクト
ース、ガラクトースなどのヘキソース類；シュークロー
ス、マルトースなどの二糖類；デンプン分解物；糖アル
コール類、グリセリンなどの多価アルコール類；又はポ
リペプトン、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーン
ステイープリカー、酵母エキス、各種アミノ酸、有機酸
などを併用してもよい。

また窒素源としては、例えば硝酸アンモニウム、硝酸ナ
トリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源、又はポリベ
グトン、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源が用いら
れる。また、この他に燐酸水素２カリウム、燐酸２水素
カリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩類が添加され
る。培養条件に特徴はないが、通常２５〜３５℃で１０
時間〜７日間振とり培養又は通気攪拌培養を行なう。

とのよ５Ｋして培養液中に蓄積された７α−ヒドロキシ
４人りは通常その大部分が沈殿物として得られる。蓄積
された７α−ヒドロキシ４ＡＤを分離、採取するには、
７α−ヒドロキシ４ＡＤを溶解しかつ水と相分離する有
機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホルム、クロロホル
ムとメタノールの混合液などを用いて抽出する方法が採
られる。

有機溶媒による抽出は、沈殿物及び菌体を含んだ状態の
培養物について行なってもよいし、培養物から濾過又は
遠心分離によシ分離された不溶成分について行なっても
よい。前者の抽出方法を採る場合には、培養液をこれに
水酸化ナトリウムの水溶液などのアルカリ水溶液を加え
てアルカリ性にしたのち上記の有機溶媒による抽出操作
を行なうのが好ましい。後者の抽出方法を採る場合には
、必要に応じて濾過又は遠心分離などによって分離除去
される培養濾液又は上澄みに１好ましくは水酸化ナトリ
ウムの水溶液などのアルカリ水溶液を加えて該培養濾液
又は上澄みをアルカリ性にしたのち、上記の有機溶媒に
よる抽出操作を施すことによシ、培養液中に溶解してい
る７α−ヒドロキシ４ＡＤを回収することができる０こ
のようｋして得られた抽出液を集め、これよシ溶媒を留
去することにより目的とする７α−ヒドロキシ４ＡＤを
ほぼ全量回収することができる。回収された７α−ヒト
ｃ１：？シ４ＡＤＯ精製は例えばメタノール、メタノー
ル水溶液などから再結晶することによシ行なわれる。

本発明の方法によって製造される７α−ヒドロキシ４Ａ
Ｄは、例えば次の方法によシェフβ−ヒドロキシ−１７
α−（３−ヒトａキシグロピル）アンドロスタ−４，６
−レニン−３−オンを経由しく財）　　　　　　　　　
　（■ 、すなわち、式（１）で示される７α−ヒドロキシ４Ａ
Ｄは、これを７マル酸の存在下にエチレングリコールと
反応させ、得られる式（ＩＩ）で示される３゜３−工ｆ
レンジオキシアンドロスタ−４，６−レニン−１フーオ
ンを１−エトキシエチル＝３−　リｆオプロビル＝エー
テルと反応させ、その生成物を酸性条件下で加水分解す
ることによって式（ＩＩＩ）で示される１７β−ヒドロ
キシ−１７α−（３−ヒドロキシプロピル）アンドロス
タ−４ｓ−ジエン−３−オンを得、かかる１７β−ヒド
ロキシ−１７α−（３−ヒドロキシプロピル）アンドロ
スタ−４，６−レニン−３−オンをジョーンズ（Ｊｏｎ
ｅｓ　）試薬と反応させることによって式（ＩＶ）で示
されるカンレノン（１７β−ヒドロキシ−３−オキノー
１７α−プレグナ−４，６−レニン−２１−カルボン酸
＝γ−ラクトン）とし、次いでカンレノンを例えば特公
昭５４−１７７３３号公報に記載されている方法に従っ
てチオ酢酸と反応させることＫよって式（Ｖ）で示され
る不ピロノラクトンを得ることができる。

