KR0169498B1 - 신규 미생물 및 3알파, 7알파-디히드록시-12-케토-5베타-콜란산의 제조방법 - Google Patents

신규 미생물 및 3알파, 7알파-디히드록시-12-케토-5베타-콜란산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

바실러스속에 속하고 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 생산성을 갖는 균주를, 3α, 7α, 12α-트리히드록시-5β-콜란산을 함유하고 배지의 pH가 바람직하게는 7~11인 영양 배지에서 배양시킨 다음, 배양 배지중의 생성물을 회수함을 특징으로 하는 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 제조방법이 개시되어 있다.
상기 균주는 바실러스속의 돌연변이 균주이며, 실질적으로 100% 전환율 및 실질적으로 100% 수율로 상기 산을 생산할 수 있다.

Description

신규 미생물 및 3α(알파), 7α(알파)-디히드록시-12-케토-5β(베타)-콜란산의 제조방법
본 발명은 담석 용해제로서, 및 이담제인 우르소데옥시콜산의 제조 원료로서 유용한 케노데옥시콜산의 제조 중간체인 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산(이하, 12-케토-콜산이라 약칭함)으로부터 미생물을 이용하여 제조하는 방법 및 신규 미생물에 관한 것이다.
종래, 콜산으로부터 12-케토-콜산을 제조하기 위한 화학적 방법으로서, 콜산의 12 위치의 히드록실기를 선택적으로 산화하는 방법이 공지되어 있었다. 또한, 콜산으로부터 12-케토-콜산을 제조하기 위한 미생물학적 방법으로는, 예를 들면 미크로코커스(Micrococcus) 속의 미생물을 이용한 방법(일본국 특허 공고 제 평성 1-51998호), 아트로박터(Arthrobacter) 속의 미생물을 이용한 방법(일본국 특허 공고 제 평성 1-20873호, 일본국 특허 공고 제 평성 2-62234 )이 공지되어 있다.
그러나, 전자의 12-케토-콜산의 화학적 제조방법은 반응성, 반응 선택성 및 조작상의 안전성 측면에서 문제가 있으며, 생성물의 수율 및 순도의 점에서도 만족스럽지 못하다. 또한, 후자의 미생물 이용 방법은 미생물이 본질적으로 콜산 기질을 동화하고 일부 부생성물을 생산하기 때문에 생성물의 수율 및 성질이 점에서 반드시 만족스럽다고 할 수 없다.
본 발명자들은 12-케토-콜산 생산능을 갖는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 12-케토-콜산의 제조방법에 대해 연구를 행하였으며, 그 결과, 통상의 미생물은 생육할 수 없는 고농도의 콜산을 함유하는 고 알칼리성 배양 배지중에서 생육 가능한 바실러스(Bacillus) 속 미생물이 콜산을 기질로 하여 이로부터 12-케토-콜산, 3α, 12α-디히드록시-7-케토-5β-콜란산 및 3α-히드록시-7, 12-디케토-5β-콜란산을 주요 전환 생성물로 생산함을 알아내었으며, 이 미생물을 바실러스 sp. TTUR 2-2(일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업 기술연구소, 수탁번호 11861(이하, FERM 11861이라 약칭함))이라 명명하였다. 이 미생물은 요마가따껭 요네자와시의 토양에서 단리되었다.
상기 균은 콜산의 주로 7-위치 및 12-위치의 히드록시기를 케토기로 산화시키는 능력과, 비록 약하긴 하지만 콜산의 3-위치의 히드록시기를 케토기로 산화시키는 능력을 갖고 있지만, 콜산의 동화 또는 분해 능력은 없다.
또한, 상기 균은 고 알칼리성 배지 중에서 생육 가능하기 때문에, 고 농도의 콜산을 함유하는 배양 배지를 제조할 수 있고, 균의 배양에 앞서 통상의 배양 배지에 필요한 공정인 배양 배지 살균 공정을 피할 수도 있다.
