JPH0215197B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はデオキシコール酸及び／又はその塩か
ら微生物により12β−ヒドロキシアンドロスタ−
４−エン−３，17−ジオンを製造する方法に関
し、詳しくはシユードモナス・プチダD4014−
A1615（Pseudomonas putida D4014−A1615）
菌株（微工研菌寄第6572号）を、デオキシコール
酸及び／又はその塩を含む培地に培養して12β−
ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，17−ジ
オンを生成せしめ、これを採取することを特徴と
する12β−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−
３，17−ジオンの製造方法に関する。 従来、デオキシコール酸に微生物を作用させて
12β−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，
17−ジオン（以下、12β−ヒドロキシ4ADと称
す）を得る方法として次に示す報告が見られる。
まずバルネス（P.J.Barnes）らによつて、シユー
ドモナス・エスピーNCIB 10590（Pseudomonas
sp.NCIB 10590）菌株を用いる方法が報告されて
いる〔Tetrahedron、32巻、89〜93頁（1976年）
参照〕。この方法は、デオキシコール酸を0.1％含
む無機塩培地10でシユードモナス・エスピー
NCIB 10590菌株を14時間好気的に培養しデオキ
シコール酸10ｇから12β−ヒドロキシアンドロス
タ−１，４−ジエン−３，17−ジオン960mg及び
12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３
−オン−20α−カルボン酸657mgを主生産物とし
ており、微量成分の１つとして12β−ヒドロキシ
4ADの存在を確認しているにすぎない。なお、
この方法で使用されているシユードモナス・エス
ピーNCIB 10590菌株については、この菌株が動
物糞便から採取されたシユードモナス属に属する
細菌であること以外には全く報告されていない。
また、オーエン（R.W.Owen）らによる、バクテ
ロイデス・フラギリスXF23（Bacteroides
fragilis XF23）菌株又はバクテロイデス・フラ
ギリス・サブスピーシーズ・セタイオタオミクロ
ンE59（Bacteroides fragilis subsp.
thetaiotaomicron E59）菌株を用いてデオキシ
コール酸から12β−ヒドロキシ4AD、12α−ヒド
ロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−
ジオン、12β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４
−ジエン−３，17−ジオン及び12α−ヒドロキシ
プレグナ−１，４−ジエン−３−オン−20α−カ
ルボン酸を得る方法〔Biochem.Soc.Trans、５
巻．1711〜1713頁（1977年）参照〕が知られてい
るが、これらの方法はいずれも嫌気性菌を用いて
おり、用いる基質が低濃度となること、培養に長
時間を要すること、目的物の収率が低いことなど
工業的に発酵生産するに当り種々の問題点を有す
る。 本発明者らはデオキシコール酸及び／又はその
塩を基質として12β−ヒドロキシ4ADを生産する
微生物の探索を長期間行なつた結果、シユードモ
ナス・プチダに属する特定の細菌がデオキシコー
ル酸及び／又はその塩を基質として12β−ヒドロ
キシ4ADを高選択率、高収率で生産することを
見出し、本発明を完成するに至つた。 本発明者らが得た上記のシユードモナス・プチ
ダに属する細菌としては、シユードモナス・プチ
ダD4014−A1615（Pseudomonas putida D4014
−A1615）菌株（微工研菌寄第6572号）がある。
この菌株は土壌中より採取したシユードモナス・
プチダD4014（Pseudomonas putida D4014）菌
株（微工研条寄第205号）に突然変異処理を施し
て得られた変異株である。 本発明者らが得たシユードモナス・プチダ
D4014菌株及びシユードモナス・プチダD4014−
A1615菌株の菌学的性質を列挙すると次表のとお
りである。

【表】

【表】 上記の表に示した菌学的性質に基づき、シユー
ドモナス・プチダD4014菌株及びシユードモナ
ス・プチダD4014−A1615菌株の同定を行なつ
た。シユードモナス・プチダD4014菌株は、桿菌
であること、極鞭毛を有していること、グラム染
色が陰性であることなどの顕微鏡的所見並びにオ
キシダーゼ反応及びカタラーゼ反応がともに陽性
であること、好気性であること、Ｏ−Ｆテストの
結果が酸化的（Oxidative）であることなどの生
理学的性質からバージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー第
７版及び第８版に基づき、シユードモナス属に属
する細菌であると同定した。さらにシユードモナ
ス・プチダD4014菌株は、培養液が螢光色を帯び
る点、ゼラチンを液化しない点、37℃で生育する
点、アルギニン・ジヒドロラーゼを生成する点な
どからシユードモナス属のプチダ種に属する細菌
であると同定した。また、一般に突然変異株はそ
の親株と同じ種に属するものと考えられており、
シユードモナス・プチダD4014−A1615菌株はシ
ユードモナス属のプチダ種に属する細菌であると
判定した。 本発明の方法による12β−ヒドロキシ4ADの生
産は、シユードモナス・プチダD4014−A1615
（Pseudomonas putida D4014−A1615）菌株
（微工研菌寄第6572号）を、デオキシコール酸及
び／又はその塩を含む培地に培養することにより
行なわれる。デオキシコール酸の塩としては具体
的にはデオキシコール酸のナトリウム、カリウム
