JPH05268944A - 新規胆汁酸変換微生物、及び胆汁酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高濃度の前駆体を、ウルソデオキシコール酸
の製造中間体として有用な３α−ヒドロキシ−７−ケト
−５β−コラン酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケ
ト−５β−コラン酸又は３α，１２α−ジヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸に、高収率で、変換する能力
を有する微生物の提供、及び、かかる微生物を使用して
これらの化合物を高収率で生産する方法の提供。 【構成】 前駆体を３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β
−コラン酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５
β−コラン酸又は３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸に変換する能力を有するバチルス・
エスピー TTUR 2-2 、 TTUR 4-1 、TTUR 4-2、TTUR 2-M
4 、TTUR 2-M5 、TTUR 2-M4-250 、TTUR 2-M4-294 、及
びこれらの微生物を前駆体含有培地で培養してこれらの
化合物を生産する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は胆汁酸変換能力を有する
新規微生物及びジ（又はトリ）ヒドロキシコラン酸の水
酸基の位置特異的な酸化方法に関する。更に詳しくは、
本発明はバチルス属に属する胆汁酸変換微生物、及びこ
れらの微生物を用いて３α，７α−ジ−ヒドロキシ−５
β−コラン酸（以下ケノデオキシコール酸という。）又
は、３α、７α、１２α−トリヒドロキシ−５β−コラ
ン酸（以下、コール酸という。）から利胆剤として有用
な３α、７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（以下、
ウルソデオキシコール酸という。）の製造中間体である
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸、又は３
α、１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸
若しくは３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−
コラン酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ケノデオキシコール酸からウルソ
デオキシコール酸を合成する方法としては、ケノデオキ
シコール酸の７位のα水酸基を化学的にβ水酸基とする
方法、すなわち、ケノデオキシコール酸の７位のα水酸
基の選択的酸化で３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸とし、この７−ケト基を立体選択的に還元して
７位がβ水酸基であるウルソデオキシコール酸とする方
法が知られている。

【０００３】又、微生物を用いてケノデオキシコール酸
から３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を製
造する方法としては、シュードモナス属に属する微生物
を用いる方法が知られている（特公昭６２−２５３５６
号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、化学的
合成法は、反応性、選択性及び操作上の安全性に問題が
あり、収率や得られる製品の純度の点でも満足できるも
のでなかった。

【０００５】又、微生物を用いた前記製造方法では、基
質であるケノデオキシコール酸の濃度が１％と低く、
又、変換率も30.5％と低いもので、満足のできるもので
はなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる現
状に鑑み、微生物を用い、高濃度のケノデオキシコール
酸を基質として、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸を製造する方法について鋭意研究を進めた結
果、バチルス属に属する新規微生物が、高濃度ケノデオ
キシコール酸を基質として、高収率で３α−ヒドロキシ
−７−ケト−５β−コラン酸を生産することを見い出し
た。これらの微生物は山形県米沢市内の土壌より単離さ
れたもので、本発明者らによってバチルス・エスピー T
TUR 2-2 (Bacillus sp. TTUR 2-2, 微工研条寄第3651
号) 、バチルス・エスピー TTUR 4-1(Bacillus sp.TTUR
4-1, 微工研菌寄第 11862号) 、バチルス・エスピー T
TUR 4-2 (Bacillus sp. TTUR 4-2, 微工研菌寄第 11863
号) と命名された。

【０００７】これらの菌株は、ケノデオキシコール酸の
主として７位の水酸基をケト基に酸化する能力を有し、
併せて弱いながらも３位の水酸基をケト基に酸化する能
力を有しているが、基質のケノデオキシコール酸を資化
あるいは分解する性質を示さない。

【０００８】本発明者らは基質としてのケノデオキシコ
ール酸をさらに高い収率で３α−ヒドロキシ−７−ケト
−５β−コラン酸に変換し得る微生物を得るためさらに
研究を進めた結果、上記バチルス・エスピー TTUR 2-2
菌株に通常の突然変異処理、例えば紫外線、Ｘ線若しく
はγ線等の照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイ
ド、アクリフラビン若しくはエチルメタンスルホネート
等突然変異誘発剤との接触を施すことにより、ケノデオ
キシコール酸を基質として、３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸をさらに高い収率（後記するごとく
100％又はほぼ 100％の収率）で生産する突然変異株を
分離することに成功した。

【０００９】このような突然変異株として、次の菌株を
挙げることができる。

【００１０】（１）バチルス・エスピー TTUR 2-M4 (Ba
cillus sp. TTUR 2-M4) 菌株 (微工研条寄第3393号) 。

【００１１】（２）バチルス・エスピー TTUR 2-M5 (Ba
cillus sp. TTUR 2-M5) 菌株 (微工研条寄第3398号) 。

【００１２】（３）バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250
(Bacillus sp. TTUR 2-M4-250) 菌株(微工研条寄第339
5号) 。