〔実施例〕

以下、実施例によシ本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例により限定されるものではない０ 参考例１ 培地１（組成：ペプトン０．５％、肉エキス０．５チ、
食塩０．５チ及び寒天１．５チ；Ｆ４（ニア、８）のス
ラントに生育させたシュードモナス・スツチェリＣ−３
７−２菌株の一白金耳を、予め試験管（内径！　２１１
１１；長さ：２００■）内に準備した培地２（組成：　
ＣＤＣＡ３チ、硝酸アンモニウム０．２％、燐酸２水素
カリウムＯ，１％、燐酸水素２カリウム０．６チ、硫酸
マグネシウム・７水和物０．０２チ、酵母エキス０．０
２％、グルコース０．０５％、ペプトンＯ，ＯＳ＊及び
水酸化ナトリウム０．３％；田ニア、５）のｌＱｄに植
菌し、３０’Ｃで２４時間振とり培養した。この培養液
の０．４ｄを予め試験管（内径＝２１■；長さ：　２０
０　ｍ　’）内に準備した培地３（組成：ＣＤＣＡｏ、
５％、硝酸アンモニウム０．２％、燐酸２水素カリウム
０．１％、燐酸水素２カリウム０．６１１硫酸マグネシ
ウム・７水和物０．０２％、酵母エキス０．０２％及び
グＡ／　：Ｉ−ス０．１チ；ＰＨ：８．５）の１０１１
４に加え、３０℃で６時間振とり培養した。次いで、こ
の対数増殖期にある菌体を孔径０．４５μのメンブレン
フィルターで無菌的に濾過集菌し、Ｑ、１Ｍ燐酸塩緩衝
液（州ニア、０）２０ｍで洗滌後、同じ緩衝液２５１１
１７に懸濁させた。

この菌懸濁液４ｄを試験管（内径７２１　Ｗ　；長さ：
２００Ｍ）に入れ、これに終濃度が５０μｆ／ｄＫなる
ようにＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを添加し、１０分後にその０．１　Ｍｌを培地４〔
組成ニアα−ヒドロキシ４ＡＤ０．１チ、硝酸アンモニ
ウム０．２％、燐酸２水素カリウムキシエチレン（２０
）ソルビタンモノオレエート（ツイーン８０　）　０．
０５％　；ｐＨ：　７．５　）に加え、゛さらにペニシ
リンＧを濃度がＩＱＱＵ／ｗｌになるように加えたのち
、３０℃で１８時間振とり培養した。得られた培養液を
、培地１のプレート上に約１００〜５００個のコロニー
が出現するように、稀釈して該プレートに塗布したのち
、３０℃で一夜培養を行なった。出現したコロニーを培
地１のスラントに単離したのち、各分離株を培地２の１
０ｄ中で２日間振とう培養した。得られたそれぞれの培
養液中の生産物を薄層クロマトグラフィーで検定し、目
的とする７α−ヒドロキシ４ＡＤを選択的に蓄積してい
るｌ菌株を見出し、これをシュードモナス・スツチェリ
Ｍ−１４９２菌株と命名した。

実施例１ シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ１６１５菌株を
次に示す方法で培養した。ＣＤＣＡＩ（１’、硝酸アン
モニウム２．Ｏｆ、燐酸２水素カリウム１．０ｆ１燐酸
水素２カリウム６、Ｏｆ、硫酸マグネシウム・７水和物
０．２ｔ、酵母エキス０．２ｆ１グルコース０．５ｆ、
ペプトン０．５ｆ及び水酸化ナトリウム１．０？の混合
物に水道水を加えて容量をｌｌＫ調整しＣＦｌｌ：８．
５）これを培地とした。この培地を２１容発酵槽に入れ
、１２０℃で１５分間蒸気滅菌を行なった。予め上記の
培地と同じ培地で試験管振とり機にて２０時間増殖させ
た種菌５９ｇ＋／を上記の培地に添加し、攪拌速度３０
０　ｒＰｎｌ　％通気ｉ　ｏ、　ｓ　ｖｖｍ及び３０°
Ｃの条件下で４８時間通気攪拌培養を行なった。培養後
、培養液を充分に混和し、その−部を薄層クロマトグラ
フィーにより分析した結果、ＣＤＣＡは残存していない
ことが確認された。培養液に１規定の水酸化ナトリウム
水溶液を加えることによって田を１０に調整したのち、
培養液をクロロホルム／エタ／−ル混合ｍ媒（容量比＝
４／１）の５１で抽出した。抽出液から菌体変性物など
の不溶物を濾別し、濾液がら溶媒を減圧下に留去するこ
とにょｂ７．０？の乾固物を得た。この乾固物を高速液
体クロートゲラフイーによって分析した結果、乾固物は
純度８６％の７α−ヒドロキシ４ＡＤであることが判明
した。

