JPH07123997A - ステロイド類の２５位水酸化物の生物学的製造法 - Google Patents
ステロイド類の２５位水酸化物の生物学的製造法Info
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- JPH07123997A JPH07123997A JP30850593A JP30850593A JPH07123997A JP H07123997 A JPH07123997 A JP H07123997A JP 30850593 A JP30850593 A JP 30850593A JP 30850593 A JP30850593 A JP 30850593A JP H07123997 A JPH07123997 A JP H07123997A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ステロイド類の２５位を水酸化する放線菌菌
体または培養液にステロイド類を加え２５位の水素原子
を水酸基に変換する事を特徴とする２５−ヒドロキシス
テロイド類の製造方法。 【効果】 本発明により容易に一段階で直接ステロイド
類の２５位を水酸化することが可能になり、各種の２５
−ヒドロキシステロイド類を安価に供給することが可能
となった。
体または培養液にステロイド類を加え２５位の水素原子
を水酸基に変換する事を特徴とする２５−ヒドロキシス
テロイド類の製造方法。 【効果】 本発明により容易に一段階で直接ステロイド
類の２５位を水酸化することが可能になり、各種の２５
−ヒドロキシステロイド類を安価に供給することが可能
となった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はステロイド類の２５位を
生物学的に水酸化する方法に関する。
生物学的に水酸化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ステロイド化合物は、その構造が複雑で
取り扱いにくい為適切な化学処理を施すのが困難であり
化学的にステロイド化合物の２５位を水酸化するには多
くの部位を保護し、細かい注意を払いながら煩雑な作業
を行わなければならない。
取り扱いにくい為適切な化学処理を施すのが困難であり
化学的にステロイド化合物の２５位を水酸化するには多
くの部位を保護し、細かい注意を払いながら煩雑な作業
を行わなければならない。
【０００３】一方、酵素化学的に２５位に水酸基を導入
する方法に関しては、動物臓器内の酵素を用いたビタミ
ンＤ類の２５位水酸化法（ジャーナル オブ クリニカ
ルインベスティケーション［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．］第４８巻 ２０３２〜２０３７ １９６９）や放
線菌類の菌体内酵素を用いたビタミンＤ類の２５位水酸
化方法が報告されている（特公平４−６４６７８）。
する方法に関しては、動物臓器内の酵素を用いたビタミ
ンＤ類の２５位水酸化法（ジャーナル オブ クリニカ
ルインベスティケーション［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．］第４８巻 ２０３２〜２０３７ １９６９）や放
線菌類の菌体内酵素を用いたビタミンＤ類の２５位水酸
化方法が報告されている（特公平４−６４６７８）。
【０００４】微生物を用いた方法ではビタミンＤ類の２
５位水酸化方法が報告されている（特公平４−６４６７
８）がこれらの報告はビタミンＤ類についてであって、
その閉環構造であるステロイド類についてのものではな
く、微生物を用いステロイド類の２５位を直接水酸化す
る方法に付いては未だ報告がない。
５位水酸化方法が報告されている（特公平４−６４６７
８）がこれらの報告はビタミンＤ類についてであって、
その閉環構造であるステロイド類についてのものではな
く、微生物を用いステロイド類の２５位を直接水酸化す
る方法に付いては未だ報告がない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ビタミンＤ類の毒性は
一般に高くその取扱いには細心の注意を払わねばなら
い。また、ビタミンＤ類は安定性に欠け、生成物の２５
位水酸化物は結晶性も悪く、その精製は困難である。
一般に高くその取扱いには細心の注意を払わねばなら
い。また、ビタミンＤ類は安定性に欠け、生成物の２５
位水酸化物は結晶性も悪く、その精製は困難である。
【０００６】本発明は、基質として安価で、毒性が低
く、生成物の精製も容易な、コレステロール類の２５
位、さらには側鎖を有するステロイド類の２５位を、よ
り容易な方法で水酸化する方法を提供することを目的と
する。
く、生成物の精製も容易な、コレステロール類の２５
位、さらには側鎖を有するステロイド類の２５位を、よ
り容易な方法で水酸化する方法を提供することを目的と
する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ある種の
微生物好ましくは放線菌を利用することにより側鎖を有
するステロイド類の２５位に直接水酸基を導入すること
ができることを見いだし本発明を完成した。用いる放線
菌としてはストレプトマイセス属またはアクチノミセス
属が好ましい。本発明に使用される微生物としては例え
ば本発明者らが、埼玉県春日部市の土壌から分離した放
線菌の一菌株ストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１
０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈ
Ｂ１０３）「微生物の保管受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４
３１８」があげられる。ＨＢ−１０３はステロイド構造
に関係なくステロイドの２５位の水素原子を水酸基に変
換する事ができる。
微生物好ましくは放線菌を利用することにより側鎖を有
するステロイド類の２５位に直接水酸基を導入すること
ができることを見いだし本発明を完成した。用いる放線
菌としてはストレプトマイセス属またはアクチノミセス
属が好ましい。本発明に使用される微生物としては例え
ば本発明者らが、埼玉県春日部市の土壌から分離した放
線菌の一菌株ストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１
０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈ
Ｂ１０３）「微生物の保管受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４
３１８」があげられる。ＨＢ−１０３はステロイド構造
に関係なくステロイドの２５位の水素原子を水酸基に変
換する事ができる。
【０００８】すなわち本発明は、ステロイド類を直接水
酸化する能力を有する放線菌の菌体叉は培養液中に側鎖
を有するステロイドを加え直接水酸化する事を特徴とす
る２５−ヒドロキシステロイド類の製造方法である。
酸化する能力を有する放線菌の菌体叉は培養液中に側鎖
を有するステロイドを加え直接水酸化する事を特徴とす
る２５−ヒドロキシステロイド類の製造方法である。
【０００９】本発明は、側鎖を有するステロイド類の２
５位を直接水酸化する方法で基質となるステロイド類は
２５位が炭素原子であれば、他の炭素原子はいずれの元
素でもよい。たとえば、２２位の炭素原子が酸素原子、
イオウ原子、窒素原子などでも良い。また２５位以外に
置換基として、低級アルキル基、環状炭化水素基、トリ
アゾリンなどのヘテロ環基、保護されていてもよい、水
酸基、アミノ基、ヒドロキシ低級アルキル基、ヒドロキ
シ低級アルコキシ基、アシル基などを有していてもよ
い。またステロイド骨格中に１以上の不飽和結合を有し
ていてもよく、さらにその不飽和結合が酸化されたエポ
キシ環を有していてもよい。
５位を直接水酸化する方法で基質となるステロイド類は
２５位が炭素原子であれば、他の炭素原子はいずれの元
素でもよい。たとえば、２２位の炭素原子が酸素原子、
イオウ原子、窒素原子などでも良い。また２５位以外に
置換基として、低級アルキル基、環状炭化水素基、トリ
アゾリンなどのヘテロ環基、保護されていてもよい、水
酸基、アミノ基、ヒドロキシ低級アルキル基、ヒドロキ
シ低級アルコキシ基、アシル基などを有していてもよ
い。またステロイド骨格中に１以上の不飽和結合を有し
ていてもよく、さらにその不飽和結合が酸化されたエポ
キシ環を有していてもよい。
【００１０】好ましくは一般式（Ｉ）
【化１】 （式中、Ｒ１は水素原子または保護されていてもよい水
酸基を、Ｒ２は水素原子または水酸基が保護されていて
もよいヒドロキシ低級アルコキシ基を示すか、またはＲ
１とＲ２で二重結合を形成するかエポキシ環を形成する
ことを示す。Ｒ３は水素原子または保護基を示し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ水素原子を示す
か、Ｒ４とＲ５、Ｒ６とＲ７の一方もしくは両方が二重
結合を形成しているか、Ｒ５とＲ６で二重結合を形成
し、Ｒ４とＲ７で共役二重結合を保護し得るジエノファ
イルと結合していることを示す。ＸはＣＨ２または酸素
原子を示す。）で示される化合物である。
酸基を、Ｒ２は水素原子または水酸基が保護されていて
もよいヒドロキシ低級アルコキシ基を示すか、またはＲ
１とＲ２で二重結合を形成するかエポキシ環を形成する
ことを示す。Ｒ３は水素原子または保護基を示し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ水素原子を示す
か、Ｒ４とＲ５、Ｒ６とＲ７の一方もしくは両方が二重
結合を形成しているか、Ｒ５とＲ６で二重結合を形成
し、Ｒ４とＲ７で共役二重結合を保護し得るジエノファ
イルと結合していることを示す。ＸはＣＨ２または酸素
原子を示す。）で示される化合物である。
【００１１】式中の保護基としては、例えば、アセチル
基、ピバロイル基、メトキシカルボニル基、ベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−トルエンスルホニル基などのア
シル基、メチル基、メトキシメチル基などの置換されて
いてもよいアルキル基、トリメチルシリル基、トリエチ
ルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基などの置換シ
リル基などがあげられ、好ましくはトリメチルシリル
基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基
などがあげられる。
基、ピバロイル基、メトキシカルボニル基、ベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−トルエンスルホニル基などのア
シル基、メチル基、メトキシメチル基などの置換されて
いてもよいアルキル基、トリメチルシリル基、トリエチ
ルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基などの置換シ
リル基などがあげられ、好ましくはトリメチルシリル
基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基
などがあげられる。
【００１２】また、共役二重結合を保護し得るジエノフ
ァイルとしては、一般式（ＩＩ）
ァイルとしては、一般式（ＩＩ）
【化２】 （式中ＡおよびＢは、同一または異なる基で１〜４個の
炭素原子を有するアルコキシ基を表すか、あるいはＡと
Ｂとは一緒にフェニルイミノ基またはｏ−フェニレン基
を表す。Ｙは窒素原子またはメチン基（＝ＣＨ−）を表
す。）で示される化合物が用いられ、好ましくは、４−
フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオ
ン、マレイン酸ジエチルなどが用いられる。
炭素原子を有するアルコキシ基を表すか、あるいはＡと
Ｂとは一緒にフェニルイミノ基またはｏ−フェニレン基
を表す。Ｙは窒素原子またはメチン基（＝ＣＨ−）を表
す。）で示される化合物が用いられ、好ましくは、４−
フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオ
ン、マレイン酸ジエチルなどが用いられる。
【００１３】本発明の方法が適用できる化合物として
は、たとえばコレステロール、１α，３β−ジヒドロキ
シ−５，７−コレスタジエン、２β−（３−ヒドロキシ
プロピルオキシ）−１α，３β−ジヒドロキシ−５，７
−コレスタジエン、５α，８α−（３，５−ジオキソ−
４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６
−コレスタジエン−３β−オール、３β−ヒドロキシ−
１，５，７−コレスタトリエン、１α，２α−エポキシ
−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−
１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β
−オール、１α，２α−エポキシ−３β−ヒドロキシ−
５，７−コレスタジエン、２０（Ｓ）−（３−メチルブ
チルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β
−ジオール、２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）
−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオール等があげ
られる。
は、たとえばコレステロール、１α，３β−ジヒドロキ
シ−５，７−コレスタジエン、２β−（３−ヒドロキシ
プロピルオキシ）−１α，３β−ジヒドロキシ−５，７
−コレスタジエン、５α，８α−（３，５−ジオキソ−
４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６
−コレスタジエン−３β−オール、３β−ヒドロキシ−
１，５，７−コレスタトリエン、１α，２α−エポキシ
−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−
１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β
−オール、１α，２α−エポキシ−３β−ヒドロキシ−
５，７−コレスタジエン、２０（Ｓ）−（３−メチルブ
チルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β
−ジオール、２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）
−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオール等があげ
られる。
【００１４】本発明の方法によるとステロイド中の水酸
基の位置あるいは水酸基の数に関係なく２５位を水酸化
しさらに二重結合の位置あるいは数に関係なく２５位を
直接水酸化することができる。
基の位置あるいは水酸基の数に関係なく２５位を水酸化
しさらに二重結合の位置あるいは数に関係なく２５位を
直接水酸化することができる。
【００１５】ストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１
０３の菌学的性状を以下に示す。 菌学的性状 １）形態 ４種の寒天培地（ＩＳＰ Ｎｏ．２，３，４，５：放線
菌学会指定）上にて２７℃、２週間成育させた後観察し
た。菌糸の形状は０．５〜０．６μｍの太さで、直鎖状
であり、菌糸の分岐法は気菌糸および基底菌糸ともに分
岐は認められない。胞子の形状は空中に伸びた気菌糸が
分断し、短桿状の胞子を形成する。その後、培養が進む
につれて膨潤して球状を呈するが、球状化に順序はなく
一本の鎖状に桿状と球状が入り混じった不規則な形態を
呈する。なお胞子の表面は平滑である。
０３の菌学的性状を以下に示す。 菌学的性状 １）形態 ４種の寒天培地（ＩＳＰ Ｎｏ．２，３，４，５：放線
菌学会指定）上にて２７℃、２週間成育させた後観察し
た。菌糸の形状は０．５〜０．６μｍの太さで、直鎖状
であり、菌糸の分岐法は気菌糸および基底菌糸ともに分
岐は認められない。胞子の形状は空中に伸びた気菌糸が
分断し、短桿状の胞子を形成する。その後、培養が進む
につれて膨潤して球状を呈するが、球状化に順序はなく
一本の鎖状に桿状と球状が入り混じった不規則な形態を
呈する。なお胞子の表面は平滑である。
【００１６】２）培地上での生育状態 ＩＳＰ Ｎｏ．２，３，４，５培地で２７℃培養し２週
間観察しその結果を表１に示す。
間観察しその結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】３）生理学的性状 （１）生育温度範囲 ＩＳＰ Ｎｏ．２培地で１８〜３３℃の範囲で良好に生
育する。１７℃以下、３６℃以上の温度範囲では生育し
ない。 （２）生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別；好気性 ｂ）ゼラチンの変化 ；なし ｃ）脱脂乳の凝固 ；なし ｄ）脱脂乳のペプトン化 ；なし ｅ）スターチの加水分解 ；有り（ＩＳＰ Ｎｏ．４） ｆ）メラニン様色素の生成；なし（ＩＳＰ Ｎｏ．６，
７） ｇ）細胞壁タイプ ；ＩＡ（ＬＬ−Ａ２ｐｍ） （３）炭素源の利用 ＩＳＰ Ｎｏ．９培地による調査において下記の全ての
炭素源を利用する。 Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−キシロース、ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ−マン
ニトール、シュクロース、ラフィノース、ラムノース ただし、ラフィノース、ラムノースは炭素源無添加の場
合と同程度であった。以上の培養性状、細胞壁組成など
から放線菌に属するものと思われるが、胞子鎖の特異な
形状や温度感受性などから既知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属の菌株中に同定の候補となるものが見出せず、本
菌株をストレプトマイセス・スペイシズＨＢ−１０３
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＨＢ１
０３）と命名した。
育する。１７℃以下、３６℃以上の温度範囲では生育し
ない。 （２）生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別；好気性 ｂ）ゼラチンの変化 ；なし ｃ）脱脂乳の凝固 ；なし ｄ）脱脂乳のペプトン化 ；なし ｅ）スターチの加水分解 ；有り（ＩＳＰ Ｎｏ．４） ｆ）メラニン様色素の生成；なし（ＩＳＰ Ｎｏ．６，
７） ｇ）細胞壁タイプ ；ＩＡ（ＬＬ−Ａ２ｐｍ） （３）炭素源の利用 ＩＳＰ Ｎｏ．９培地による調査において下記の全ての
炭素源を利用する。 Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−キシロース、ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ−マン
ニトール、シュクロース、ラフィノース、ラムノース ただし、ラフィノース、ラムノースは炭素源無添加の場
合と同程度であった。以上の培養性状、細胞壁組成など
から放線菌に属するものと思われるが、胞子鎖の特異な
形状や温度感受性などから既知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属の菌株中に同定の候補となるものが見出せず、本
菌株をストレプトマイセス・スペイシズＨＢ−１０３
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＨＢ１
０３）と命名した。
【００１９】本発明の製造方法は本菌を好気的条件下で
培養し、基質を好気的条件下で反応を行なう。
培養し、基質を好気的条件下で反応を行なう。
【００２０】本発明の培養方法は主に液体培養法を用い
る。培地としては炭素源としてグルコース、ラクトー
ス、シュクロース、スターチ、グリセリンなどを単独叉
は混合して用いる。窒素源としてはきな粉、粉末酵母、
肉エキス、コーンスターチリカー、ペプトン、酵母エキ
ス、麦芽エキスなどを単独叉は混合して用いる。その他
微量成分として無機塩類、有機化合物を用いる。培養法
としては振とう培養法、通気攪拌培養法が適している。
培養温度は２５〜３７℃、培養日数は１〜８日間であ
る。
る。培地としては炭素源としてグルコース、ラクトー
ス、シュクロース、スターチ、グリセリンなどを単独叉