【００１３】（４）バチルス・エスピー TTUR 2-M4-294
(Bacillus sp. TTUR 2-M4-294) 菌株(微工研条寄第339
6号) 。

【００１４】これらの突然変異株は、いずれもケノデオ
キシコール酸から 100％もしくはほぼ 100％の変換率か
つ 100％もしくはほぼ 100％の選択率で、すなわち 100
％もしくはほぼ 100％の収率で３α−ヒドロキシ−７−
ケト−５β−コラン酸を生産する能力を有する。

【００１５】即ち、本発明によれば、バチルス属に属
し、ケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をケ
ノデオキシコール酸を含む栄養培地で培養し、培養物中
に３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成
せしめ、これを採取することを特徴とする３α−ヒドロ
キシ−７−ケト−５β−コラン酸の製造方法が提供され
る。更に、本発明によれば、この場合に使用される微生
物として、前記バチルス・エスピー TTUR 2-2 、バチル
ス・エスピー TTUR 4-1 、バチルス・エスピー TTUR 4-
2 、バチルス・エスピー TTUR 2-M4、バチルス・エスピ
ー TTUR 2-M5、バチルス・エスピー TTUR2-M4-250又は
バチルス・エスピー TTUR 2-M4-294が提供される。

【００１６】又、本発明者らは、基質をケノデオキシコ
ール酸からコール酸に代えて上記突然変異株を培養した
ところ、バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌株又はバチル
ス・エスピー TTUR 2-M5菌株では、３α−ヒドロキシ−
７，１２−ジケト−５β−コラン酸をバチルス・エスピ
ー TTUR 2-M4-250菌株又はバチルス・エスピー TTUR2-M
4-294菌株では、３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸を変換生成物として得た。

【００１７】即ち、本発明によれば、バチルス属に属
し、コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−
５β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をコール
酸を含む栄養培地で培養し、培養物中に３α−ヒドロキ
シ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸を生成せしめ、
これを採取することを特徴とする３α−ヒドロキシ−
７，１２−ジケト−５β−コラン酸の製造方法が提供さ
れる。更に、本発明によれば、この場合に使用される微
生物として前記バチルス・エスピー TTUR 2-M4又はバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M5が提供される。

【００１８】又、本発明によれば、バチルス属に属し、
コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸に変換する能力を有する微生物をコール酸
を含む栄養培地で培養し、培養物中に３α，１２α−ジ
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成せしめ、
これを採取することからなる３α，１２α−ジヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸の製造方法が提供され
る。更に本発明によれば、この場合に使用される微生物
として前記バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250又はバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-294が提供される。

【００１９】次に本発明についてさらに詳しく説明す
る。

【００２０】野生株バチルス・エスピー TTUR 2-2 、バ
チルス・エスピー TTUR 4-1 及びバチルス・エスピー T
TUR 4-2 の土壌からの分離は次の方法によった。

【００２１】土壌を５％のコール酸ナトリウムを含むホ
リコシ培地Ｉ〔グルコース１％、イースト・エキス 0.5
％、リン酸一水素カリウム 0.1％、硫酸マグネシウム・
７水和物0.02％、炭酸ナトリウム１％、pH10〕に少量懸
濁し、30℃で５日間集積培養し、得られた培養液の１白
金耳量を５％のコール酸ナトリウムを含むホリコシ培地
Ｉ寒天平板に画線培養し、菌株を純粋分離した。これら
の菌株を、各々５％のケノデオキシコール酸ナトリウム
を含むホリコシ培地Ｉ中で30℃で２日間培養し、培養液
中の３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸の定
量を行い、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン
酸の変換能の高い菌株を得た。

【００２２】これらの菌学的性質は下記表１−８に示す
通りであり、これらの試験及び分類方法は「バージエー
ズ・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロ
ジー（BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology)
」に準拠して行ったものであり、特に記載のない限
り、全て炭酸ナトリウムを添加し、pHを10に調整した培
地を使用した。

【００２３】

【表１】

【００２４】

【表２】

【００２５】

【表３】

【００２６】

【表４】

【００２７】

【表５】

【００２８】

【表６】

【００２９】

【表７】

【００３０】

【表８】

【００３１】以上の検索の結果、TTUR 2-2菌、TTUR 4-1
菌及びTTUR 4-2菌は好気性の有胞子細菌であることか
ら、バチルス(Bacillus)属に属する微生物であることは
明らかである。しかしながら、生育のための至適pHが10
前後のアルカリ側に存在することから一般のバチルス属
微生物とは異なる。