などのアルカリ金属の塩が挙げられる。デオキシ
コール酸及び／又はその塩の濃度は通常約１〜
100ｇ／の範囲でよいが、生産される12β−ヒ
ドロキシ4ADの収量、培養条件及び操作性など
の経済的観点から約２〜50ｇ／の範囲が好まし
い。培養方法は原則的には一般微生物の好気培養
で採用される方法と同じであるが、通常は液体培
地による振盪培養法又は通気撹拌培養法が用いら
れる。培地は上記のシユードモナス・プチダ
D4014−A1615（Pseudomonas putida D4014−
A1615）菌株（微工研菌寄第6572号）が資化利用
できる栄養源を含有するものであればよい。炭素
源としてはデオキシコール酸及び／又はその塩を
単一炭素源としてもよいが好ましくはデオキシコ
ール酸及び／又はその塩にグルコース、グリセリ
ン、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキ
スなどを併用するのがよい。また窒素源として
は、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源、又
はポリペプトン、ペプトン、肉エキスなどの有機
窒素源が用いられる。また、この他に燐酸水素２
カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウ
ムなどの無機塩類が添加される。培養条件に特徴
はないが、通常25〜35℃で10時間〜７日間振盪培
養又は通気撹拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された12β−ヒ
ドロキシ4ADを分離、採取するには、培養液を
アルカリ性にしたのち、12β−ヒドロキシ4ADを
溶解しかつ水と相分離する有機溶媒、例えば酢酸
エチル、クロロホルム、クロロホルムとメタノー
ルの混合液などを用いて抽出する方法が採られ
る。この有機溶媒による抽出は、菌体を含んだ状
態の培養液について行なつてもよいし、予め培養
液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分離
などにより分離除去し、得られた培養濾液又は上
清について行なつてもよい。このようにして得ら
れた抽出液を集め、これより溶媒を溜去すること
によつて目的とする12β−ヒドロキシ4ADをほぼ
全量回収することができる。得られた抽出物中に
は12β−ヒドロキシ4ADの他に残存基質のデオキ
シコール及び／又はその塩並びに副生物がほとん
ど含まれておらず、例えば酢酸エチル、ジクロル
メタン／メタノールなどから再結晶することによ
り容易に高純度の12β−ヒドロキシ4ADを取得す
ることができる。 本発明の方法により得られる12β−ヒドロキシ
4ADは、その12位のヒドロキシ基を化学的に除
去することによつて利尿剤として有用なスピロノ
ラクトンなどのステロイドの合成原料となる４−
アンドロステン−３，17−ジオンに誘導すること
ができる。例えば、12β−ヒドロキシ4ADを２−
メチル−２−エチル−１，３−ジオキソランと反
応させることにより３位と17位のケト基が保護さ
れた12β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−
３，17−ジオン−３，17−ビス（エチレンアセタ
ール）を得る〔G.Rosenkranz et al.、J.Am.
CHem.Soc.、76巻．5024〜5026頁（1954年）参
照〕。このアセタールをｐ−トルエンスルホニル
クロリドで処理して12位のヒドロキシル基をトシ
ル化し、ついで水素化トリエチルホウ素リチウム
で還元しその12位のトシルオキシ基を脱離する
か、又はトシル化後、ヨウ化ナトリウムを作用さ
せてトシルオキシ基をヨウ素で置換し、ついで金
属亜鉛で接触還元したのち、鉱酸／アセトンで処
理して３位と17位の保護基を脱離させることによ
り４−アンドロステン−３，17−ジオンとするこ
とができる。 以下実施例及び参考例によつて本発明をさらに
詳細に説明する。 参考例 シユードモナス・プチダD4014−A1615菌株の
取得方法 培地１（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化
ナトリウム0.05％、ペプトン0.5％酵母エキス0.5
％、塩化ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のスラ
ントに生育させたシユードモナス・プチダD4014
菌株の一白金耳を、予め試験管内に準備した培地
２（組成：デオキシコール酸２％、水酸化ナトリ
ウム0.2％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素
カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキス
0.02％）の10mlに植菌し、30℃で14〜15時間振桿
培養した。この培養液の0.3mlを予め試験管に準
備した培地３（組成：デオキシコール酸0.5％、水
酸化ナトリウム0.05％、グルコース0.1％、硝酸
アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1％、
燐酸水素２カリウム0.6％、硝酸マグネシウム・
７水和物0.02％及び酵母エキス0.02％）の10mlに
加え、30℃で８〜９時間培養した。ついで、この
対数増殖期にある菌体を0.45μのメンブレンフイ
ルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩緩衝
液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25mlに
懸濁させた。これに終濃度が50μｇ／mlになるよ
うにＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンを添加し、３〜４分放置することにより
突然変異処理を行なつた。突然変異処理を施した
菌体を0.45μのメンブレンフイルターで濾過集菌