は混合して用いる。窒素源としてはきな粉、粉末酵母、
肉エキス、コーンスターチリカー、ペプトン、酵母エキ
ス、麦芽エキスなどを単独叉は混合して用いる。その他
微量成分として無機塩類、有機化合物を用いる。培養法
としては振とう培養法、通気攪拌培養法が適している。
培養温度は２５〜３７℃、培養日数は１〜８日間であ
る。
【００２１】本発明の２５位水酸化反応に用いる菌体は
培養液そのままか、培養液を集菌し菌体を緩衝液で洗浄
し緩衝液でけん濁するか、凍結菌体を緩衝液でけん濁し
て用いる。用いるけん濁液は生理食塩水、シュクロース
溶液、ＰＢＳ−、トリス−塩酸などの緩衝液を用い、反
応に必要な無機塩類及び有機化合物を添加して用いる。
培養液そのままか、培養液を集菌し菌体を緩衝液で洗浄
し緩衝液でけん濁するか、凍結菌体を緩衝液でけん濁し
て用いる。用いるけん濁液は生理食塩水、シュクロース
溶液、ＰＢＳ−、トリス−塩酸などの緩衝液を用い、反
応に必要な無機塩類及び有機化合物を添加して用いる。
【００２２】本発明の基質添加方法は粉末のままか、水
溶性有機溶剤に溶解するか、界面活性剤等でけん濁して
反応液に添加する。基質の添加量は反応液１ｍｌ当たり
０．１〜１０ｍｇ添加して行なう。基質添加後の反応条
件は振とう、通気攪拌の様な好気条件下で反応温度２５
〜３７℃、反応時間３０分〜９６時間行なう。
溶性有機溶剤に溶解するか、界面活性剤等でけん濁して
反応液に添加する。基質の添加量は反応液１ｍｌ当たり
０．１〜１０ｍｇ添加して行なう。基質添加後の反応条
件は振とう、通気攪拌の様な好気条件下で反応温度２５
〜３７℃、反応時間３０分〜９６時間行なう。
【００２３】反応終了後生成した２５−ヒドロキシステ
ロイド類は常法により精製することができる。たとえば
反応液を有機溶剤で抽出し脱水、濃縮しシリカゲルクロ
マトグラフィーを行い次に逆層カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィーにかけ基質に対応する２５−ヒドロ
キシステロイド類を精製する。
ロイド類は常法により精製することができる。たとえば
反応液を有機溶剤で抽出し脱水、濃縮しシリカゲルクロ
マトグラフィーを行い次に逆層カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィーにかけ基質に対応する２５−ヒドロ
キシステロイド類を精製する。
【００２４】
【発明の効果】本発明により容易に一段階で直接ステロ
イド類の２５位を水酸化することが可能になり、各種の
２５−ヒドロキシステロイド類を安価に供給することが
可能となった。
イド類の２５位を水酸化することが可能になり、各種の
２５−ヒドロキシステロイド類を安価に供給することが
可能となった。
【００２５】
【実施例】以下に実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例によりなんら制限される
ものではない。
するが、本発明はこれら実施例によりなんら制限される
ものではない。
【００２６】
【実施例１】２５−ヒドロキシコレステロールの合成 ショ糖１％、きな粉２％、乾燥ブイヨン１％（栄研
製）、炭酸カルシウム０．２％からなる培地（以下培地
Ａと略す）５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに加え、
１２０℃、１５分間加圧滅菌しこれにストレプトマイセ
ス・スペシイズＨＢ−１０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＨＢ１０３）を一白金耳接種し、
３０℃、２０５ｒｐｍで３日間振とう培養する。次に培
地Ａ５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに加え加圧滅菌
したフラスコ２０本に上記条件で培養した種母菌１ｍｌ
をそれぞれ移植し３０℃、２０５ｒｐｍで４８時間振と
う培養する。培養終了後、培養液を遠心分離し菌体を集
菌し、１ＬのＰＢＳ−で懸濁し、この懸濁液を再び遠心
分離し、菌体を集菌する。集菌した菌体を８００ｍｌの
ＰＢＳ−で懸濁し４０ｍｌずつ５００ｍｌ三角フラスコ
に分注し、この５００ｍｌ三角フラスコにそれぞれ４０
ｍｇのコレステロールを粉末のままで添加し、３０℃、
２０５ｒｐｍ、２４時間振とうし、変換培養を行なう。
変換培養後、培養液を集め遠心分離し、遠沈物にエタノ
ール４００ｍｌを加え抽出、抽出後、遠心分離し遠沈残
渣にさらにエタノール４００ｍｌを加え抽出、抽出後遠
心分離し、先のエタノール抽出液と合わせ５０℃以下で
減圧濃縮した。濃縮後、酢酸エチル２００ｍｌで２回抽
出、無水硫酸マグネシウムで脱水、脱水後ろ過し５０℃
以下で減圧濃縮乾固した。
製）、炭酸カルシウム０．２％からなる培地（以下培地
Ａと略す）５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに加え、
１２０℃、１５分間加圧滅菌しこれにストレプトマイセ
ス・スペシイズＨＢ−１０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＨＢ１０３）を一白金耳接種し、
３０℃、２０５ｒｐｍで３日間振とう培養する。次に培
地Ａ５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに加え加圧滅菌
したフラスコ２０本に上記条件で培養した種母菌１ｍｌ
をそれぞれ移植し３０℃、２０５ｒｐｍで４８時間振と
う培養する。培養終了後、培養液を遠心分離し菌体を集
菌し、１ＬのＰＢＳ−で懸濁し、この懸濁液を再び遠心
分離し、菌体を集菌する。集菌した菌体を８００ｍｌの
ＰＢＳ−で懸濁し４０ｍｌずつ５００ｍｌ三角フラスコ
に分注し、この５００ｍｌ三角フラスコにそれぞれ４０
ｍｇのコレステロールを粉末のままで添加し、３０℃、
２０５ｒｐｍ、２４時間振とうし、変換培養を行なう。
変換培養後、培養液を集め遠心分離し、遠沈物にエタノ
ール４００ｍｌを加え抽出、抽出後、遠心分離し遠沈残
渣にさらにエタノール４００ｍｌを加え抽出、抽出後遠
心分離し、先のエタノール抽出液と合わせ５０℃以下で
減圧濃縮した。濃縮後、酢酸エチル２００ｍｌで２回抽
出、無水硫酸マグネシウムで脱水、脱水後ろ過し５０℃
以下で減圧濃縮乾固した。
【００２７】次に、３０ｇのシリカゲルを塩化メチレン
で充填したカラムに濃縮乾固物を少量の塩化メチレンに
溶解しカラム上端に吸着させ塩化メチレン２００ｍｌ、
エタノール：塩化メチレン＝１：９ ２００ｍｌを展開
し溶出する。溶質分画をＴＬＣで展開、（ＴＬＣ：メル
ク社製Ａｒｔ．５７１５ 展開溶剤；エタノール：塩化
メチレン＝１：１９ 発色；２％硫酸）標品２５−ヒド
ロキシコレステロール（自社合成品）と同一のＲｆ値
（０．１５）を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮し
た。濃縮物を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬ
Ｃと記す）にて２５−ヒドロキシコレステロールを分離
した。 ＨＰＬＣ条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０×２５
０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；９０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ２２０ｎｍ 標品と同一の溶出時間（１９．６分）示す分画を集め５
０℃以下で濃縮乾固、７．２ｍｇ（変換率０．９％）の
２５−ヒドロキシコレステロールを得た。この分離物の
核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行
ない分離物が２５−ヒドロキシコレステロールであるこ
とを確認した。
で充填したカラムに濃縮乾固物を少量の塩化メチレンに
溶解しカラム上端に吸着させ塩化メチレン２００ｍｌ、
エタノール：塩化メチレン＝１：９ ２００ｍｌを展開
し溶出する。溶質分画をＴＬＣで展開、（ＴＬＣ：メル
ク社製Ａｒｔ．５７１５ 展開溶剤；エタノール：塩化
メチレン＝１：１９ 発色；２％硫酸）標品２５−ヒド
ロキシコレステロール（自社合成品）と同一のＲｆ値
（０．１５）を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮し
た。濃縮物を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬ
Ｃと記す）にて２５−ヒドロキシコレステロールを分離
した。 ＨＰＬＣ条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０×２５
０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；９０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ２２０ｎｍ 標品と同一の溶出時間（１９．６分）示す分画を集め５
０℃以下で濃縮乾固、７．２ｍｇ（変換率０．９％）の
２５−ヒドロキシコレステロールを得た。この分離物の
核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行
ない分離物が２５−ヒドロキシコレステロールであるこ
とを確認した。
【００２８】
【図１】
【００２９】
【実施例２】１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，
７−コレスタジエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に１α，３β−ジヒドロキシ−
５，７−コレスタジエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液
０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで
７時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同
条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴ
ＬＣ（実施例１と同条件）で１α，３β，２５−トリヒ
ドロキシ−５，７−コレスタジエン標品（自社合成品）
