JPS59120098A - １２−ケト−３α，７α−ジヒドロキシコラン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコール酸（正しくは３α、７α、１２α−トリ
ヒドロキシ−５β−コラン酸）から胆石／８解剤として
或いは利胆剤ウルツチオキンコール酸（ＵＤＣ）の合成
原料として有用なケノデオキシコール酸（ＣＤ　Ｃ）の
製造中間体である１２−ケ１〜−３α、７α−ジヒドロ
キシ−５β−コラン酸（以下、本明細書において１２−
ケトコール酸又は１２−ケト体と略称することがある）
を微生物を用いで製造する方法に関する。

従来、コール酸を原料としてＣＤＣを合成する方法とし
て、コール酸の１２位のヒドロキシル基を脱ＯＨするた
めに、コール酸を選択的に酸化して１２〜ケト体とした
後還元する方法やメシル化した後脱メシルし水添する方
法なとが種々知られている。しかしながら、これらの方
法は当然の半生ら各反応段階において反応性や選択性の
問題かあり、必ずしも満足出来るものではなかった。か
かる現状から、近年、微生物学的方法を利用してコール
酸から１２−ケト体を製造する方法か提唱されている（
例えは、特開昭５６−２９９９８４公報参照）。

本発明者等もコール酸からその１２−ケト体を微生物を
用いて製造する方法について鋭意研究を進めた結果、ミ
クロコツカス属に属する微生物か１２−ケト体生産能を
有することを見出し本発明をするに至った。

即ち、本発明に従えは、ミクロコ・ノカス属に屈する１
２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシコラン酸生産能を
有する微生物をコール酸を含む栄養培地で培養して培養
物中に１２−ケト−３α、７α−シヒｌ−ロキシコラン
酸を生成せしめ、これを採取することから成る１２−ゲ
トー３α、７α−ジヒドロキシコラン酸の製造法が提供
される。

本発明者等は東京都大田区多摩川の土壌よりコール酸を
含む培地で１２−ケト体を生産する能力を有する菌を分
離することに成功し、この菌株をミクロコツカス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　）　Ｓ　Ｄ　−１０１と命名し、
昭和５７年１２月１７日工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託（敬工研菌寄第６８４１号）した。

土壌中よりの菌の分離は次の方法によった。

土壌を１％のコール酸ナトリウムを含む肉汁液体培地に
少量懸濁し、３５℃で４８時間集積培養を行ない、得ら
れた培養液の１白金耳量を１％のコール酸ナトリウムを
含む肉汁寒天平板培地に画線培養し、菌株を純粋分離し
た。これらの菌株を各々１％のコール酸ナトリウムを含
む肉汁液体培地で８〜７２時間培養し、その培養液中の
１２−ケト体の定量を行ない、１２−ケト体の変換能の
高い菌株を得た。

水弟は以下に述べる菌学的性質を有し、ノ＼−シェイス
・マニュアル・オフ・デイタミネイテイブ・ハタテリオ
ロツー第７版及び第８版によりミクロコツカス属に属す
る細菌であると同定された。

更にその他の生理学的性質により水弟はミクロコノカス
ルテアス及びミクロコソカスウアリアンスの額縁菌であ
ると考えられた。ミクロコツ３カス５Ｄ−１０１、ミク
ロコノカスルテアスＩＡＭ１０５６及びミクロコソカス
ウアリアンスＩＡＭ１０９９の菌学的性質を対比して列
挙すると次表の通りである。しかしなから、上記公知菌
株と比較してクエン酸、硝酸及びアンモニアの利用性、
ＯＦテスト、糖類の酸化性並びにコール酸の資化性の点
で相違するので新菌株であると断定した。

クラム染色：陽　性 形　　態二球菌 大　き　さ二直径０．８μｍ内外 多形性：なし 運動性：なし 鞭　　毛、な　し 胞　　子：な　し 集合形態　：２個〜３０（１１ｉ１か集合して存在。