본 발명자들은 상기 균을 돌연변이 처리, 예컨대 자외선, X선, γ선 등을 조사하거나, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(이하 NTG라 약칭함), 4-니트로 퀴놀린-N-옥사이드, 아크리플라빈, 에틸메탄술포네이트 등과 같은 돌연변이 유발제와 접촉시킴으로써, 콜산으로부터 12-케토-콜산을 실질적으로 100% 전환율 및 실질적으로 100% 수율로 생산하는 능력을 가진 변이주를 단리함에 의해 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 콜산을 함유하는 영양 배지에서 12-케토-콜산의 생산능력을 갖는 바실러스에 속하는 미생물을 배양하여 배양 배지중에서 12-케토-콜산을 생성시키고, 이 12-케토-콜산을 수집함을 특징으로 하는 12-케토-콜산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 첫번째 목적은 3α, 7α, 12α-트리히드록시-5β-콜란산을 함유하는 영양 배지에서 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 생산능력을 갖는 바실러스 속 미생물을 배양하고, 배양 배지중에 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 생산능력을 갖는 균을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 바실러스 sp. TTUR 2-2 유래의 상기 돌연변이 균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124(FERM 3394) 및 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336(FERM 3397)이라 명명하였다. 상기 균의 단리 방법은 다음과 같다:
(1) 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124
알칼리 NA 배지(조성:보통 육즙 EIKEN(상품명) 1.8%, 한천 1.8%, 탄산나트륨 0.75%, pH 10) 슬랜트에서 배양된 바실러스 sp. TTUR 2-2의 백금이 량을 20ml의 호리꼬시(HORIKOSHI) 배지 I(조성:글루코오스 1%, 펩톤 0.5%, 효모추출물 0.5%, 인산 일수소칼륨 0.1%, 황산 마그네슘 7 수화물 0.02%, 탄산나트륨 1%, pH 10)을 함유하는 시험관(30ψ×190㎜)에 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 진탕 배양한다.
이어서, 대수 증식기의 상기 균체를 원심분리에 의해 무균적으로 수집하고, 0.1M 트리스-말레산 완충액(pH 8.0) 10ml로 3회 세척한다. 세척후의 균체를 동일한 완충액 25ml에 첨가하여 현탁액을 형성한 다음, NTG를 현탁액에 첨가하여 균체의 최종 농도가 60μg/ml로 되도록 하고, 현탁액 중의 균체를 30℃에서 30분간 배양하고 돌연변이 처리를 행한다. 이 처리도중 바실러스 sp. TTUR 2-2의 사멸율은 85%이다.
이어서, 1ml의 균체 현탁액을 취하여 이 현탁액을 0.1M 탄산나트륨 완충액(pH 9.5) 9ml로 희석하고, 원심분리기에 의해 균체를 수집하고, 동일 완충액으로 2회 세척한 후, 균체를 10ml의 알칼리성 NB 배지(조성:보통육즙 EIKEN 1.8%, 탄산나트륨 0.75%, pH 10)에 현탁시킨다. 이렇게 제조된 균체 현탁액을 임의로 알칼리성 NB 배지로 희석하고, 알칼리성 NA 평판 배양 배지상에 10~100개의 콜로니가 출현되도록 도포한 후, 30℃에서 2일간 배양한다.
출현된 콜로니중에서, 배양개시후 2일간 생육된 중간 크기의 콜로니를 단리해 내고, 이 콜로니를 5% CA 한천 배지(조성:콜산 5%, 수산화나트륨 0.5%, 한천 1.8%를 호리꼬시 배지 Ⅰ에 첨가한 배지, pH 10) 슬랜트에 이식하고, 콜로니의 균체를 30℃의 온도에서 3일간 배양한다. 충분히 생육된 균주를 선택하고, 이 균주의 백금이 량을 5%의 CA 액체 배지(조성:5% CA 한천 배지에서 한천 제거, pH 10)를 함유하는 시험관(16.5ψ×165㎜)에 접종한다. 시험관중의 배지 량은 4ML이다. 시험관내의 균주를 30℃에서 3일간 진탕 배야한다. 배양 배지내에서 전환된 생성물을 얇은막 크로마토그래피에 의해 검사한 결과, 3α-히드록시-7, 12-디케토-5β-콜란산을 특이적으로 생산하는 돌연변이주를 알아내었으며, 이 균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4(FERM 3393)이라 명명하였다. 상기의 돌연변이주 수득 방법은 이하에서 NTG 처리라 칭한다.