と同一のＲｆ（０．２５）値を示す分画を集め５０℃以
下で減圧濃縮乾固した。この濃度乾固物をＨＰＬＣにて
１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタ
ジエンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（３２．１分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、８．２ｍｇ（変換率１０．２
％）の１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コ
レスタジエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマ
ススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が１α，
３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエン
であることを確認した。
７−コレスタジエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に１α，３β−ジヒドロキシ−
５，７−コレスタジエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液
０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで
７時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同
条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴ
ＬＣ（実施例１と同条件）で１α，３β，２５−トリヒ
ドロキシ−５，７−コレスタジエン標品（自社合成品）
と同一のＲｆ（０．２５）値を示す分画を集め５０℃以
下で減圧濃縮乾固した。この濃度乾固物をＨＰＬＣにて
１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタ
ジエンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（３２．１分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、８．２ｍｇ（変換率１０．２
％）の１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コ
レスタジエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマ
ススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が１α，
３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエン
であることを確認した。
【００３０】
【図２】
【００３１】
【実施例３】２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）
−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレス
タジエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に２β−（３−ヒドロキシプロ
ピルオキシ）−１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コ
レスタジエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌ
をそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで２２時間振
とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエ
タノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実
施例１と同条件）で２β−（３−ヒドロキシプロピルオ
キシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−
コレスタジエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．
０５）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固し
た。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて２β−（３−ヒドロ
キシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロ
キシ−５，７−コレスタジエンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２９．３分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１４．２ｍｇ（変換率１７．８
％）の２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１
α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジ
エンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペク
トルを測定し構造解析を行ない分離物が２β−（３−ヒ
ドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒ
ドロキシ−５，７−コレスタジエンであることを確認し
た。
−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレス
タジエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に２β−（３−ヒドロキシプロ
ピルオキシ）−１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コ
レスタジエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌ
をそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで２２時間振
とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエ
タノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実
施例１と同条件）で２β−（３−ヒドロキシプロピルオ
キシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−
コレスタジエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．
０５）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固し
た。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて２β−（３−ヒドロ
キシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロ
キシ−５，７−コレスタジエンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２９．３分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１４．２ｍｇ（変換率１７．８
％）の２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１
α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジ
エンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペク
トルを測定し構造解析を行ない分離物が２β−（３−ヒ
ドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒ
ドロキシ−５，７−コレスタジエンであることを確認し
た。
【００３２】
【図３】
【００３３】
【実施例４】５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フ
ェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレ
スタジエン−３β，２５−ジオールの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に５α，８α−（３，５−ジオ
キソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−
１，６−コレスタジエン−３β−オール２０ｍｇ／ｍｌ
エタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、
２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養
後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルク
ロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で５α，８
α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−
トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２
５−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．４
１）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固し
た。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて５α，８α−（３，