【００３２】また、これらの菌と好アルカリ性のバチル
ス属標準微生物として知られるバチルス・アルカロフィ
ルス(Bacillus alcalophilus) 及びバチルス・アルカロ
フィルス・サブスピーシス・ハロデュランス(Bacillus
alcalophilus subsp.halodurans)とを比較したときコロ
ニーの形状、コロニー周辺の様子において顕著に異なっ
ていた。

【００３３】好アルカリ性でコロニーが不規則、かつ周
辺が裂片状の菌株としてバチルス・セレウス8-1 菌(Bac
illus cereus 8-1, FERM2885, 特公昭53-13708号) 及び
バチルス・アルカロフィルス 202-1菌(Bacillus alcalo
philus 202-1, FERM2674, 特公昭53-27786号) が報告さ
れているが、これらの菌と比較してもその性状は異なっ
ていた。

【００３４】表９に TTUR 2-2菌、TTUR 4-1菌及びTTUR
4-2菌の主な性状を、表10にバチルス・アルカロフィル
ス、バチルス・アルカロフィルス・サブスピーシス・ハ
ロデュランス、バチルス・セレウス8-1 菌及びバチルス
・アルカロフィルス 202-1菌の主な性状を示した。

【００３５】

【表９】

【００３６】

【表１０】

【００３７】従って、本発明で使用されるTTUR 2-2菌、
TTUR 4-1菌及びTTUR 4-2菌は好気性の有胞子細菌である
が、上記の通り種々の菌学的性質において、特に生育の
ための至適pHが10付近のアルカリ性側に存在する点にお
いて、及びケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する点に
おいてバチルス属に属する公知の菌種とは区別されるこ
とから、これらを新菌種として設定することが適当であ
る。

【００３８】次に突然変異株バチルス・エスピー TTUR
2-M4、バチルス・エスピー TTUR 2-M5、バチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250及びバチルス・エスピー TTUR 2-M4
-294の具体的な取得方法を後述の実施例に示す。又、上
記突然変異株の菌学的性質を、参考のためそれらの親株
であるバチルス・エスピー TTUR 2-2 の菌学的性質と共
に表11〜表20に示した。

【００３９】なお、親株の場合と同様、表中の試験及び
分類方法は、「バージエーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティックバクテリオロジー（BERGEY'S MANUAL OF S
ystematic Bacteriology) 」に準拠して行ったものであ
り、特に記載のない限り、全て炭酸ナトリウムを添加
し、pHを10に調整した培地を用いた。

【００４０】

【表１１】

【００４１】

【表１２】

【００４２】

【表１３】

【００４３】

【表１４】

【００４４】

【表１５】

【００４５】

【表１６】

【００４６】

【表１７】

【００４７】

【表１８】

【００４８】

【表１９】

【００４９】

【表２０】

【００５０】一般に突然変異株は、その親株と同じ種に
属するものと考えられていることから、バチルス・エス
ピー TTUR 2-2 菌株の突然変異株は、いずれもその親株
と同じ新菌種に属するものと判定した。従って、本発明
に係る突然変異株は、バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌
株、TTUR 2-M5 菌株、TTUR 2-M4-250 菌株及び TTUR2-M
4-294菌株に限定されるものではなく、バチルス属に属
し、ケノデオキシコール酸を基質として３α−ヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸を生産する菌株、コール
酸を基質として３α−ヒドロキシ−７, １２−ジケト−
５β−コラン酸又は３α，１２α−ジヒドロキシ−７−
ケト−５β−コラン酸を生産する菌株であればいずれで
もよい。

【００５１】本発明によれば、バチルス属に属し、ケノ
デオキシコール酸を３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β
−コラン酸に変換する能力を有する微生物をケノデオキ
シコール酸を含む栄養培地で培養することにより、３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成させる
ことができる。

【００５２】又、本発明によれば、バチルス属に属し、
コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β
−コラン酸に変換する能力を有する突然変異株をコール
酸を含む栄養培地で培養することにより、３α−ヒドロ
キシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸を生成させる
ことができる。

【００５３】又、本発明によれば、バチルス属に属し、
コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸に変換する能力を有する突然変異株をコー
ル酸を含む栄養培地で培養することにより、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を生成さ
せることができる。

【００５４】栄養培地中における基質、すなわちケノデ
オキシコール酸またはコール酸の濃度は、特に限定はな
いが、目的とする変換生成物の収量、培養条件から、５
〜500g/l、好ましくは40〜300g/lの範囲とするのが適当
である。