이어서, 상기 NTG 처리에 의해 수득된 바실러스 sp. TTUR-2M4를 친주로 하여 NTG 처리를 반복한다. 단, 초기 균체 증식 배지로는 5% CA액체 배지를 사용하고, NTG 처리중의 NTG 농도는 60μg/ml이다. 그 결과, 12-케토-콜산을 특이적으로 생산하는 균주를 알아내었으며, 이 균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124라 명명하였다. 상기 조작 도중 바실러스 sp. TTUR 2-M4의 사멸율은 15%이다.
(2) 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336
초기 균체 증식 배지로서 5% CA 액체 배지를 사용하고 NTG 처리중의 NTG 농도가 100μg/ml인 조건하에서 상기 (1)의 NTG 처리에 의해 수득된 바실러스 sp. TTUR 2-M4를 친주로 하여 NTG 처리를 반복한다. 그 결과, 12-케토-콜산을 특이적으로 생산하는 균주를 알아내었으며, 이 균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336이라 명명한다. 상기 조작도중 바실러스 sp. TTUR 2-M4의 사멸율은 45%이다.
상기 균의 세균학적 특성을 하기 표 1~4에 기재한다. 시험 및 분류방법은 문헌 BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology에 준하며, 달리 특별히 정의되지 않는한 모든 사용 배지에는 탄산나트륨을 첨가하고 모든 배지를 pH 10으로 조절한다.
상기 검색 결과에 따르면, 바실러스 sp. TTUR 2-2는 유포자 호기성 세균이기 때문에 바실러스속에 속하는 미생물임이 분명하다. 그러나, 생육적정 pH가 pH 9~10 범위이 알칼리쪽에 존재함을 고려하면, 바실러스 sp. TTUR 2-2는 전형적인 바실러스 미생물이 아니다.
또한, 바실러스 sp. TTUR 2-2가 바실러스속의 표준 호알칼리성 균으로 공지된 바실러스 알칼로필루스 및 바실러스 알칼로필루스 아종 할로두란스를 비교해보면, 콜로니의 형상 및 주변에서 양자간에 현저한 차이점이 존재한다.
불규칙한 형상의 콜로니 및 열편상의 콜로니 주변을 갖는 호알칼리성 균주로서는, 바실러스 세레우스 8-1(FERM 2885, 일본국 특허 공고 제 소화53-13708호) 및 바실러스 알칼로필루스 202-1(FERM 2674, 일본국 특허 공고 제 소화 53-27786호)이 보고되어 있지만, 이들의 콜로니 형상은 바실러스 sp. TTUR 2-2의 것과는 상이하다.
표 5에는 바실러스 sp. TTUR 2-2, 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124, 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336 및 바실러스 알칼로필루스의 주요특징을 나타내었으며, 표 6에는 바실러스 알칼로필루스 아종 할로두란스, 바실러스 세레우스 8-1(FERM 2885, 일본국 특히 공고 제 소화 53-13708호) 및 바실러스 알칼로필루스 202-1(FERM 2674, 일본국 특허 공고 제 소화 53-27786호)의 주요특징을 각각 나타내었다.
TTUR 2-2 호기성의 유포자 세균이긴 하지만, 상기 균학적 성질의 측면에서, 특히 생육 적정 pH 범위가 9~10 부근의 알칼리측에 존재한다는 점에서 공지의 균종과는 구별되기 때문에, TTUR 2-2를 신규의 균종으로 분류하는 것이 적당하다.
또한, 일반적으로 돌연변이주는 그의 친주와 동일한 종에 속하는 것으로 생각되므로, 바실러스 sp. 2-2의 2차 변이주인 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124 및 TTUR 2-M4-336은 그의 친주와 동일한 균종에 속하는 것으로 판정된다.