５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリ
ジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオー
ルを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２６．３分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１６．１ｍｇ（変換率２０．１
％）の５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル
−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジ
エン−３β，２５−ジオールを得た。この分離物の核磁
気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない
分離物が５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニ
ル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタ
ジエン−３β，２５−ジオールであることを確認した。
ェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレ
スタジエン−３β，２５−ジオールの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に５α，８α−（３，５−ジオ
キソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−
１，６−コレスタジエン−３β−オール２０ｍｇ／ｍｌ
エタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、
２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養
後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルク
ロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で５α，８
α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−
トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２
５−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．４
１）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固し
た。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて５α，８α−（３，
５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリ
ジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオー
ルを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２６．３分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１６．１ｍｇ（変換率２０．１
％）の５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル
−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジ
エン−３β，２５−ジオールを得た。この分離物の核磁
気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない
分離物が５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニ
ル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタ
ジエン−３β，２５−ジオールであることを確認した。
【００３４】
【図４】
【００３５】
【実施例５】３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−
コレスタトリエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に３β−ヒドロキシ−１，５，
７−コレスタトリエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液
０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで
８時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同
条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴ
ＬＣ（実施例１と同条件）で３β，２５−ジヒドロキシ
−１，５，７−コレスタトリエン標品（自社合成品）と
同一のＲｆ（０．４８）値を示す分画を集め５０℃以下
で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて３
β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエ
ンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；９０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（１４．８分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、４．０ｍｇ（変換率２．５％）
の３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタト
リエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペ
クトルを測定し構造解析を行ない分離物が３β，２５−
ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエンであるこ
とを確認した。
コレスタトリエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に３β−ヒドロキシ−１，５，
７−コレスタトリエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液
０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで
８時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同
条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴ
ＬＣ（実施例１と同条件）で３β，２５−ジヒドロキシ
−１，５，７−コレスタトリエン標品（自社合成品）と
同一のＲｆ（０．４８）値を示す分画を集め５０℃以下
で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて３
β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエ
ンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；９０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（１４．８分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、４．０ｍｇ（変換率２．５％）
の３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタト
リエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペ
クトルを測定し構造解析を行ない分離物が３β，２５−
ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエンであるこ
とを確認した。
【００３６】
【図５】
【００３７】
【実施例６】１α，２α−エポキシ−５α，８α−
（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリ
アゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオール
の合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に１α，２α−エポキシ−５
α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，
２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β−オ
ール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞ
れに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培
養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽
出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同
条件）で１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５
−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジ
ノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオール標品（自
社合成品）と同一のＲｆ（０．３５）値を示す分画を集
め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨ
ＰＬＣにて１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，
５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリ
ジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールを分離
した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２１．９分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１４．２ｍｇ（変換率１７．１
％）の１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−
ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジ
ノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールを得た。
この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し
構造解析を行ない分離物が１α，２α−エポキシ−５
α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，
２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２
５−ジオールであることを確認した。
（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリ
アゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオール
の合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に１α，２α−エポキシ−５
α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，
２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β−オ
ール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞ
れに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培
養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽
出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同
条件）で１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５
−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジ
ノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオール標品（自
社合成品）と同一のＲｆ（０．３５）値を示す分画を集
め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨ
ＰＬＣにて１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，
５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリ
ジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールを分離
した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２１．９分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１４．２ｍｇ（変換率１７．１
％）の１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−
ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジ
ノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールを得た。
この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し
構造解析を行ない分離物が１α，２α−エポキシ−５
α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，
２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２
５−ジオールであることを確認した。
【００３８】
【図６】
【００３９】
【実施例７】１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒ
ドロキシ−５，７−コレスタジエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に１α，２α−エポキシ−３β
−ヒドロキシ−５，７−コレスタジエン２０ｍｇ／ｍｌ
エタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、
２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養
後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルク
ロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で１α，２
α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コ
レスタジエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．４
４）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固し
た。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて１α，２α−エポキ
シ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエ
ンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；９０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（９．９分）を示す分画を集め５
０℃以下で濃縮乾固、１３．４ｍｇ（変換率１６．７
％）の１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキ
シ−５，７−コレスタジエンを得た。この分離物の核磁
気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない
分離物が１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロ
キシ−５，７−コレスタジエンであることを確認した。
ドロキシ−５，７−コレスタジエンの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に１α，２α−エポキシ−３β
−ヒドロキシ−５，７−コレスタジエン２０ｍｇ／ｍｌ
エタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、
２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養
後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルク
ロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で１α，２
α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コ
レスタジエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．４
４）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固し
た。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて１α，２α−エポキ
シ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエ
ンを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；９０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（９．９分）を示す分画を集め５
０℃以下で濃縮乾固、１３．４ｍｇ（変換率１６．７
％）の１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキ
シ−５，７−コレスタジエンを得た。この分離物の核磁
気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない
分離物が１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロ
キシ−５，７−コレスタジエンであることを確認した。
【００４０】
【図７】
【００４１】
【実施例８】２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキ
シブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，
３β−ジオールの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に２０（Ｓ）−（３−メチルブ
チルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β
