JPH07241197A - ２５−ヒドロキシビタミンｄ類の製造法 - Google Patents
２５−ヒドロキシビタミンｄ類の製造法Info
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- JPH07241197A JPH07241197A JP30592794A JP30592794A JPH07241197A JP H07241197 A JPH07241197 A JP H07241197A JP 30592794 A JP30592794 A JP 30592794A JP 30592794 A JP30592794 A JP 30592794A JP H07241197 A JPH07241197 A JP H07241197A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 医薬品、食品あるいは飼料添加物などに有用
な化合物である２５−ヒドロキシビタミンＤ類を安価で
効率よく製造する方法を提供する。 【構成】 スフィンゴモナス属に属する微生物由来で、
かつビタミンＤ類の２５位の位置で特異的にビタミンＤ
類を水酸化する反応を触媒する酵素源およびビタミンＤ
類を水性媒体中に存在せしめ、ビタミンＤ類を２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ類に変換させ、生成した２５−ヒド
ロキシビタミンＤ類を該水性媒体中より採取することを
特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造法。
な化合物である２５−ヒドロキシビタミンＤ類を安価で
効率よく製造する方法を提供する。 【構成】 スフィンゴモナス属に属する微生物由来で、
かつビタミンＤ類の２５位の位置で特異的にビタミンＤ
類を水酸化する反応を触媒する酵素源およびビタミンＤ
類を水性媒体中に存在せしめ、ビタミンＤ類を２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ類に変換させ、生成した２５−ヒド
ロキシビタミンＤ類を該水性媒体中より採取することを
特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ類の製造方法に関する。２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ類は、医薬品、食品あるいは飼料添加物などに有用
な化合物である。
ミンＤ類の製造方法に関する。２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ類は、医薬品、食品あるいは飼料添加物などに有用
な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方
法として、スチグマステロール、エルゴステロール、コ
レステロールなどの種々のステロールを出発原料とした
有機合成法が知られているが [有機合成化学,37,755-77
0(1979)、有機合成化学,37,809-829(1979)]、ビタミン
Ｄ類の２５位に水酸基を直接導入する方法は知られてい
ない。
法として、スチグマステロール、エルゴステロール、コ
レステロールなどの種々のステロールを出発原料とした
有機合成法が知られているが [有機合成化学,37,755-77
0(1979)、有機合成化学,37,809-829(1979)]、ビタミン
Ｄ類の２５位に水酸基を直接導入する方法は知られてい
ない。
【０００３】生物学的方法によりビタミンＤ類の２５位
に水酸基を導入する方法として、動物の肝臓を用いる方
法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. C
ommun.）,36,251-256(1969)］、ストレプトマイセス
属、ノカルジア属またはアミコラータ属に属する放線菌
を用いる方法［特公平４−６４６７８号公報、特開平２
−２３１０８９号公報、特開平４−３５６１９０号公
報、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイ
クロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol. ）,57,
2841-2846(1991)］およびノカルジア属またはアミコラ
ータ属に属する放線菌由来の、２５位に水素原子を有す
るビタミンＤ類の２５位水素原子を水酸基に変換するこ
とのできる水酸化酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
を含有する組換え体ＤＮＡを保持する、ストレプトマイ
セス属に属する形質転換微生物を用いる方法が知られて
いる（ＷＯ ９４／００５７６）。
に水酸基を導入する方法として、動物の肝臓を用いる方
法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. C
ommun.）,36,251-256(1969)］、ストレプトマイセス
属、ノカルジア属またはアミコラータ属に属する放線菌
を用いる方法［特公平４−６４６７８号公報、特開平２
−２３１０８９号公報、特開平４−３５６１９０号公
報、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイ
クロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol. ）,57,
2841-2846(1991)］およびノカルジア属またはアミコラ
ータ属に属する放線菌由来の、２５位に水素原子を有す
るビタミンＤ類の２５位水素原子を水酸基に変換するこ
とのできる水酸化酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
を含有する組換え体ＤＮＡを保持する、ストレプトマイ
セス属に属する形質転換微生物を用いる方法が知られて
いる（ＷＯ ９４／００５７６）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
で効率よく２５−ヒドロキシビタミンＤ類を製造する方
法を提供することにある。
で効率よく２５−ヒドロキシビタミンＤ類を製造する方
法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、スフィ
ンゴモナス属に属する微生物由来で、かつビタミンＤ類
の２５位の位置で特異的にビタミンＤ類を水酸化する反
応を触媒する酵素源およびビタミンＤ類を水性媒体中に
存在せしめ、ビタミンＤ類を２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ類に変換させ、生成した２５−ヒドロキシビタミンＤ
類を該水性媒体中より採取することを特徴とする２５−