다시 말해서, 본 발명의 균은 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124 및 TTUR 2-M4-336에 한정되지 않으며, 바실러스속에 속하고 콜산 기질로부터 12-케토-콜산을 생산할 수 있는 균이면 어느 것이든 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 배양 배지는 상기 균이 생육가능한 임의의 배지이며, 예를 들면 탄소원으로서 글루코오스, 프락토오스, 말토오스, 사카로오스, 글리세린, 전분, 밀기울, 폐당밀 등의 당류를, 질소원으로서 펩톤, 육류추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 대두분, 평지씨유 케이크, 각종 아미노산, 아미노당 등의 유기 질소 화합물 및 질산 암모늄, 염화암모늄, 질산나트륨 등의 무기 질소 화합물을 사용할 수 있다. 또한 미량의 무기 금속염, 비타민, 생장 촉진 인자 등을 첨가하는 것이 바람직하다.
배양 배지 중의 콜산 농도는, 특별히 한정되지는 않지만, 12-케토-콜산의 수율 및 배양 조건에 따라 1~500g/ℓ, 바람직하게는 40~300g/ℓ의 범위이다.
본 발명의 배양은 호기적 조건하에, 예를 들면 통기 교반 또는 왕복 진탕방법에 의해 수행될 수도 있다. 배양 조건은 통상 20~40℃의 온도, pH 7~11 및 1~6일로 조정된다.
상기 배지로부터 목적하는 12-케토-콜산의 수득방법은 다음과 같다:먼저, 배양 배지중의 세균 및 불필요한 성분들을 여과, 원심분리등에 의해 제거하고, 수득된 여액 또는 상층액에 염산 또는 황산을 첨가하여 여액 또는 상층액을 산성화한다. 이 조작에 의해 12-케토-콜산이 고 수율로 침전된다. 이어서, 침전물을 여과하고, 재결정후, 고 순도의 12-케토-콜산이 수득된다.
본 발명에 따라 수득된 12-케토-콜산은 월프-키시너(Wolff-Kishner) 환원에 의해 담석 용해제로서 유용한 케노데옥시콜산으로 쉽게 전환될 수도 있다.
본 발명은 이하 실시예를 참고로 하여 더욱 상세히 설명되지만, 실시예가 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
각 실시예에서, 생성물은 다음과 같은 조건하에서 얇은 막 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인뒨다:
(1) 얇은 막 크로마토그래피
담체:Kieselgel 60(0.25㎜ 두께, Merk),
전개 용액:벤젠/이소프로판올/아세트산(40/10/1 부피비).
발색시험:포스포몰리브딘산-황산 시약(20ml의 메탄올에 포스포몰리브딘산 1g을 용해하고, 여기에 진한 황산 1ml를 첨가함)을 분무하고, 담즙산 점부분이 진한 청색으로 변할 때까지 가열.
(2) 고성능 액체 크로마토그래피
컬럼:INERTOSIL ODS 컬럼(컬럼 크기 4.6ψ×250㎜, GL science)
이동상:메탄올/정제수/인산(70/30/0.02M 중량비)
유속:1.0ml/분
검출:RI
[실시예 1]
하기 방법에 따라서 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124(FERM 3394)를 배양한다:
글루코오스 10g, 펩톤 5g, 효모 추출물 5g, 인산일수소 칼륨 1g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.2g을 정제수 500ml에 용해시키고, 별도로 콜산 50g, 수산화나트륨 5g 및 탄산나트륨 10g을 정제수 500g에 용해시킨 다음, 2가지 용액을 121℃의 온도에서 15분동안 살균한다. 냉각후에, 두가지 용액을 혼합하고 혼합물을 배양 배지로 사용한다(pH 10).
콜산 및 수산화나트륨이 제외된 이외에는 상기와 동일한 조성을 갖는 배양 배지 20ml를 함유하는 시험관내에서 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124(FERM 3394)를 30℃에서 20시간 동안 진탕 배양하여 균체 용액을 제조한다.
상기 배양 배지 20ml를 시험관(30ψ×190㎜)에 넣고, 상기 균체 용액 0.1ml를 여기에 무균적으로 접종하고, 균을 30℃에서 3일간 진탕 배양한다.