−ジオール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌを
それぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで９時間振とう
変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノ
ール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例
１と同条件）で２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロ
キシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１
α，３β−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ
（０．１４）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮
乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて２０（Ｓ）−
（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグ
ナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールを分離し
た。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２１．２分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１７．２ｍｇ（変換率２１．５
％）の２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチ
ルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−
ジオールを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマスス
ペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が２０（Ｓ）
−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレ
グナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールであるこ
とを確認した。
シブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，
３β−ジオールの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に２０（Ｓ）−（３−メチルブ
チルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β
−ジオール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌを
それぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで９時間振とう
変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノ
ール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例
１と同条件）で２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロ
キシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１
α，３β−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ
（０．１４）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮
乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて２０（Ｓ）−
（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグ
ナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールを分離し
た。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２１．２分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、１７．２ｍｇ（変換率２１．５
％）の２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチ
ルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−
ジオールを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマスス
ペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が２０（Ｓ）
−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレ
グナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールであるこ
とを確認した。
【００４２】
【図８】
【００４３】
【実施例９】２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキ
シブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−
ジオールの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に２０（Ｓ）−（３−メチルブ
チルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオ
ール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞ
れに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで９時間振とう変換培
養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽
出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同
条件）で２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブ
チルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオ
ール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．１４）値を
示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃
縮乾固物をＨＰＬＣにて２０（Ｓ）−（３−メチル−３
−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１
α，３β−ジオールを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２３．５分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、７．３ｍｇ（変換率９．１％）
の２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオ
キシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオールを
得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを
測定し構造解析を行ない分離物が２０（Ｓ）−（３−メ
チル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−
エン−１α，３β−ジオールであることを確認した。
シブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−
ジオールの合成 実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨ
Ｂ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−
で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２
０本を作成。この２０本に２０（Ｓ）−（３−メチルブ
チルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオ
ール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞ
れに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで９時間振とう変換培
養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽
出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同
条件）で２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブ
チルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオ
ール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．１４）値を
示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃
縮乾固物をＨＰＬＣにて２０（Ｓ）−（３−メチル−３
−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１