【００５５】本発明において使用することができる培地
としては、本発明で使用する微生物が培養により増殖し
得るものであれば任意のものでよく、例えば炭素源とし
ては、グルコース、フラクトース、スクロース、グリセ
リン、澱粉、フスマ、廃糖蜜等の各種糖質原料を、窒素
源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
スティープリカー、大豆粉、菜種油粕、尿素、各種アミ
ノ酸、アミノ糖等の有機窒素含有物質や、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素
化合物を用いることができる。又、この他、微量の無機
金属塩類、ビタミン類、生長促進因子等を添加すること
が好ましい。

【００５６】本発明方法における培養は好気的条件下
に、例えば通気攪拌や往復振盪方法によって培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
いえば、温度20〜40℃、pH７〜11、１〜６日程度の条件
で実施する。

【００５７】なお、高アルカリ側のpH、例えばpH10で培
養を行う場合には、培養中における雑菌混入のおそれが
少なく、通常行われる培地の滅菌操作を省略することが
できる。もっとも、かかる場合でも滅菌操作を行うこと
は何ら差し支えない。

【００５８】培養終了物から目的とする変換生成物、す
なわち、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン
酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラ
ン酸または３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５
β−コラン酸を採取するには、まず培養物中の菌及び不
溶成分を濾過又は遠心分離等により分離除去し、得られ
た培養濾液又は上清に塩酸又は硫酸を加えて酸性とす
る。これにより、生成した変換生成物が収率良く沈澱す
る。次に、この沈澱物を濾別し、再結晶操作を行うこと
により、高純度の変換生成物を回収することができる。

【００５９】これらの変換生成物は、いずれも更に微生
物変換に付し、又は化学反応と組み合わせることによ
り、ウルソデオキシコール酸に誘導することができる。

【００６０】

【実施例】以下、本発明を実施例をもって説明するが、
本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものでない
ことはいうまでもない。

【００６１】各実施例において、生成物の同定は、以下
の条件による薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロ
マトグラフィーにより行った。

【００６２】（１）薄層クロマトグラフィー： 〔担体〕Kieselgel 60 (0.25mm厚、メルク社製） 〔展開溶媒〕（１） ベンゼン／イソプロピルアルコー
ル／酢酸(40/10/1 体積比) (2) クロロホルム／アセトン／酢酸(7/2/1 体積比) 〔発色〕リンモリブデン酸−硫酸試薬（リンモリブデン
酸1gをメタノール２0mlに溶解し、濃硫酸１mlを添加し
たもの) を噴霧し、胆汁酸スポットが濃青色となるまで
加熱発色する。

【００６３】［試料のチャージ］培養液１μl を添着す
る。

【００６４】（２）高速液体クロマトグラフィー： (1) 〔カラム〕カプセルパックＣ18カラム（タイプ AG
120, S-5μm,カラムサイズ 4.6φ×150mm 、資生堂製) 〔移動相〕メタノール／精製水／リン酸（70/30/0.02M
重量比) 〔流速〕 1.7ml／min (2) 〔カラム〕イナートシルＯＤＳカラム（カラムサイ
ズ 4.6φ×250mm 、ジーエルサイエンス製) 〔移動相〕メタノール／精製水／リン酸（70/30/0.02M
重量比) 〔流速〕 1.0ml／min 〔検出〕ＲＩ 〔ピークの同定〕標準品と照合 各突然変異株の分離は次の方法によった。

【００６５】（１）バチルス・エスピー TTUR 2-M4菌
株、及びバチルス・エスピー TTUR 2-M5菌株。

【００６６】アルカリ性ＮＡ培地（組成：普通ブイヨン
‘栄研’（商品名）1.8%、寒天1.8%、炭酸ナトリウム0.
75% 、pH10) のスラントに生育させたバチルス・エスピ
ー TTUR 2-2 菌株を一白金耳量取り、ホリコシ培地Ｉ
（組成：グルコース1%、ペプトン0.5%、イーストエキス
0.5%、リン酸一水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム・
７水和物0.02% 、炭酸ナトリウム1%、pH10) 20ml入りの
試験管 (30φ×190mm)に接種し、30℃で16時間振盪培養
した。

【００６７】次に、対数増殖期にある上記菌体を遠心分
離操作により無菌的に集菌し、0.1Mトリス−マレイン酸
緩衝液（pH8.0)10mlで３回洗浄操作を行った。洗浄後の
菌体を同一緩衝液25mlに懸濁し、これに終濃度が60μg/
mlとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下、ＮＴＧという）を添加し、30℃で
30分間インキュベートして突然変異処理を行った。な
お、この処理条件下でのバチルス・エスピー TTUR 2-2
の死滅率は85％であった。