배양후에, 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 상기 분리 절차에 의해 형성된 상층액에 묽은 황산을 첨가하여 상층액을 산성화함으로써, 12-케토-콜산 및 비전환 콜산을 침전시킨다. 이어서, 생성된 침전물을 수집하고, 건조시킨 후, 백색 분말 0.999g을 수득한다. 상기 분말 일부를 취하여, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 생성물중의 콜산과 12-케토-콜산의 비율을 분석한 결과, 콜산은 1.7%, 12-케토-콜산은 98.3%이다(회수율:99.9%). 혼합물을 메탄올 용액중에서 재결정하여 순수한 12-케토-콜산을 수득한다.
[실시예 2]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336(FERM 3397)로 대체한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 절차를 수행한다. 생성물 비율은 콜산 1.8%, 12-케토-콜산 98.2%(회수율:99.9%)이다.
[실시예 3]
배양 배지(pH 10)에서 글루코오스를 제외하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 절차를 수행한다. 생성물 비율은 콜산 1.9%, 12-케토-콜산 98.1%이다.
[실시예 4]
배양 배지(pH 10)에서 글루코오스를 제외하는 것 이외에는 실시예 2와 동일한 절차를 수행한다. 생성물 비율은 콜산 0%, 12-케토-콜산 100%이다.
[실시예 5]
10g의 대두 단백질(ESUSAN-MEAT; 상품명; AJINOMOTO Inc.), 인산일수소칼륨 1g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.2g을 정제수 500ml에 용해시키고, 콜산 50g, 수산화나트륨 5g 및 탄산나트륨 2g을 정제수 500ml에 용해시킨 다음, 2가지 용액을 121℃의 온도에서 15분간 살균한다. 냉각후에, 2가지 용액을 혼합하고, 혼합물을 배양 배지(pH 10.2)로 사용한다.
이후, 실시예 1에서와 동일한 절차를 반복하여 12-케토-콜산을 수득한다. 생성물의 비율은 콜산 0.5%, 12-케토-콜산 99.5%이다.
[실시예 6]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 5에서와 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 1.2%, 12-케토-콜산 98.8%이다.
[실시예 7]
배지에서 인산일수소칼륨 및 황산마그네슘·7 수화물을 제외하고 탄산나트륨의 양을 3g으로 바꾼 배지(pH 10.3)를 사용하는 것 이외에는 실시예 5에서와 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비는 콜산 0%, 12-케토-콜산 100%이다.
[실시예 8]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 바꾸는 것 이외에는 실시예 7과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.7%, 12-케토-콜산 99.3%이다.
[실시예 9]
대두 단백질(ESUSAN MEAT) 10g, 효모 추출물 1g, 인산 일수소칼륨 1g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.2g을 정제수 500ml에 용해시키고, 콜산 50g, 수산화나트륨 5g 및 탄산나트륨 4g을 정제수 500ml에 용해시킨 다음, 2가지 용액을 121℃의 온도에서 15분간 살균시킨다. 냉각후에, 두가지 용액을 혼합하고, 혼합물을 배양 배지(pH 10.2)로 사용한다. 이어서, 균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 5의 절차를 반복한다. 생성물의 비율은 콜산 0.1%, 12-케토-콜산 99.9%이다.
[실시예 10]
대두 단백질(ESUSAN-MEAT)을 배지에서 제외하고, 그 대신에 옥수수 침지액 20g을 배지에 첨가하고, 탄산나트륨의 양을 12g으로 바꾼 배지(pH 9.8)를 사용하는 것 이외에는, 실시예 9에서와 동일한 절차를 반복한다. 생성물의 비율은 콜산 0.1%, 12-케토-콜산 99.9%이다.
[실시예 11]
대두 단백질(ESUSAN-MEAT)을 배양 배지에서 제외하고, 그 대신에 10g의 대두 단백질(AJIPRON E3; 상품명; AJINOMOTO Inc.)을 첨가하고, 탄산나트륨의 양을 2g으로 바꾼 배지(pH 10.0)를 사용하고 배양 시간을 2일로 단축시킨 것 이외에는, 실시예 5와 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.2%, 12-케토-콜산 99.8%이다.