α，３β−ジオールを分離した。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム；ＹＭＣ Ａ３２３（１０
×２５０ｍｍ） 山村化学社製 溶出液；８０％メタノール 溶出速度；３ｍｌ／分 検出器；ＵＶ ２６５ｎｍ 標品と同一の溶出時間（２３．５分）を示す分画を集め
５０℃以下で濃縮乾固、７．３ｍｇ（変換率９．１％）
の２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオ
キシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオールを
得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを
測定し構造解析を行ない分離物が２０（Ｓ）−（３−メ
チル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−
エン−１α，３β−ジオールであることを確認した。
【００４４】
【図９】
【図１】２５−ヒドロキシコレステロールのＮＭＲチャ
ートである。
ートである。
【図２】１α ３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−
コレスタジエンのＮＭＲチャートである。
コレスタジエンのＮＭＲチャートである。
【図３】２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１
α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジ
エンのＮＭＲチャートである。
α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジ
エンのＮＭＲチャートである。
【図４】５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フエニ
ル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタ
ジエン−３β，２５−ジオールのＮＭＲチャートであ
る。
ル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタ
ジエン−３β，２５−ジオールのＮＭＲチャートであ
る。
【図５】３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレ
スタトリエンのＮＭＲチャートである。
スタトリエンのＮＭＲチャートである。
【図６】１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５
−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジ
ノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールのＮＭＲ
チャートである。
−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジ
ノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールのＮＭＲ
チャートである。
【図７】１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロ
キシ−５，７−コレスタジエンのＮＭＲチャートであ
る。
キシ−５，７−コレスタジエンのＮＭＲチャートであ
る。
【図８】２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブ
チルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β
−ジオールのＮＭＲチャートである。
チルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β
−ジオールのＮＭＲチャートである。
【図９】２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブ
チルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオ
ールのＮＭＲチャートである。
チルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオ
ールのＮＭＲチャートである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
Claims (1)
- 【請求項１】ステロイド類の２５位を水酸化する放線菌
菌体または培養液にステロイド類を加え２５位の水素原
子を水酸基に変換する事を特徴とする２５−ヒドロキシ
ステロイド類の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30850593A JP3589685B2 (ja) | 1993-11-02 | 1993-11-02 | ステロイド類の２５位水酸化物の生物学的製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30850593A JP3589685B2 (ja) | 1993-11-02 | 1993-11-02 | ステロイド類の２５位水酸化物の生物学的製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07123997A true JPH07123997A (ja) | 1995-05-16 |
| JP3589685B2 JP3589685B2 (ja) | 2004-11-17 |
Family
ID=17981833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30850593A Expired - Fee Related JP3589685B2 (ja) | 1993-11-02 | 1993-11-02 | ステロイド類の２５位水酸化物の生物学的製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3589685B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0855445A4 (en) * | 1995-08-28 | 1998-09-30 | Mercian Corp | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF HYDROXYL CHOLESTEROLS BY BIOLOGICAL CONVERSION AND DIHYDROXYCHOLESTEROLS OBTAINED ACCORDING TO THIS PROCESS |
| EP0916736A1 (en) * | 1996-06-27 | 1999-05-19 | Mercian Corporation | Biological process for preparing 25-hydroxylated steroids |
| EP0924199A4 (ja) * | 1996-07-01 | 1999-07-28 | ||
| CN111892637A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-11-06 | 山东海能生物工程有限公司 | 一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法 |
-
1993
- 1993-11-02 JP JP30850593A patent/JP3589685B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0855445A4 (en) * | 1995-08-28 | 1998-09-30 | Mercian Corp | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF HYDROXYL CHOLESTEROLS BY BIOLOGICAL CONVERSION AND DIHYDROXYCHOLESTEROLS OBTAINED ACCORDING TO THIS PROCESS |
| US6146844A (en) * | 1995-08-28 | 2000-11-14 | Mercian Corporation | Process for producing hydroxylated cholesterols and dihydroxycholesterols using amycolata |
| US6410759B1 (en) | 1995-08-28 | 2002-06-25 | Mercian Corporation | Dihydroxycholesterol hydroxylated at 17- and 25-positions |
| EP0916736A1 (en) * | 1996-06-27 | 1999-05-19 | Mercian Corporation | Biological process for preparing 25-hydroxylated steroids |
| EP0916736A4 (en) * | 1996-06-27 | 2002-04-10 | Mercian Corp | BIOLOGICAL PROCESS FOR PRODUCING 25-HYDROXYLATED STEROIDS |
| EP0924199A4 (ja) * | 1996-07-01 | 1999-07-28 | ||
| CN111892637A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-11-06 | 山东海能生物工程有限公司 | 一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法 |
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|---|---|
| JP3589685B2 (ja) | 2004-11-17 |
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