JPS6016594A - 微生物によるメナキノン−６の製造法 - Google Patents
微生物によるメナキノン−６の製造法Info
- Publication number
- JPS6016594A JPS6016594A JP12262883A JP12262883A JPS6016594A JP S6016594 A JPS6016594 A JP S6016594A JP 12262883 A JP12262883 A JP 12262883A JP 12262883 A JP12262883 A JP 12262883A JP S6016594 A JPS6016594 A JP S6016594A
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- Japan
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- menaquinone
- hydroxy
- bacterium
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、微生物によるメナキノン−６の製造法に関す
るメナキノン−６はビタミンに２作用を有し血液の凝固
を促進する脂溶性ビタミンで抗出血性作用を有すること
から重要な生理活性物質である＠その製造法としては合
成法、動植物組織又は微生物菌体からの抽出法が知られ
ているが、合成法は原料の入手が困離な上コスト高であ
シ、又動植物組織からの抽出法も資源が限られ抽出操作
が煩雑なことも加わってコスト高をまぬがれない。
るメナキノン−６はビタミンに２作用を有し血液の凝固
を促進する脂溶性ビタミンで抗出血性作用を有すること
から重要な生理活性物質である＠その製造法としては合
成法、動植物組織又は微生物菌体からの抽出法が知られ
ているが、合成法は原料の入手が困離な上コスト高であ
シ、又動植物組織からの抽出法も資源が限られ抽出操作
が煩雑なことも加わってコスト高をまぬがれない。
一方、微生物菌体からの抽出法は原料菌体を工業的に大
量に生産出来るので有利であるが、一般に菌体内に蓄積
されるメナキノン−６のノｄ、が少いため、菌体内にメ
ナキノン−６を多ｆＷ抗する微生物の検索が強く望まれ
ていた。
量に生産出来るので有利であるが、一般に菌体内に蓄積
されるメナキノン−６のノｄ、が少いため、菌体内にメ
ナキノン−６を多ｆＷ抗する微生物の検索が強く望まれ
ていた。
本発明者らはかかる目的にかなう１〜生物を検索した結
果、スラブバクテリウム〃べにＪ□ＩＳ Ｌ、１−ヒド
ロキシ−２−す７トエ酸耐性を有し、メナキノン−６を
生産する能力を有する変異株を培養してメナキノン−６
を生成せしめ、これを採取することをｆｉ−徴とする微
生物によるメナキノン−６の製造法を完成するに違った
。
果、スラブバクテリウム〃べにＪ□ＩＳ Ｌ、１−ヒド
ロキシ−２−す７トエ酸耐性を有し、メナキノン−６を
生産する能力を有する変異株を培養してメナキノン−６
を生成せしめ、これを採取することをｆｉ−徴とする微
生物によるメナキノン−６の製造法を完成するに違った
。
本発明で使用される親株は７う？バクテリウム属に属す
る菌株であればいずれの隋（５！、も使用できる。例え
ば７ラポパクテリクム−ｒクアタイル点２３８−７ Ａ
Ｊ １２０４６を挙げることが出来る。本発明に於て使
用されるノナキノン−６生産菌は上記７ラデバクテリウ
ム属細菌の１−ヒドロキシ−２−す７トエ酸耐性を有す
る変異株であればいずれも使用できる。
る菌株であればいずれの隋（５！、も使用できる。例え
ば７ラポパクテリクム−ｒクアタイル点２３８−７ Ａ
Ｊ １２０４６を挙げることが出来る。本発明に於て使
用されるノナキノン−６生産菌は上記７ラデバクテリウ
ム属細菌の１−ヒドロキシ−２−す７トエ酸耐性を有す
る変異株であればいずれも使用できる。