[실시예 12]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하고 배양 시간을 3일로 연장하는 것 이외에는 실시예 11과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.4%, 12-케토-콜산 99.6%이다.
[실시예 13]
효모 추출물 5g, 인산 일수소칼륨 1g 및 황산 마그네슘 7 수화물 0.2g을 정제수 500ml에 용해시키고, 콜산 50g, 수산화나트륨 5g 및 탄산나트륨 4g을 정제수 500ml에 용해시킨 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분간 살균한다. 냉각후에, 2가지 용액을 혼합하고 혼합물을 배양 배지(pH 9.7)로 사용한다. 이후, 실시예 1과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.4%, 12-케토-콜산 99.6%이다.
[실시예 14]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 13과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.1%, 12-케토-콜산 99.9%이다.
[실시예 15]
배양 배지에서 효모 추출물을 제외하고 그 대신에 5g의 대두 펩타이드(D-4; 상품명; FUJISEIYU Inc.)를 배지(pH 9.8)에 첨가하는 것 이외에는 실시예 14와 동일한 절차를 수행한다. 생성물 비율은 콜산 0.8%, 12-케토-콜산 99.2%이다.
[실시예 16]
효모 추출물을 배양 배지에서 제외하고, 그 대신에 5g에 대두 펩타이드(D-2; 상품명; FUJISEIYU Inc.)를 첨가하며 탄산나트륨의 양을 2g으로 바꾼 배지(배지의 pH:9.2)를 사용하는 것 이외에는, 실시예 13과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.1%, 12-케토-콜산 99.9%이다.
[실시예 17]
글루코오스 10g, 펩톤 5g, 효모추출물 5g, 인산일수소칼륨 1g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.2g을 정제수 500ml에 용해시킨다. 별도로 콜산 100g, 수산화나트륨 10g 및 탄산나트륨 10g을 정제수 500g에 용해시킨다. 이어서, 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분간 살균한다. 냉각후에, 두가지 용액을 혼합하고 혼합물을 배양 배지(pH 10)로 사용한다.
상기 조성의 배양 배지 20ml를 함유하는 시험관내에서 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124를 30℃의 온도에서 24시간 동안 진탕 배양하여, 균체 용액을 제조한다. 상기 배양 배지 20ml를 시험관(30ψ×190㎜)에 넣고, 상기 균체 용액 0.2ml를 여기에 무균적으로 접종하고, 시험관내 균체를 30℃에서 4일간 진탕 배양한다.
이후 실시예 1과 동일한 절차를 수행하여 12-케토-콜산을 수득한다. 생성물의 비율은 콜산 3.3%, 12-케토-콜산 96.7%이다.
[실시예 18]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 17과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 2.7%, 12-케토-콜산 97.3%이다.
[실시예 19]
글루코오스 10g, 펩톤 5g, 효모 추출물 5g, 인산일수소칼륨 1g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.2g을 정제수 500ml에 용해시키고, 콜산 50g, 수산화나트륨 5g 및 탄산나트륨 10g을 정제수 500g에 용해시킨 다음, 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분동안 살균한다. 냉각후에, 2가지 용액을 혼합하고, 혼합물을 배지(pH 10)로 사용한다.
상기 배양 배지 20ml를 함유하는 시험관내에서 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124를 30℃의 온도에서 24시간 동안 진탕 배양하여, 균체 용액을 제조한다. 상기 배양 배지 20ml를 시험관(30ψ×190㎜)에 넣고, 상기 균체 용액 0.2ml를 여기에 무균적으로 접종하여, 시험관내의 균을 30℃에서 2일간 진탕 배양한다. 이후 실시예 1에서와 동일한 절차를 수행하여 12-케토-콜산을 수득한다. 생성물의 비율은 콜산 0.7%, 12-케토-콜산 99.3%이다.
[실시예 20]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 19과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.8%, 12-케토-콜산 99.2%이다.