この７α−ヒドロキシ４ＡＤを８０容量チのメタノール
水溶液を傅用して再結晶することにょシ、４．０２の精
製物を得た。

７α−ヒドロキシ４ＡＤの精製物の分析結果を以下に示
す。

融点：２４５〜２４７°Ｃ マススペクトルｍ／ｅ：３０２〔Ｍ）＋２８４　（Ｍ−
Ｈ２Ｏ）” またｍ／ｅ＝１２４よ）３−ケト−４−エンの存在が確
認された。

ＮＭＲ（ＣＤα３．ｇ□ＭＨｚ）δ： ０．９２（ｓ　、　３Ｈ，１８−ＣＨＪ　）　、　１．
２２（ｓ　、　３Ｈ，１９−ＣＨ５）。

４．０９（ｍ、　ＬＨ，７β−Ｈ）、５゜７９（ｓ、Ｉ
Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ実施例２ 実施例１におけると同様の方法により培養を行ない、培
養液を得た。培養液の一部を薄層クロマトグラフィーに
よシ分析した結果、この培％液中にはＣＤＣＡが残存し
ていないことが確認された。

培養液を遠心分離し、取得された沈殿物及び菌体をクロ
ロホルム／エタノール混合溶媒（容量比：４／ｌ　）　
１０００ａｔと混合し、この混合物を濾過した。

この′ａｌｉを減圧下に濃縮することによ、？　５．　
Ｏｆの乾固物を得た。この乾固物を高速液体クロマトグ
ラフィーによって分析した結果、乾固物は純度９２多の
７α−ヒドロキシ４ＡＤであることが判明した。

実施例３ 実施例１においてシュードモナス・プチダＤ４０１４−
Ａ１６１５菌株に代えてシュードモナス・スツチェリＭ
−１４９２菌株を用い、かつ培地中のＣＤＣＡの使用量
をｌ（ｌから３０２に変更し、また培地中の水酸化ナト
リウムの使用量を１６０１から３．０２に変更した以外
は同様の操作を行なうことによシ、乾固物を２１．９ｆ
得た。なお、得られた培養液の一部を薄層クロマトグラ
フィーによシ分析した結果、培養液中てはＣＤＣＡが残
存していないことが確認された。乾固物を高速液体クロ
マトグラフィーによって分析した結果、該乾固物は純度
８５袋の７α−ヒドロキシ４ＡＤであることが判明した
。この７α−ヒドロキシ４ＡＤをメタノールを使用して
再結晶することによ、６、ｌｏ、ｓｒの精製物を得た。