【００６８】次に、この菌懸濁液１mlを採取し、直ちに
９mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5) で希釈して遠
心分離操作により集菌し、さらに同一緩衝液による洗浄
操作を２回繰り返した後、アルカリ性ＮＢ培地（組成：
普通ブイヨン‘栄研’1.8%、炭酸ナトリウム0.75% 、pH
10) 10mlに懸濁した。得られた菌懸濁液をアルカリ性Ｎ
Ｂ培地で適宜希釈し、これをアルカリ性ＮＡ平板培地上
で10〜 100個のコロニーを出現させるように塗布した
後、30℃で２日間培養した。

【００６９】出現したコロニーのうち、２日後に生育
し、かつコロニーサイズが中程度のものを単離し、５％
ＣＡ寒天培地（組成：ホリコシ培地Ｉにコール酸５％、
水酸化ナトリウム0.5%、寒天1.8%を添加したもの、pH1
0) のスラントに移植し、30℃で３日間培養した。十分
生育した菌株を選択し、その一白金耳量を５％ＣＡ液体
培地（組成：５％ＣＡ寒天培地より寒天を除いたもの、
pH10) の入った試験管（培地量４ml、16.5φ×165mm)に
接種し、30℃で３日間振盪培養した。得られたそれぞれ
の培養液中の変換生成物を薄層クロマトグラフィーで検
討し、コール酸の３位水酸基をケト基に変換する能力を
完全に欠如した突然変異株（バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株及びバチルス・エスピー TTUR 2-M5菌株) をそ
れぞれ見い出した。以下、上述した突然変異株取得方法
を単にＮＴＧ処理と称する。

【００７０】（２）バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250
菌株、及びバチルス・エスピー TTUR2-M4-294菌株。

【００７１】（１）のＮＴＧ処理で得られたバチルス・
エスピー TTUR 2-M4を親株として、ＮＴＧ処理を繰り返
した。但し、初発菌体増殖培地として５％ＣＡ液体培地
を用い、ＮＴＧ処理時のＮＴＧ濃度を60μg/mlとした。
その結果、目的とするコール酸の３位水酸基及び１２位
水酸基をケト基に変換する能力を完全に欠如した突然変
異株（バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250菌株及びバチ
ルス・エスピー TTUR2-M4-294菌株) をそれぞれ見出し
た。なお、本操作におけるバチルス・エスピーTTUR 2-M
4 菌株の死滅率は、15％であった。

【００７２】（１）及び（２）のＮＴＧ処理で得られた
突然変異株を５％ケノデオキシコール酸を含むホリコシ
培地Ｉ中で30℃で３日間試験管振盪培養（培地量４ml、
試験管16.5φ×165mm)し、得られた変換生成物を薄層ク
ロマトグラフィーで検討したところ、目的とする３α−
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸が特異的に生成
していることを確認した。

【００７３】〔実施例１〕バチルス・エスピー TTUR 2-
2(Bacillus sp. TTUR 2-2,微工研条寄第3651号)を以下
に示す方法で培養した。グルコース10g 、ペプトン5g、
イースト・エキス5g、リン酸一水素カリウム1g、硫酸マ
グネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに溶解し、ま
たケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウム5g、炭
酸ナトリウム10g を精製水500ml に溶解し、それぞれ 1
21℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(pH1
0)。

【００７４】この培地20mlを試験管（3 φ×19cm) に分
注後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール酸及
び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入りの
試験管中で30℃で20時間振盪培養して増殖させた菌液
0.1mlを無菌的に接種した。その後30℃で２日間振盪培
養した。

【００７５】培養後、遠心分離で菌体を除去し、得られ
た培養上清に希硫酸を添加して酸性にすると、３α−ヒ
ドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸及び未変換のケノ
デオキシコール酸が沈澱した。この沈澱物を採取し、乾
燥して白色粉末 0.98gを得た。この一部を取り、高速液
体クロマトグラフィーにより、ケノデオキシコール酸、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸及びその
他のケノデオキシコール酸酸化生成物( 以下「他の胆汁
酸」という。) の生成率を求めたところ、ケノデオキシ
コール酸2.8%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コ
ラン酸 85.9%及び他の胆汁酸11.3% であった。混合物を
メタノールから再結晶して、純粋な３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸を得た。

【００７６】〔実施例２〕実施例１の菌体をバチルス・
エスピー TTUR 4-1(Bacillus sp. TTUR 4-1,微工研菌寄
第 11862号) とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸1.
6%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸75.3
％及び他の胆汁酸 23.1%であった。

【００７７】〔実施例３〕実施例１の菌株をバチルス・
エスピー TTUR 4-2(Bacillus sp. TTUR 4-2,微工研菌寄
第 11863号) とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸０
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸87.7
％及び他の胆汁酸 12.3%であった。