し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）20mlで洗滌
後、同じ緩衝液20mlに懸濁した。得られた菌懸濁
液を滅菌生理食塩水で希釈し、それを培地４（組
成：デオキシコール酸0.5％、水酸化ナトリウム
0.05％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カ
リウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マ
グネシウム・７水和物0.02％、酵母エキス0.02％
及び寒天1.5％）の寒天平板上に500〜1000個のコ
ロニーを出現させるように塗布したのち、30℃で
３〜４日間培養した。出現したコロニー中の極小
コロニーを培地１のスラントに単離したのち、そ
の一白金耳を予め試験管に準備した培地５（組
成：デオキシコール酸0.2％、水酸化ナトリウム
0.02％、グルコース0.1％、硝酸アンモニウム0.2
％、燐酸２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリ
ウム0.6％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％
及び酵母エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で
24時間振盪培養した。得られたそれぞれの培養液
中の生産物を薄層クロマトグラフイーにより検定
し、目的とする12β−ヒドロキシ4ADを選択的に
蓄積している一菌株を見い出し、これをシユード
モナス・プチダD4014−A1615と命名した。 実施例 １ シユードモナス・プチダD4014−A1615菌株
（微工研菌寄第6572号）を次に示す方法で培養し
た。デオキシコール酸0.5ｇ、グルコース0.1ｇ、
硝酸アンモニウム0.2ｇ、燐酸２水素カリウム0.1
ｇ、燐酸水素２カリウム0.6ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02ｇ及び酵母エキス0.02ｇに水道
水50mlを加え、この水溶液のPHを１規定の水酸化
ナトリウム水溶液で8.4に調整したのち、さらに
水道水を加えて容量を100mlとし、これを培地と
した。この培地を500ml容坂口フラスコに入れ、
120℃で15分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記
の培地と同じ培地で試験管振盪機にて24時間増殖
させた種菌の10mlを上記の500ml容坂口フラスコ
に添加し、30℃で２日間振盪培養した。培養後、
この培養液を集め、遠心分離機で菌体及び不溶物
を除去後、得られた培養液上清に１規定の水酸化
ナトリウム水溶液を加えることにより、この培養
液上清のPHを12附近に調整した。ついで、培養液
上清を酢酸エチル300mlで抽出し、抽出液から酢
酸エチルをロータリー・エバポレーターで溜去す
ることにより12β−ヒドロキシ4ADを332mg得た。 上記の培養液から除去した菌体及び不溶物を牢
メタノール50mlに加えてその不溶物を溶解し、得
られたメタノール溶液を遠心分離機にかけること
により、メタノール上清液を得た。この上清液か
らロータリー・エバポレーターでメタノールを溜
去することにより12α−ヒドロキシプレグナ−４
−エン−３−オン−20−カルブアルデヒドを48mg
得た。 得られた12β−ヒドロキシ4ADの一部を取り、
これにメタノールを加えて２％溶液とし、この溶
液25μをミクロボンダパツクＣ−18カラムを備
えた高速液体クロマトグラフイー（米国ウオータ
ーズ社製、HLC−GPC−244型）に注入した。移
動相としてPH4.0に調整した水／メタノールの
30／70容量比の混合液を流速１ml／分で流し、検
出を屈折率方式で行なつた。得られた液体クロマ
トグラムにおける各ピークの面積比を積分計（島
津製作所製、島津クロマトパツクＣ−R1A）で
求め、この面積比から上記の12β−ヒドロキシ
4ADの純度を求めたところ、93％であつた。 また、上記で得られた12β−ヒドロキシ4AD及
び12α−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オ
ン−20−カルブアルデヒドの確認を下記の方法で
行なつた。 12β−ヒドロキシ4AD 融点：185〜186℃ マススペクトルｍ／Ｚ：302〔Ｍ〕⁺・ 287〔Ｍ−CH₃〕⁺・ 284〔Ｍ−H₂O〕⁺・ またｍ／Ｚ＝124より３−ケト−４−エンの存
在が確認された。 NMRスペクトル（90MHz）δ^CDCl3 _HMS： 0.86（3H、ｓ）18−CH₃ 1.16（3H、ｓ）19−CH₃ 4.12（1H、ｓ）12β−OH 5.72（1H、ｓ）４−Ｈ 12α−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン
−20−カルブアルデヒド 融点：179〜181℃ マススペクトルｍ／Ｚ：344〔Ｍ〕⁺・ 326〔Ｍ−H₂O〕⁺・ 316〔Ｍ−CO〕⁺・ またｍ／Ｚ＝124より３−ケト−４−エンの存
在が確認された。 NMRスペクトル（90MHz）δ^CDCl3 _HMS： 0.72（3H、ｓ）18−CH₃ 1.10（3H、ｄ）21−CH₃ 1.15（3H、ｓ）19−CH₃ 3.95（1H、ｓ）12β−Ｈ 5.70（1H、ｓ）４−Ｈ 9.40（1H、ｄ）22−CHO。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス・プチダD4014−A1615
   （Pseudomonas putida Ｄ−4014−A1615）菌株
   （微工研菌寄第6572号）を、デオキシコール酸及
   び／又はその塩を含む培地に培養して12β−ヒド
   ロキシアンドロスタ−４−エン−３，17−ジオン
   を生成せしめ、これを採取することを特徴とする
   12β−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，
   17−ジオンの製造法。