本発明方法において使用される親株７うｄ？ ／４りチ
リウム・アクアタイルＡ２３８７ ＡＪ １２０４６Ｆ
ＥＲＭ−ｐ フ／〕？ は自然界よし新らたに分離した
菌株であるが、その分類学的特徴からパージエイズ・マ
ニュアルオグ・デタミネイテプパクテリオロジイー第８
版（１９７４）によ）フラがバクテリウム・アクアタイ
ルと同定した。
リウム・アクアタイルＡ２３８７ ＡＪ １２０４６Ｆ
ＥＲＭ−ｐ フ／〕？ は自然界よし新らたに分離した
菌株であるが、その分類学的特徴からパージエイズ・マ
ニュアルオグ・デタミネイテプパクテリオロジイー第８
版（１９７４）によ）フラがバクテリウム・アクアタイ
ルと同定した。
本発明方法において使用する１−ヒドロキシ−２−す７
ト工酸耐性変異株の銹導は通常の変異処理によル行われ
るが、その具体的方法の一例を次に示す。
ト工酸耐性変異株の銹導は通常の変異処理によル行われ
るが、その具体的方法の一例を次に示す。
ペプトン−グリセロール液体培地（イーストエキス０．
１＃／ｄｔ、グリセロール１１１７ｄｔ、ペグトン１、
５１！／ ａｔ、 Ｋ２）ＩＰＯ４０，３１１／ ｄｔ
ｓ ＮａＣ４０，２ｊ！／ｄｔ。
１＃／ｄｔ、グリセロール１１１７ｄｔ、ペグトン１、
５１！／ ａｔ、 Ｋ２）ＩＰＯ４０，３１１／ ｄｔ
ｓ ＮａＣ４０，２ｊ！／ｄｔ。
Ｍｇ５Ｏ４・７Ｈ２＋） ０．０２１／ａｔ 、 １．
１（７，０）で３０℃、２４時間生育させた７うｙｋｅ
バクテリウム・アクアタイルＡ ２３８−７ ＡＪ １
２０４６をＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグ
アニジン１００μｇハｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（
ＰＩＩ７．０）中に１０＠個／ ｍｌとなるよう懸濁し
、３０℃、３０分間振盪した。その後遠心分離で集菌後
、０．１ＭＩＪン酸緩Ｏ１ｉ液で洗浄後同緩衝液中に１
０’／ゴとなるよう懸濁した。１−ヒＦｏキシ−２−＋
７ ト：ｒ−ＥＱ（２００〜３５０ｓｌｌ／ｍｌ）を含
むペグトン−グリセロール寒天培地（上記（ゾトンーグ
リセ四−ル液体培地に寒天２１／ｄｔを添加したもの）
上に上記懸濁液０．１ ｍｌを塗布し、出現シタコロニ
ーを１−ヒドロキシ−２−す７ト工酸耐性株として採取
した。これら耐性株の中から親株に比べて明らかに高い
ノナキノン−６生産株をペグトン−グリセロール１段体
培地で培養（菌体を充分洗浄した後、１−ヒドロキシ−
２−ナフトエ酸を含んだイブトン−グリ上ロール寒天グ
レートに５ｘｌＱ’個接種し、３０℃で３日間培養し生
育度を比較した。その結果は第１表に示す通シである。
１（７，０）で３０℃、２４時間生育させた７うｙｋｅ
バクテリウム・アクアタイルＡ ２３８−７ ＡＪ １
２０４６をＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグ
アニジン１００μｇハｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（
ＰＩＩ７．０）中に１０＠個／ ｍｌとなるよう懸濁し
、３０℃、３０分間振盪した。その後遠心分離で集菌後
、０．１ＭＩＪン酸緩Ｏ１ｉ液で洗浄後同緩衝液中に１
０’／ゴとなるよう懸濁した。１−ヒＦｏキシ−２−＋
７ ト：ｒ−ＥＱ（２００〜３５０ｓｌｌ／ｍｌ）を含
むペグトン−グリセロール寒天培地（上記（ゾトンーグ
リセ四−ル液体培地に寒天２１／ｄｔを添加したもの）
上に上記懸濁液０．１ ｍｌを塗布し、出現シタコロニ
ーを１−ヒドロキシ−２−す７ト工酸耐性株として採取
した。これら耐性株の中から親株に比べて明らかに高い
ノナキノン−６生産株をペグトン−グリセロール１段体
培地で培養（菌体を充分洗浄した後、１−ヒドロキシ−
２−ナフトエ酸を含んだイブトン−グリ上ロール寒天グ
レートに５ｘｌＱ’個接種し、３０℃で３日間培養し生