【００７８】〔実施例４〕グルコース 10g、ペプトン5
g、イースト・エキス5g、リン酸一水素カリウム1g、硫
酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに溶解
し、またケノデオキシコール酸100g、水酸化ナトリウム
10g 、炭酸ナトリウム10g を精製水500ml に溶解し、そ
れぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地と
した(pH10)。

【００７９】この培地 100mlを坂口フラスコ(500ml容)
に分注後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール
酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入
りの試験管（3 φ×19cm) 中で30℃で20時間振盪培養し
て増殖させたバチルス・エスピー TTUR 2-2 の菌液 0.1
mlを無菌的に接種した。その後30℃で４日間振盪培養し
た。

【００８０】以下実施例１と同様に処理して粗製の３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を得た。生成
比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸は4.2%、３
α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸88.5% 及び
他の胆汁酸7.3%であった。

【００８１】〔実施例５〕実施例２の水酸化ナトリウム
を7g(pH10.5)とした以外は、実施例２と同様に操作し
た。生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸4.
2%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸85.9
% 及び他の胆汁酸9.9%であった。

【００８２】〔実施例６〕実施例３のケノデオキシコー
ル酸を150g、水酸化ナトリウムを 15gとし、培養日数を
４日間とした以外は、実施例３と同様に操作した。生成
比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸22.2% 、３
α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸65.3% 及び
他の胆汁酸12.5% であった。

【００８３】〔実施例７〕バチルス・エスピー TTUR 2-
M4(Bacillus sp. TTUR 2-M4)菌株（微工研条寄第3393
号) を以下に示す方法で培養した。グルコース 10g、ペ
プトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリウム1
g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水500mlに溶
解し、又ケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウム
5g 、炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、そ
れぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地と
した(pH10)。

【００８４】この培地20mlを試験管(3φ×19cm) に分注
後、あらかじめ上記培地からケノデオキシコール酸及び
水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml入りの試
験管中30℃で一夜振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを
無菌的に接種した。その後30℃で３日間振盪培養した。

【００８５】培養後、遠心分離で菌体を除去し、得られ
た培養上清に希硫酸を加えて酸性にすると、沈澱物が生
成した。この沈澱物を採取し、乾燥して白色粉末0.999g
を得た。この一部を採り、高速液体クロマトグラフィー
により、ケノデオキシコール酸及び３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸の生成比率を求めたところ、
ケノデオキシコール酸 0% 、３α−ヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸100%（回収率99.9%)であった。

【００８６】〔実施例８〕実施例７の菌株をバチルス・
エスピー TTUR 2-M5(Bacillus sp. TTUR 2-M5)菌株（微
工研条寄第3398号) とした以外は、実施例７と同様に操
作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸0%、３α−
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸100%（回収率9
9.9%)であった。

【００８７】〔実施例９〕実施例７の菌株をバチルス・
エスピー TTUR 2-M4-250 (Bacillus sp. TTUR 2-M4-25
0) 菌株（微工研条寄第3395号) とした以外は、実施例
７と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール
酸0%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸10
0%（回収率99.9%)であった。

【００８８】〔実施例１０〕実施例７の菌株をバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-294 (Bacillus sp. TTUR 2-M4-2
94) 菌株（微工研条寄第3396号) とした以外は、実施例
７と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール
酸1.4%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸
98.6% （回収率99.9%)であった。

【００８９】〔実施例１1 〕実施例７の培地からグルコ
ースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例７と同
様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100
％であった。

【００９０】〔実施例１２〕実施例１０の培地からグル
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例１０
と同様に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸
０％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 1
00％であった。

【００９１】〔実施例１３〕バチルス・エスピー TTUR
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。イーストエキス
5g、リン酸一水素カリウム1g、硫酸マグネシウム・７水
和物0.2gを精製水 500mlに溶解し、又ケノデオキシコー
ル酸 50g、水酸化ナトリウム 5g 、炭酸ナトリウム 4g
を精製水 500mlに溶解し、それぞれ 121℃で15分間滅菌
した。冷却後混合し、培地とした(pH9.7) 。

【００９２】以下、実施例８と同様に操作した。生成比
率は、ケノデオキシコール酸０％、３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸 100％であった。

【００９３】〔実施例１４〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例１３と同様
に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０％、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％で
あった。

【００９４】〔実施例１５〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白(アジプロン
E3;商品名、味の素社製)10g、リン酸一水素カリウム1
g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500mlに
溶解し、又ケノデオキシコール酸 50g、水酸化ナトリウ
ム 5g 、炭酸ナトリウム 2g を精製水 500mlに溶解し、
それぞれ121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地
とした(pH10.2)。

【００９５】以下、実施例７と同様に操作した。生成比
率は、ケノデオキシコール酸０％、３α−ヒドロキシ−
７−ケト−５β−コラン酸 100％であった。

【００９６】〔実施例１６〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M5を用いた以外は、実施例１５と同様に操
作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸０％、３α
−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％であっ
た。