２、培養所見 肉汁寒天平板＝３日間の培養で３１１ｍ径程のコロニー
。ａ黄色円形 でわずかに盛り上がる。

金縁。光沢あり。

肉汁寒天斜面・黄色。流れない。

肉汁液体　　：白眉。黄色の沈渣。

肉汁セラチン穿刺：セラチンを液化。

ＢＣＰミルク：アルカリ性。ミルクは 変化なし。

３、生理学的性質 も青酸塩の還元：＋ 脱室反応　　ニー ＭＲテスト　ニー ＶＰテスト　ニー インドールの生成ニー 硫化水素の生成（クリクラ−培地）ニーデンプンの加水
分解、− クエン酸の利用（コーザー培地）：＋ 〃　　（クリステンセン培地）：→− 硝酸（Ｎｏ、）の利用：＋ アンモニア（ＮＨ４）の利用：＋ 色素の生成ニー ウレアーゼニー オキシクーゼ、− カタラーセ：＋ 生育の範囲（ｐＨ）　　　：　６〜１２（温度）＝１０
°Ｃ〜３８°Ｃ 酸素に対する態度：好気的 ＯＦテスト：０ ノボヒオシン感受性、＋ リソザイム感受性：＋ 塩化ナトリウム存在下 生　　育（５％）：十 （１０％）ニー （１５％）ニー グリセリン　　　　−−十 し−アラヒノース　　−　　　−− Ｄ−キンロース　　　−　　　−− リボース　　　　　　−　　　−＋ Ｄ−クルコース　　　±　　　−＋ Ｄ−マンノース　　　−−± Ｄ−フラクトース　　ニー十 〇−カラクトース　　±　　　−十 マルトース　　　　　−−＋ ンユクロース　　　　−−± ラクトース　　　　　−−± トレハロース　　　　−−−− セロヒオース　　　　−−十 り−ソルヒトール　　−　　　　　　　　±Ｄ−マニト
ール　　　−−− 糖　　　類　　　　　　　酸　　　カ　　ス　資化能イ
ノシトール　　　　−−− ラフィノース　　　　−−− スターチ　　　　　　−−＋ コール酸　　　　　　　　　　　　　　　→−メチルセ
ルロース　　　　　　　　　　−■、ミクロコツカス・
ルテアスＩＡＭ１０５６の菌学的性質 １、顕微鏡（全電顕）所見 クラム染色：陽　性 形　　態二球菌 大　き　さ：直径Ｏ，Ｓμｍ内外 多　形４）１１．：な　し 運動性：な　し 鞭　　毛：な　し 胞　　子：な　し 集合形態　：単一なものは少ない。双連。

四速か多い。多数の集合も あり。鎖状はなし。

２、培養所見 肉汁寒天平板・４日間で１部、１週間で３鮪のコロニー
。淡黄色 で盛り上がる。光沢あり。

円形で金縁。

肉汁寒天斜面：黄色。

肉汁液体　　：うすく白濁。白色の沈渣肉汁ゼラチン穿
刺：孔にそって糸状に生育、表面でも生育、 セラチンを液化せず。

ＢＣＰミルり；アルカリ性。ミルりは 変化なし。

３、生理学的性質 硝酸塩の還元：± 脱室反応　　ニー ＭＲテスト　ニー ＶＰテスト　ニー インドールの生成ニー 硫化水素の生成（クリグラ−培地）：−テンブンの加水
分解ニー クエン酸の利用（コーサー培地）ニー クエン酸の利用：± （クリステンセン培地） 硝酸（ＮＯ，３＞の利用ニー アンモニア（ＮＨ４）の利用ニー 色素の生成ニー ウレアーゼ：＋ オキシダーゼ：− カタラーセ：＋ 生育の範囲（ｐｔｌ）　　　：　７〜９．５（温度）：
１０°Ｃ〜４０°Ｃ 酸素に対する態度：好気的 ＯＦテストニー コール酸の資化能ニー グリセリン　　　　−− Ｌ−アラヒノース　　−　　　− Ｄ−キシロース　　　−− リボース　　　　　　＋　　　− Ｄ−グルコース　　　−− 糖類なと　　　改−仮　ダニ ■〕−マンノース　　　−− Ｄ−フラクト−ス　　−− Ｉ〕−ガラク１−−ス　　−− マ月ノトース　　　　　　−− ７ユクロース　　　　−− ラクトース　　　　　−　　　− １−レバロース　　　　−− セロビオース　　　　−　　　− Ｄ−ソルヒ１−−ル　　−− Ｄ−マユ１−−ル　　　−　　　− イノシトール　　　　−− ラフィノース　　　　−　　　− スターチ　　　　　　−　　　− グラム染色：陽　性 形　　態：球菌 大　き　さ：直径１μｍ内外 多形性・なし 運動性：なし 鞭　　毛、な　し 胞　　子：な　し 集合形態　：単一あるいは双連、四速、数十個の集合。