育度を比較した。その結果は第１表に示す通シである。
第１表 耐性度テスト
これら微生物を培養するに当って用いられる栄養培地は
炭素源・窒素源および無機塩からなる細菌の培養に用い
られる通常の培地が用いられる。
炭素源・窒素源および無機塩からなる細菌の培養に用い
られる通常の培地が用いられる。
上記炭素源としてはグルコース、シュークロース、マル
トース、澱粉加水分解物等の糖類、酢酸、クエン酸等の
有機酸、グリセリン等のアルコールが使用でき、窒素源
としては硫酸アンモニウム、原票、硝酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、ペグトン、肉エキス等が用いられ
、無機塩類として砿、リン酸塙、マグネシウム塩、鉄塩
、その他必要に応じて微量金属塩が用いられ、更にアミ
ノ酸、核酸、ビタミン、イーストエキス、麦芽エキス醇
生育促進物質も使用される。又使用菌が栄養要求性であ
る場合にはその要求性物質を培地に添加する。
トース、澱粉加水分解物等の糖類、酢酸、クエン酸等の
有機酸、グリセリン等のアルコールが使用でき、窒素源
としては硫酸アンモニウム、原票、硝酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、ペグトン、肉エキス等が用いられ
、無機塩類として砿、リン酸塙、マグネシウム塩、鉄塩
、その他必要に応じて微量金属塩が用いられ、更にアミ
ノ酸、核酸、ビタミン、イーストエキス、麦芽エキス醇
生育促進物質も使用される。又使用菌が栄養要求性であ
る場合にはその要求性物質を培地に添加する。
更にこれら微生物の培養に肖って用いられる上記培地に
イソペンテニルアルコール、ジメチルアリルアルコール
、ゲラニオール、ファルネソールなどのアルコール頷お
よびシ牟ミｒ’ｉｔ、ｏ−サクシニル安息香Ｈ１Ｌ−チ
ロシン、）やラヒドロキシフェニルビルビン酸などを添
加することにょシ、無添加に比して菌体内のメナキノン
−６の蓄積量が増大する傾向にある。
イソペンテニルアルコール、ジメチルアリルアルコール
、ゲラニオール、ファルネソールなどのアルコール頷お
よびシ牟ミｒ’ｉｔ、ｏ−サクシニル安息香Ｈ１Ｌ−チ
ロシン、）やラヒドロキシフェニルビルビン酸などを添
加することにょシ、無添加に比して菌体内のメナキノン
−６の蓄積量が増大する傾向にある。
微生物の培養は、Ｈ５〜ｓ、 ｓ、培養温度２０−４０
℃で１〜５日間好気的に振盪又ンよ通気攪拌培養するこ
とによって行われる。メナキノン−６は微生物菌体中に
＃１とんど全て蓄積されるので、培養液を遠心分離、又
はＭｇ消して菌体を分離した後、分離菌体から抽出、単
離される。
℃で１〜５日間好気的に振盪又ンよ通気攪拌培養するこ
とによって行われる。メナキノン−６は微生物菌体中に
＃１とんど全て蓄積されるので、培養液を遠心分離、又
はＭｇ消して菌体を分離した後、分離菌体から抽出、単
離される。
菌体からメナキノン−６を単１ＩＩＩＩするには常法を
そのまま適用できる。例えば、生閃体をアセトン中に懸
濁し、室温で１０〜２０分間抽出した。この抽出物を濃
縮後、エーテルで抽出し、シリカダル薄１ψクロマトグ
ラフィーを行ないクロマトグラム上のメナキノン−６を
アセトンで抽出し結晶化したＯ 本発明のビタｒｙｘ２の同定は（−・ぐ−クロマトグラ
フ４−１ＴＬＣ，元素分析値、融点、Ｕｖ及び！Ｒスペ
クトル、マススペクトル等の結果からメナキノン−６で
あることを確認した。又、定量法としては高連液体クロ
マトグラフィー法を使用した。
そのまま適用できる。例えば、生閃体をアセトン中に懸
濁し、室温で１０〜２０分間抽出した。この抽出物を濃
縮後、エーテルで抽出し、シリカダル薄１ψクロマトグ
ラフィーを行ないクロマトグラム上のメナキノン−６を
アセトンで抽出し結晶化したＯ 本発明のビタｒｙｘ２の同定は（−・ぐ−クロマトグラ
フ４−１ＴＬＣ，元素分析値、融点、Ｕｖ及び！Ｒスペ