[실시예 21]
글루코오스 10g, 펩톤 5g, 효모 추출물 5g, 인산일수소칼륨 1g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.2g을 정제수 500ml에 용해시킨다. 콜산 150g, 수산화나트륨 15g 및 탄산나트륨 10g을 정제수 500g에 용해시킨다. 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분동안 살균한다. 냉각후에 용액을 혼합하고, 혼합물을 배양 배지(pH 10)로 사용한다.
20ml의 상기 배양 배지를 함유하는 시험관내에서 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124를 30℃의 온도에서 24시간 동안 진탕 배양하여, 균체 용액을 제조한다. 상기 배양 배지 20ml를 시험관(30ψ×190㎜)에 넣고, 상기 균체 용액 0.2ml를 무균적으로 접종하고, 시험관내의 균을 30℃에서 6일간 진탕 배양한다. 이후 실시예 1과 동일한 절차를 수행하여 12-케토-콜산을 수득한다. 생성물의 비율은 콜산 17.3% 및 12-케토-콜산 82.7%이다.
[실시예 22]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 21과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 15.2%, 12-케토-콜산 84.8%이다.
[실시예 23]
글루코오스 20g, 펩톤 10g, 효모 추출물 10g, 인산일수소칼륨 2g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.4g을 정제수 1000ml에 용해시킨다. 콜산 100g, 수산화나트륨 10g 및 탄산나트륨 20g을 정제수 1000g에 용해시킨다. 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분동안 살균한다. 냉각후에 용액을 탁상형 통 발효기 장치(51 크기)에서 혼합하고, 혼합물을 배양 배지(pH 10)로 사용한다.
콜산 및 수산화나트륨이 제외된 것 이외에는 상기 조성과 동일한 조성의 배양 배지 20ml를 함유하는 시험관내에서 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124를 30℃의 온도에서 24시간 동안 진탕 배양하여, 균체 용액을 제조한다. 상기 배양 배지 20ml를 시험관(30ψ×190㎜)에 넣고, 상기 균체 용액 40ml를 여기서 무균적으로 접종한 다음, 통 발효기내의 균을 21/분의 통기 속도하에 30℃에서 3일간 교반(300rpm) 배양한다.
상기 배양후에, 원심 분리에 의해 균체를 제거하고, 상기 원심분리에 의해 형성된 상층액에 묽은 황산을 첨가함으로써 pH를 2.5로 조정하고, 12-케토-콜산 및 비전환 콜산을 침전시킨다. 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 결정을 수득하고 50℃의 온도에서 건조시킨 후 99.2g의 백색 분말을 수득한다. 특징 분석을 위해 상기 분말의 일부를 취하고, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 생성물내의 콜산과 12-케토-콜산의 비를 분석한다. 그 결과는 콜산 1.1% 및 12-케토-콜산 98.9%(회수율:99.2%)이다.
[실시예 24]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 23과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.4%, 12-케토-콜산 99.6%(회수율:98.9%)이다.
[실시예 25]
20g의 대두 단백질(ESUSAN-MEAT)을 정제수 1000ml에 용해시키고, 콜산 100g, 수산화나트륨 10g 및 탄산나트륨 6g을 정제수 1000g에 용해시키고, 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분간 살균한다. 냉각후에, 용액을 탁상형 통 발효기 장치(51 크기) 내에서 혼합하고 혼합물을 배양 배지(pH 10.4)로 사용한다.
콜산 및 수산화나트륨을 제외한 것 이외에는 상기 조성과 동일한 조성의 배양 배지 20ml를 함유하는 시험관내에서, 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336을 30℃의 온도에서 24시간 동안 진탕 배양하여, 균체 용액을 제조한다. 상기 배양 배지 20ml를 시험관(30ψ×190㎜)에 넣고, 상기 균체 용액 40ml를 여기서 무균적으로 접종하고, 시험관내의 균을 21/분의 통기 속도하에 30℃에서 3일 동안 교반(300rpm) 배양한다. 이 공정도중에 미량의 발포방지제(EINOL; 상품명; BIOTT Co., LTD.)를 첨가한다. 이후, 실시예 23과 동일한 전차를 수행하고 12-케토-콜산을 수득한다. 생성물의 비율은 콜산 0.7%, 12-케토-콜산 99.3%(회수율:99.2%)이다.