参考例２ ７α−ヒドロキシ４　Ａ　Ｄ　５．Ｏｆ　、エチレ７　
ｆ　ＩＪコール５ＩｌｌＩ１１フマル酸ｏ、５ｆ及Ｑ：
　ヘア　”　７４００ｄの混合物をディーン・スターク
（Ｄｅａｎ　−Ｓ　Ｌａｒｋ　）の水分離管を備えた反
応器中で攪拌下に加熱還流した。加熱還流開始よ９１日
後にエチレングリコール１５Ｍ１を追加し、その１日後
にエチレングリコール５＃Ｉ／及びフマルｒ１１０．１
Ｆを追加して、さらに１日加熱還流を行なった。な訃、
加熱還流中、生成する水はディーン・スタークの水分離
管を用いて反応系から除去した。得られた反応混合液を
氷冷した飽和重曹水に注ぎ、ベンゼン層を分離し、水層
をベンゼンで抽出した。先に分離したベンゼン層とベン
ゼン抽出液とを合わせ、飽和食塩水で洗滌し、無水炭酸
カリウムで乾燥した。乾燥液を減圧下に濃縮することに
よシ粗結晶を６．２１ｆ得喪。この粗結晶を１６ｄのメ
タノールと数滴のピリジンとの混合溶媒を用いて再結晶
することによＦ）ｓ３．３−ｘチｖンジオキシアンドロ
スタ−４，６−レニン−１フーオンを３．９２得た（収
率ニア２チ）。得られた３、３−エチレンジオキシアン
ドロスタ−４，６−レニン−１フーオンの分析結果を以
下に示す。

融点：１５３〜１５９°Ｃ 比旋光度：〔α］Ｆ＋　１４９゛（ｃ＝１．ｌｏ、Ｃ几
１３）リチウム・ワイヤー１．３８Ｆを細かく切ってフ
ラスコに入れ、アルゴン雰囲気下にｎ−ペンタンで２回
洗滌したのち、無水ジエチルエーテル４０ｄを加えた。

この混合物に攪拌下、室温で３−ブロモプロピルミ１−
エトキシエチル＝エーテル３ｔを加え、溶液の温度が上
昇して３０　’Ｃを越えた時点で氷−食塩浴を用いて冷
却した。溶液の温度を約５℃に維持しながら、３−ブロ
モプロピルミ１−エトキシエチル＝エーテル１６　？　
全無水ジエチルエーテル２０１１４に溶解して得られた
溶液を約４０分を要して滴下し、滴下終了後、０°Ｃで
さらに５０分間攪拌を続けた。得られた混合物に３，３
−エチレンジオキシアンドロスタ−４，６−レニン−１
フーオン１．７２を無水テトラヒドロフラン１０１１１
７に溶解して得られた溶液を０〜５°Ｃで滴下し、その
後０〜５°Ｃで１時間、室温でさらに４時間攪拌を続け
た。得られた反応混合物中の溶液を固体が混入しないよ
うにして氷冷した飽和食塩水に注いだ。これよシ有機層
を分離し、水層をテトラヒトミフラン５０Ｍ１で抽出し
た。先に得られた有機層と抽出液とを合わせ、約３０ｍ
の容量になるまで減圧下に濃縮した。

得られた濃ｒ！Ｉ液に２規定の塩酸２０Ｉ１ｇを加え、
室温下で２時間攪拌を行なった。得られた反応混合液を
飽和重曹水に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。抽出液
を合わせ、飽和重曹水及び飽和食塩水で頴欠洗滌したの
ち、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥液を減圧下
に濃縮して４．１１の濃縮物を得た。このものは下記の
分析結果よ）１７β−ヒドロキシ−１７α−（３−ヒド
ロキシプロピル）アンドロスタ−４，６−レニン−３−
オンを含有していることが判明した。

ＩＲ（フィルム）　’ｍａｘ　： ３３５０（１，水酸基）、１６６５（ｖｓ、共役カルボ
ニル基）。

１６２０（ｍ、二重結合’）ｓ　１５８５（ｗ、’：二
重結合ｆｆｉ−１ＮＭＲ（ＣＤαｓ　、　５　ＱＭＨｚ
　）δ：５．６（ｓ、ＩＨ，４−Ｈ）、６．０４（ｓ、
２Ｈ，６−Ｈンよび７−Ｈ）９９ｍ 上記（ｂ）で得られた１７β−ヒドロキシ−１７α−（
３〜ヒドロキシグロビル）アンドロスタ−４゜６−レニ
ン−３−オンを含む粗生成物４．１２をアセトン５０舅
ｌ及びｔａｒｔ−ブチルアルコール６０ｗｅの混合溶媒
に加熱下に溶解させた。この溶液に水冷下でジョーンズ
（Ｊｏｎｅｓ）試薬ＩＱｔ／を滴下した。