クトル、マススペクトル等の結果からメナキノン−６で
あることを確認した。又、定量法としては高連液体クロ
マトグラフィー法を使用した。
以下実施例にて具体的に説明する。
実施例１
グリセロール１０ ＃／ＬＳｉ？リペプトン１５ Ｅｌ
／ｌ。
／ｌ。
イースト・エギス１１１／ｌ、 Ｋ２ＨＰＯ４２ｆ／Ａ
双ｒｌｔ２クムＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２１１／ｌを
含有する培地（ｐＨ７，０）１０ｔを２０１答の小型ジ
ャーにとシ１２０℃、３０分間加熱殺菌した後、あらか
じめブイヨンスラント上で３０℃、２４時間培潰した１
−ヒドロキシ−２−す７トエＬ；’！ｉ耐性を有する７
ラデパクテリウム アクアタイル ＡＪ１２０４７を上
述の培地に接旧１し、アンモニアガスでｐＨを７．０に
コントロールしつつ、培養温度３０℃にて通気撹拌培養
を行った。対照として親株を全く同じ方法で培養した。
双ｒｌｔ２クムＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２１１／ｌを
含有する培地（ｐＨ７，０）１０ｔを２０１答の小型ジ
ャーにとシ１２０℃、３０分間加熱殺菌した後、あらか
じめブイヨンスラント上で３０℃、２４時間培潰した１
−ヒドロキシ−２−す７トエＬ；’！ｉ耐性を有する７
ラデパクテリウム アクアタイル ＡＪ１２０４７を上
述の培地に接旧１し、アンモニアガスでｐＨを７．０に
コントロールしつつ、培養温度３０℃にて通気撹拌培養
を行った。対照として親株を全く同じ方法で培養した。
７２時間の培養終了時における培すｔ液１を当シ及び乾
燥菌体１．９］ｊｌのメナキノン−６の含１．ｔを測定
した結果は第２表の如くであった。
燥菌体１．９］ｊｌのメナキノン−６の含１．ｔを測定
した結果は第２表の如くであった。
上記変異株をｊ名文して得られた培養液を遠心分離して
菌体を採取して水で洗浄後、１００℃で２時間乾燥した
。この乾燥処理菌体９０ｇ（ノナキノン−６含）９３０
６ ｍｇ ）を取シ、メタノール７００ｄを加えて６０
℃で２時間かきまぜて抽出を行った後、濾別した。抽出
残渣に更に７００Ｈのメタノールを加えて同様に抽出し
、得られた抽出液を合わせ、減圧下で４０ｍ１まで濃縮
した。この濃縮液に水１０ｍ１を加えｎ−ヘキサン１０
０Ｍ１に転溶し、ｎ−ヘキサン層を分別後減圧下でｎ−
ヘキサンを除去して２７０ｍ９の粗標品を得／こ。これ
を少量のアセトンに溶解し、シリカダル薄層クロマトグ
ラフィーを行ないクロマトグラム上のメナキノン−６を
アセトンで抽出し１９５ｍノの結晶を得た。
菌体を採取して水で洗浄後、１００℃で２時間乾燥した
。この乾燥処理菌体９０ｇ（ノナキノン−６含）９３０
６ ｍｇ ）を取シ、メタノール７００ｄを加えて６０
℃で２時間かきまぜて抽出を行った後、濾別した。抽出
残渣に更に７００Ｈのメタノールを加えて同様に抽出し
、得られた抽出液を合わせ、減圧下で４０ｍ１まで濃縮
した。この濃縮液に水１０ｍ１を加えｎ−ヘキサン１０
０Ｍ１に転溶し、ｎ−ヘキサン層を分別後減圧下でｎ−
ヘキサンを除去して２７０ｍ９の粗標品を得／こ。これ
を少量のアセトンに溶解し、シリカダル薄層クロマトグ
ラフィーを行ないクロマトグラム上のメナキノン−６を
アセトンで抽出し１９５ｍノの結晶を得た。
エタノールに溶解後回結晶を行って得られたｎｆＡ標品
の融点は４９〜５０℃、元素分析はＣ：８４．５％、Ｈ
：９．８％、０：５．７％（理論値Ｃ：８４．８％、Ｈ
：９．７％、Ｏ：５．５チ）であシ、そのＩＲスペクト
ル、Ｕｖスベクトル、ＮＭＲスペクトルはオーセンティ
クなメナキノン−６のものとよく一致した。
の融点は４９〜５０℃、元素分析はＣ：８４．５％、Ｈ
：９．８％、０：５．７％（理論値Ｃ：８４．８％、Ｈ
：９．７％、Ｏ：５．５チ）であシ、そのＩＲスペクト
ル、Ｕｖスベクトル、ＮＭＲスペクトルはオーセンティ
クなメナキノン−６のものとよく一致した。