鎖状はなし。

２、培養所見 肉汁寒天平板：４８日間で２ＩＩ１１程のコロニー。濃
黄色。盛り上が る。円形で金縁。光沢あ り湿潤。

肉汁寒天斜面：黄色。

肉汁液体　　：白濁。黄色の沈渣 肉汁ゼラチン穿刺：糸状に生育、セラチンを液化、表面
での 生育良好。

ＢＣＰミルク：アルカリ性。ミルクは 変化なし。

３、生理学的性質 硝酸塩の還元：± 脱室反応　　ニー ＭＲテストニー ＶＰテスト　、− インド−ルの生成ニー 硫化水素の生成：　（クリグラ−培地）ニーデンプンの
加水分解ニー クエン酸の利用（コーザー培地）：＋ 〃　　（クリステンセン培地）：＋ 硝酸（ＮＯ：）の利用二十 アンモニア（Ｎ　Ｈ４）の利用・十 色素の生成：− ウレアーセ：− オキシターセ：− カタラーセ・＋ 生育の範囲（ｐＨ）　　　：　６〜１゜（／ｌ！２１度
）：１０°Ｃ〜４０℃ 酸素に対する！ぷ度：好気的 ＯＦテスト、Ｏ コール酸の資化能ニー 以下余白 ４、糖類などの酸化とガス発生 グリセリン　　　　− Ｉ−−アラヒノース　　−− Ｄ−キンロース　　　− リボース　　　　　　→−− Ｄ−グルコース　　　十　　　− Ｄ−マンノース　　　− Ｄ〜フラクトース　　→−− Ｄ−ガラク１−−ス　　十　　　− マルトース　　　　　十　　　− シュクロース　　　　− ラクトース　　　　　−− トレハロース　　　　− セロビオース　　　　− Ｄ−ソルヒトール　　−− Ｄ−マニトール　　　±　　　− イノシトール　　　　− ラフィノース　　　　− スターチ　　　　　　− 本発明方法Ｑこ従えは、ミクロコ・７カス属に属する１
２−ケ１−−３α、７α−ジヒドロキシコラン酸生産能
を有する微生物をコール酸を含む栄養培地で培養するこ
とにより１２−ケト−３α、７　ｒ、ｖ−ジヒドロキシ
コラン酸を生成せしめる。栄養培地中のコール酸濃度に
は特に限定ばないが、目的１２−ゲ］・体の収量、培養
条件及び経済的観点から一般には５〜５００ｇ／ｆｆ、
好ましくは４ｏ〜３００ｇ／ρの濃度とする。

本発明方法において使用することのできる培地としては
、ｉｒｊ記微η二物が培養乙こより増殖し得るものであ
れは仔Ｑのものでよく、例えば、炭素源としてり、１１
、コール酸塩、リポース、クルコース、フラクｌ−−ス
、ンユクロース、酢酸、エチルアルコール、グリセリン
なと窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス
、コーンステイープリ力−等の有機窒素、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸すｌ−リウム等の無機窒
素が用いられる。

また、このほかにリン酸２水素カリウム、リン酸水素２
カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンカンなとの無機塩か添
加される。

本発明方法におりる培養ば好気的条件下に、例えば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。培
養条件は、特に限定はないが、一般的に言えは、温度２
５〜３８°ｃ、ｐＨ６，０〜９．０及び８〜９６時間程
度の条件で実施する。

培養液又は培養物からの目的の１２−ケト体の採取方法
は慣用方法に従って行うことかできる。

例えば、培養液を遠心分離１し、上清を希塩酸で酸性に
した後、酢酸エチルで抽出する。溶媒を留去して生成物
を集め、メチルアルコールに熔解後、加熱還流してメチ
ルエステル化し、冷却して結晶化、再結晶化する。得ら
れたメチルエステルは常法に従って加水分解して目的物
を得ることかできる。

以下に本発明の詳細な説明するか、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことばいうまでもない
。

実施例１ 下記組成の培地を５００ｍβの三角フラスコに１、００
　ｍ　ｌ加え、１２０°Ｃで２０分間オートクレーブ中
で滅菌し、予め同−培地中で３３°Ｃて２４時間８１（
験管振盪機で前培養したミクロコツカス５Ｉ）−１０１
の培養液５ｍ６を接種し、３３°Ｃで２４時間ロータリ
ー振盪培養機で培養した。

培地組成 りＩＦｃｏｇニュートリエンドフロス　０．４％酵母エ
キス　　　　　　　　　　　　　０．１％コール酸す１
−リウム　　　　　　　　　　１．０６％純水に熔解し
ｐ＋＋を７．０に開棺 ８時間毎に培養液１０ｍｎを採取し、遠心分離（８００
０ＧｘＳ分）し、その上清をｌＮＨＣｌでそのｐＨを］
、５乙こ調整した。等容のｌ！ｉｌ：酸エチルで３回抽
山し、抽出酢酸エチル層を集め、溶剤を留去する。次い
でメタノール；水−７５：２５　　（容積比）に０．０
２　Ｍ　ＩＪン酸を添加した溶媒（以下溶媒Ａという＞
１０ｍ１を加え、残渣を熔解し、高速液体クロマトクラ
フィー用の試料とした。

高速Ｓ体りロマトグラフィー（島原製ＬＣ−３Δ、カラ
ム０ＤＳ−ＰＡＫ　　Ｆ４１１＞を用い、これに２４時
間培養した試料２０μβを注入し、溶媒Ａを１ｍρ／分
の速度で流し、屈折率検出器ＲＩＤ〜２八を用いて各ピ
ークの検出を行った。

得られたクロマトクラムは３つのピークから成っていた
。コール酸及びその誘導体の標準品について同一条件で
液体クロマトクラフィーを行った結＼果、第一のピーク
は１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキソ−５β−コラ
ン酸と一致し、また第三のピークは原料のコール酸と一
致した。第二のピークは標準品と一致しなかった。

次に標準品のピークの高さから各時間の抽出物中のコー
ル酸と生成１２−ケト−３α、７α−ノビトロキシ−５
β−コラン酸（１２ケト酸と略称）を定量した。結果は
下表に示す通りであった。

以下余白

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ミクロコツカス属に屈する１２−ケト−３α、７α
   −ジヒドロキンコラン酸生産能を有する微生物をコール
   酸を含む栄養培地で培養して培養物中に１２−ケト−３
   α、７α−ジヒドロキシコラン酸を生成せしめ、これを
   採取するごとを特徴とする１２−ケト−３α、７α−ノ
   ヒトロキンコラン酸の製造法。