滴下終了後、水冷下に２０分間攪拌をαけたのち、さら
にジョーンズ試薬５ｄを追加し、室温下で２０分間攪拌
した。得られた反応混合物にイソプロピルアルコール１
Ｑｅｕを加えたのち、減圧下に濃縮した。得られた濃縮
物を水で稀釈したのち、酢酸エチルで抽出し、抽出液を
飽和重曹水で洗滌したのち、無水硫酸マグネシウムで乾
燥した。乾燥液を減圧下に濃縮することによ、９．２．
Ｏｒの濃縮物を得た。

得られた濃縮物をアセトン１０ｆｆｉ／に溶解し、ジョ
ーンズ試薬２ｄを加えたのち、室温下で２０分間攪拌し
た。得られた反応混合物にイソプロピルアルコールｌ　
ｗｅを加えたのち減圧下に濃縮し、その濃縮物に上記と
同様な処理操作を施すことによシ、２．０？の油状物質
を得た。

得られた油状物質をカラムクロマトグラフィー〔充填剤
ニジリカゲル（２０ｆ）；溶出液：ｎ−ヘキサン／酢酸
エチル混合溶媒（容址比；２／１〜１／１）〕を用いて
精製することによシ、カンレノンを含有する油状物質０
．９８Ｆを得た。この油状物質をｎ−ヘキサン１．５　
ｊｌ＋７とア七トン１１１７との混合溶媒を用いて再結
晶することによ）、カンレノンを０．５６２得た。カン
レノンの収率は前記（ｂ）で使用した３、３−エチレン
ジオキシア／ドロスター４．６−レニン−１フーオン基
準で３２チであった。

得られたカンレノンの分析結果を以下に示す。

融点：１６３〜１６８℃ 比旋光度：　（αａｆｆ　＋２２’（Ｃ＝：１．Ｑ　５
、ＣＩＴｊＪｓ　）（ｄｌ　　スピロノラクトンの製造 カンレノン０．４０Ｃ１をメタノール°１．１ＩｊｌＣ
溶解し、この溶液にチオ酢酸０．２４鳳ｌを加熱還流下
に加え、さらに３０分間加熱還流を継続した。得られた
反応混合液に６０℃の水１．６ｄを加え、室温まで冷却
したのち、酢酸エチル２０ｄで稀釈した。

得られた溶液を飽和型゛「水及び飽和食塩水で順次洗滌
したのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。

乾燥液を減圧下に濃縮することによｆｉｏ、６０７ｆの
粗結晶を得た。この粗結晶をメタノールを用いて再結晶
することによシスピロノラクトンを０．４０８２得た（
収率：８３％）。得られたスピロノラクトンの分析結果
を以下に示す。

融点＝１３０〜１３５℃ 比旋光度：　（α）Ｆ−３６，６０（（！＝１．１３、
ＣＨα３）〔発明の効果〕 本発明によれば、上記の実施例から明らかなとお〕、７
α−ヒトミキシ４ＡＤを高選択率でがり収率よく製造す
ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸及び／又は
   その塩を基質として７α−ヒドロキシアンドロスタ−４
   −エン−３，１７−ジオンを生産する能力を有するシュ
   ードモナス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥）属プチダ（
   ￥ｐｕｔｉｄａ￥）種又はシュードモナス（￥Ｐｓｅｕ
   ｄｏｍｏｎａｓ￥）属スツチエリ（￥ｓｔｕｔｚｅｒｉ
   ￥）種に属する細菌を、３α，７α−ジヒドロキシ−５
   β−コラン酸及び／又はその塩を含む培地に培養して７
   α−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，１７−ジ
   オンを生成せしめ、これを採取することを特徴とする７
   α−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，１７−ジ
   オンの製造方法。