第２表
実施例２
実施例１に示した培地にＬ−チロシンを４１１７を帆加
し、実施例１にボしたと同様の方法で１−ヒＰロキシナ
フトエ敗耐性を有するフラ、ＩＦ ７々クテリウム・ア
クアタイルＡＪ １２０４７を接、ｌｉｌ Ｌ 、培養
を行った。培養の０時間、２４時間、４８時間経過時に
イソペンテニルアルコールを１０”−”Ｍ添加し、７２
時間培養した。対照としてＬ−チロシン、及びイソ（ン
テニルアルコール無添加培地を用いて全く同じ方法で培
養した。培養終了後の培養液１を当シ及び菌体１１Ｄの
メナキノン−６の含量は第３表の如くであった。
し、実施例１にボしたと同様の方法で１−ヒＰロキシナ
フトエ敗耐性を有するフラ、ＩＦ ７々クテリウム・ア
クアタイルＡＪ １２０４７を接、ｌｉｌ Ｌ 、培養
を行った。培養の０時間、２４時間、４８時間経過時に
イソペンテニルアルコールを１０”−”Ｍ添加し、７２
時間培養した。対照としてＬ−チロシン、及びイソ（ン
テニルアルコール無添加培地を用いて全く同じ方法で培
養した。培養終了後の培養液１を当シ及び菌体１１Ｄの
メナキノン−６の含量は第３表の如くであった。
第 ３ 表
Claims (1)
- ７２？バクテリウム属にがし、１−ヒドロキシ−２−す
７トエ酸耐性を有し、メナキノン−６を生産する能力を
有する変異株を培養してメナキノン−６を生成せしめ、
これを採取することを特徴とする微生物によるメナヤノ
ン−６の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12262883A JPS6016594A (ja) | 1983-07-06 | 1983-07-06 | 微生物によるメナキノン−６の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12262883A JPS6016594A (ja) | 1983-07-06 | 1983-07-06 | 微生物によるメナキノン−６の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6016594A true JPS6016594A (ja) | 1985-01-28 |
Family
ID=14840669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12262883A Pending JPS6016594A (ja) | 1983-07-06 | 1983-07-06 | 微生物によるメナキノン−６の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6016594A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5235648A (en) * | 1990-10-22 | 1993-08-10 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Volume control device mounting mechanism for on-vehicle equipment |
-
1983
- 1983-07-06 JP JP12262883A patent/JPS6016594A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5235648A (en) * | 1990-10-22 | 1993-08-10 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Volume control device mounting mechanism for on-vehicle equipment |
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