【００９７】〔実施例１７〕バチルス・エスピー TTUR
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又ケノデオキシコール酸100g、水酸化ナト
リウム10g 、炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解
し、それぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、
培地とした(pH10)。

【００９８】この培地 100mlを坂口フラスコ(500ml容)
に分注後、あらかじめ上記と同一組成の培地20ml入りの
試験管（3 φ×19cm) 中30℃で48時間振盪培養して増殖
させた菌液２mlを無菌的に接種した。その後30℃で６日
間振盪培養した。

【００９９】以下、実施例８と同様に操作した。生成比
率は、ケノデオキシコール酸 5.8％、３α−ヒドロキシ
−７−ケト−５β−コラン酸94.2％であった。

【０１００】〔実施例１８〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又コール酸 50g、水酸化ナトリウム 5g 、
炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、それぞれ
121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(p
H10)。

【０１０１】この培地20mlを試験管（3 φ×19cm) に分
注後、あらかじめ上記培地からコール酸及び水酸化ナト
リウムを除いた同一組成の培地20ml入りの試験管中30℃
で一夜振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを無菌的に接
種した。その後30℃で３日間振盪培養した。

【０１０２】以下、実施例７と同様に操作してコール酸
及び３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラ
ン酸の生成比率を求めたところ、コール酸0%、３α−ヒ
ドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸100%（回
収率99.7%)であった。

【０１０３】〔実施例１９〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M5を用い、培養日数を２日間とした以外
は、実施例１８と同様に操作した。生成比率は、コール
酸０％、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−
コラン酸98.2％、３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸1.4%、３α，７α−ジヒドロキシ−
１２−ケト−５β−コラン酸0.3%（回収率99.6%)であっ
た。

【０１０４】〔実施例２０〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例１８と同様
に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α，１２α
−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100％であ
った。

【０１０５】〔実施例２１〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-294を用いた以外は、実施例１８と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 0.8％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.2％で
あった。

【０１０６】〔実施例２２〕実施例１９の培地からグル
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例１９
と同様に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α−
ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸 100％
であった。

【０１０７】〔実施例２３〕実施例２１の培地からグル
コースを除いた培地(pH10)を用いた以外は、実施例２１
と同様に操作した。生成比率は、コール酸０％、３α，
１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 100
％であった。

【０１０８】〔実施例２４〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白（エス
サンミート；商品名、味の素社製）10g 、リン酸一水素
カリウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水
500mlに溶解し、又コール酸 50g、水酸化ナトリウム 5
g 、炭酸ナトリウム２g を精製水 500mlに溶解し、それ
ぞれ 121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とし
た(pH10.2)。

【０１０９】以下、実施例１８と同様に操作した。生成
比率は、コール酸０％、３α−ヒドロキシ−７, １２−
ジケト−５β−コラン酸99.5% 、３α，１２α−ジヒド
ロキシ−７−ケト−５β−コラン酸 0.3％、３α，７α
−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸 0.2% で
あった。

【０１１０】〔実施例２５〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２４と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 0.5％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.5％で
あった。

【０１１１】〔実施例２６〕バチルス・エスピー TTUR
2-M4菌株を以下に示す方法で培養した。グルコース10g
、ペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸一水素カリ
ウム1g、硫酸マグネシウム・７水和物0.2gを精製水 500
mlに溶解し、又コール酸100g、水酸化ナトリウム10g 、
炭酸ナトリウム10g を精製水 500mlに溶解し、それぞれ
121℃で15分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした(p
H10)。

【０１１２】この培地20mlを試験管(3φ×19cm) に分注
後、あらかじめ上記と同一組成の培地20ml入りの試験管
中30℃で24時間振盪培養して増殖させた菌液 0.1mlを無
菌的に接種した。その後30℃で４日間振盪培養した。

【０１１３】以下、実施例１９と同様に操作した。生成
比率は、コール酸 2.0％、３α−ヒドロキシ−７，１２
−ジケト−５β−コラン酸74.0％、３α，１２α−ジヒ
ドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸12.8% 、３α，７
α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸11.2%
であった。

【０１１４】〔実施例２７〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２６と同様
に操作した。生成比率は、コール酸 5.0％、３α，１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸95.0％で
あった。

【０１１５】〔実施例２８〕バチルス・エスピー TTUR
2-M5菌株を以下に示す方法で培養した。大豆蛋白（アジ
プロン E3)10g 、イーストエキス1g、リン酸一水素カリ
ウム2g、硫酸マグネシウム・７水和物0.4gを精製水1000
mlに溶解し、又ケノデオキシコール酸100g、水酸化ナト
リウム10g 、炭酸ナトリウム５g を精製水1000mlに溶解
した。これらを滅菌することなく、5l容の卓上型ジャー
ファーメンター装置内で混合し、培地とした(pH10.4)。