[실시예 26]
20g의 대두 단백질(AJIPRON E3), 인산일수소칼륨 2g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.4g을 정제수 1000ml에 용해시키고, 콜산 100g, 수산화나트륨 10g 및 탄산나트륨 5g을 정제수 1000ml에 용해시킨 다음, 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분간 살균한다. 냉각후에, 두가지 용액을 탁상형 통 발효기 장치(51 크기)에서 혼합하고, 혼합물을 배양 배지(pH 10.5)로 사용한다. 이후, 배양 시간을 2일로 하는 것 이외에는 실시예 23의 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.4%, 12-케토-콜산 99.6%(회수율:99.8%)이다.
[실시예 27]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하고 배양 시간은 3일로 하고, 배양중에 미량의 발포 방지제(EINOL)를 첨가하는 것 이외에는 실시예 26의 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.4%, 12-케토-콜산 99.6%(회수율:99.2%)이다.
[실시예 28]
대두 단백질(AJIPRON E3)10g, 효모추출물 1g, 인산일수소칼륨 2g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.4g을 정제수 1000ml에 용해시키고, 콜산 100g, 수산화나트륨 10g 및 탄산나트륨 6g을 정제수 1000ml에 용해시킨 다음, 두가지 용액을 121℃의 온도에서 15분간 살균한다. 냉각후에, 두가지 용액을 탁상형 통 발효기 장치(51 크기)에서 혼합하고, 혼합물을 배양 배지(pH 10.7)로 사용한다. 이후, 실시예 26과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.6%, 12-케토-콜산 99.4%(회수율:98.9%)이다.
[실시예 29]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하고 배양 시간은 3일로 하고, 배양도중에 미량의 발포 방지제(EINOL)를 첨가하는 것 이외에는 실시예 28과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0.6%, 12-케토-콜산 99.4%(회수율:99.4%)이다.
[실시예 30]
대두 단백질(AJIPRON E3) 10g, 효모추출물 1g, 인산일수소칼륨 2g 및 황산마그네슘·7 수화물 0.4g을 정제수 1000ml에 용해시키고, 콜산 100g, 수산화나트륨 10g 및 탄산나트륨 5g을 정제수 1000ml에 용해시키고, 살균 처리를 행하지 않은채로 두가지 용액을 탁상형 통 발효기 장치(51 크기) 내에서 혼합하여 혼합물을 배양 배지(pH 10.4)로 사용한다.
상기 배양 배지 20ml를 함유하는 시험관내에서 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124를 30℃의 온도에서 20시간 동안 진탕 배양하여, 균체 용액을 제조한다. 상기 균체 용액 40ml를 여기에 무균적으로 접종하고, 통 발효기내의 균을 21/분의 통기속도하에 30℃에서 3일간 교반(300rpm) 배양한다. 이후, 실시예 23과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 0%, 12-케토-콜산 100%(회수율:99.1%)이다.
[실시예 31]
균주를 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336으로 대체하는 것 이외에는 실시예 30과 동일한 절차를 수행한다. 생성물의 비율은 콜산 1.5%, 12-케토-콜산 98.5%(회수율:98.8%)이다.

Claims (4)

  1. 바실러스속에 속하고 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 생산능을 갖는 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124(수탁번호 FERM BP-3394).
  2. 바실러스속에 속하고 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 생산능을 갖는 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336(수탁번호 FERM BP-3397).
  3. 바실러스속에 속하고 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 생산능을 갖는 미생물 바실러스 sp. TTUR 2-M4-124(FERM BP-3394) 또는 바실러스 sp. TTUR 2-M4-336(FERM BP-3397)을 3α, 7α, 12α-트리히드록시-5β-콜란산 함유 영양 배지에서 배양하고; 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산을 배양 배지중에 생성시킨 다음; 담즙산을 수집함을 특징으로 하는 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 영양 배지의 pH가 7~11임을 특징으로 하는 3α, 7α-디히드록시-12-케토-5β-콜란산의 제조방법.
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