【０１１６】あらかじめ上記培地からケノデオキシコー
ル酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地20ml
入りの試験管中30℃で20時間振盪培養して増殖させたバ
チルス・エスピー TTUR 2-M5菌液40mlをこの培地に接種
した。その後、通気量2l/min、30℃で３日間攪拌（300r
pm) 培養した。

【０１１７】培養後、遠心分離(3500rpm×15min)で菌体
を除去し、得られた培養上清に希硫酸を加えてpH2.5 に
すると、沈澱物が生成した。この沈澱物を濾別、水洗
し、得られた結晶を50℃で乾燥して白色粉末 99.2gを得
た。この一部を採り、高速液体クロマトグラフィーによ
り、生成比率を求めたところ、ケノデオキシコール酸0
%、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸100%
（回収率99.1%)であった。

【０１１８】〔実施例２９〕菌株としてバチルス・エス
ピー TTUR 2-M4-250を用いた以外は、実施例２８と同様
に操作した。生成比率は、ケノデオキシコール酸 0.5
％、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸99.5
％（回収率99.0%)であった。

【０１１９】

【発明の効果】本発明に係るバチルス属の新規微生物を
用いる場合には高濃度の基質ケノデオキシコール酸また
はコール酸を、高収率で、ウルソデオキシコール酸の製
造中間体である、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸、３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β
−コラン酸または３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
ト−５β−コラン酸に変換することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキ
   シ−７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する
   点においてバチルス属に属する公知の菌種と異なる新菌
   種バチルス・エスピー TTUR 2-2 、バチルス・エスピー
   TTUR 4-1 及びバチルス・エスピー TTUR 4-2 。
2. 【請求項２】 ケノデオキシコール酸を３α−ヒドロキ
   シ−７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有する
   バチルス・エスピー TTUR ２-M4, バチルス・エスピー
   TTUR 2-M5, バチルス・エスピー TTUR 2-M4-250又はバ
   チルス・エスピー TTUR 2-M4-294。
3. 【請求項３】 バチルス属に属し、ケノデオキシコール
   酸を３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸に変
   換する能力を有する微生物をケノデオキシコール酸を含
   む栄養培地で培養して培養物中に３α−ヒドロキシ−７
   −ケト−５β−コラン酸を生成せしめ、これを採取する
   ことを特徴とする３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−
   コラン酸の製造方法。
4. 【請求項４】 微生物が、バチルス・エスピー TTUR 2-
   2 、バチルス・エスピー TTUR 4-1 、バチルス・エスピ
   ー TTUR 4-2 、バチルス・エスピー TTUR 2-M4、バチル
   ス・エスピー TTUR 2-M5、バチルス・エスピー TTUR 2-
   M4-250又はバチルス・エスピー TTUR 2-M4-294である請
   求項３の製造方法。
5. 【請求項５】 コール酸を３α−ヒドロキシ−７，１２
   −ジケト−５β−コラン酸に変換する能力を有するバチ
   ルス・エスピー TTUR 2-M4又はバチルス・エスピー TTU
   R 2-M5。
6. 【請求項６】 バチルス属に属するコール酸を３α−ヒ
   ドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸に変換す
   る能力を有する微生物をコール酸を含む栄養培地で培養
   して培養物中に３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−
   ５β−コラン酸を生成せしめ、これを採取することを特
   徴とする３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−
   コラン酸の製造方法。
7. 【請求項７】 微生物が、バチルス・エスピー TTUR 2-
   M4又はバチルス・エスピー TTUR 2-M5である請求項６記
   載の製造方法。
8. 【請求項８】 コール酸を３α，１２α−ジヒドロキシ
   −７−ケト−５β−コラン酸に変換する能力を有するバ
   チルス・エスピー TTUR 2-M4-250又はバチルス・エスピ
   ー TTUR 2-M4-294。
9. 【請求項９】 バチルス属に属し、コール酸を３α，１
   ２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸に変換
   する能力を有する微生物をコール酸を含む栄養培地で培
   養して培養物中に３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケ
   ト−５β−コラン酸を生成せしめ、これを採取すること
   を特徴とする３α，１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−
   ５β−コラン酸の製造方法。
10. 【請求項１０】 微生物が、バチルス・エスピー TTUR
    2-M4-250又はバチルス・エスピー TTUR 2-M4-294である
    請求項９記載の製造方法。
11. 【請求項１１】 栄養培地のpHが７〜11であることを特
    徴とする請求項３、６又は９記載の製造方法。