ヒドロキシビタミンＤ類の製造法を提供することができ
る。
ンゴモナス属に属する微生物由来で、かつビタミンＤ類
の２５位の位置で特異的にビタミンＤ類を水酸化する反
応を触媒する酵素源およびビタミンＤ類を水性媒体中に
存在せしめ、ビタミンＤ類を２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ類に変換させ、生成した２５−ヒドロキシビタミンＤ
類を該水性媒体中より採取することを特徴とする２５−
ヒドロキシビタミンＤ類の製造法を提供することができ
る。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
用いるビタミンＤ類としては、例えば、ビタミンＤ2 誘
導体、ビタミンＤ3 誘導体、ビタミンＤ4 誘導体、ビタ
ミンＤ5 誘導体、ビタミンＤ6 誘導体、ビタミンＤ7 誘
導体があげられ、それらの１７位側鎖が水素原子、水酸
基、低級アルキル基などで置換されているものでもよ
い。具体的には、ビタミンＤ2 、ビタミンＤ3 、ビタミ
ンＤ4 、ビタミンＤ5 、ビタミンＤ6 、ビタミンＤ7 、
２４−オキソビタミンＤ3 、１α−ヒドロキシビタミン
Ｄ2 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 、１α−ヒドロキ
シビタミンＤ4 、１α−ヒドロキシビタミンＤ5 、１α
−ヒドロキシビタミンＤ6 、１α−ヒドロキシビタミン
Ｄ7 、１α−ヒドロキシ−２４−オキソビタミンＤ3 、
１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3 、２４−ヒドロ
キシビタミンＤ3 、２３−ヒドロキシビタミンＤ3 、２
３−ヒドロキシビタミンＤ4 、１α，２３−ジヒドロキ
シビタミンＤ3 、１α，２３−ジヒドロキシビタミンＤ
4 、２６−ヒドロキシビタミンＤ2 、２６−ヒドロキシ
ビタミンＤ3 、２６−ヒドロキシビタミンＤ4 、１α，
２６−ジヒドロキシビタミンＤ 2 、１α，２６−ジヒド
ロキシビタミンＤ3 、１α，２６−ジヒドロキシビタミ
ンＤ4 、２３，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3 、２
３，２６−ジヒドロキシビタミンＤ3 、２３，２６−ジ
ヒドロキシビタミンＤ4 、ビタミンＤ3 ２６，２３−ラ
クトン、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 ２６，２３−ラ
クトン、２４，２４−ジフルオロビタミンＤ3 、２４，
２４−ジクロロビタミンＤ3 、２６，２６，２６，２
７，２７，２７−ヘキサフルオロビタミンＤ3 などを例
示することができる。
用いるビタミンＤ類としては、例えば、ビタミンＤ2 誘
導体、ビタミンＤ3 誘導体、ビタミンＤ4 誘導体、ビタ
ミンＤ5 誘導体、ビタミンＤ6 誘導体、ビタミンＤ7 誘
導体があげられ、それらの１７位側鎖が水素原子、水酸
基、低級アルキル基などで置換されているものでもよ
い。具体的には、ビタミンＤ2 、ビタミンＤ3 、ビタミ
ンＤ4 、ビタミンＤ5 、ビタミンＤ6 、ビタミンＤ7 、
２４−オキソビタミンＤ3 、１α−ヒドロキシビタミン
Ｄ2 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 、１α−ヒドロキ
シビタミンＤ4 、１α−ヒドロキシビタミンＤ5 、１α
−ヒドロキシビタミンＤ6 、１α−ヒドロキシビタミン
Ｄ7 、１α−ヒドロキシ−２４−オキソビタミンＤ3 、
１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3 、２４−ヒドロ
キシビタミンＤ3 、２３−ヒドロキシビタミンＤ3 、２
３−ヒドロキシビタミンＤ4 、１α，２３−ジヒドロキ
シビタミンＤ3 、１α，２３−ジヒドロキシビタミンＤ
4 、２６−ヒドロキシビタミンＤ2 、２６−ヒドロキシ
ビタミンＤ3 、２６−ヒドロキシビタミンＤ4 、１α，
２６−ジヒドロキシビタミンＤ 2 、１α，２６−ジヒド
ロキシビタミンＤ3 、１α，２６−ジヒドロキシビタミ
ンＤ4 、２３，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3 、２
３，２６−ジヒドロキシビタミンＤ3 、２３，２６−ジ
ヒドロキシビタミンＤ4 、ビタミンＤ3 ２６，２３−ラ
クトン、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 ２６，２３−ラ
クトン、２４，２４−ジフルオロビタミンＤ3 、２４，
２４−ジクロロビタミンＤ3 、２６，２６，２６，２
７，２７，２７−ヘキサフルオロビタミンＤ3 などを例
示することができる。
【０００７】本発明の２５−ヒドロキシビタミンＤ類の
製造法で用いられる酵素源は、ビタミンＤ類の２５位を
特異的に水酸化して２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生
成する反応を触媒する活性を有していれば、微生物、そ
の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素または粗酵素の
いずれでもよい。微生物の好適な例としてはスフィンゴ
モナス属に属する微生物があげられる。具体的には、ス
フィンゴモナス・エスピーＨＤ−１あるいはこれらの菌
株の継代培養物、突然変異体もしくは誘導体などがあげ
られる。
製造法で用いられる酵素源は、ビタミンＤ類の２５位を
特異的に水酸化して２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生
成する反応を触媒する活性を有していれば、微生物、そ
の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素または粗酵素の
いずれでもよい。微生物の好適な例としてはスフィンゴ
モナス属に属する微生物があげられる。具体的には、ス
フィンゴモナス・エスピーＨＤ−１あるいはこれらの菌
株の継代培養物、突然変異体もしくは誘導体などがあげ
られる。
【０００８】スフィンゴモナス・エスピーＨＤ−１は北
海道の土壌から新たに分離した微生物である。以下にそ
の菌学的性質を示す。 １．形態的性質 ＨＤ−１の形態的性質を第１表に示す。
海道の土壌から新たに分離した微生物である。以下にそ
の菌学的性質を示す。 １．形態的性質 ＨＤ−１の形態的性質を第１表に示す。
【０００９】
【表１】
【００１０】２．培養的性質 ＨＤ−１の培養的性質を第２表に示す。
【００１１】
【表２】
【００１２】３．生理学的性質 ＨＤ−１の生理学的性質を第３−(1)表および第３−(2)
表に示す。
表に示す。
【００１３】
【表３】
【００１４】
【表４】
【００１５】４．その他の諸性質 ＨＤ−１のその他の諸性質を第４表に、化学分類学的性
質を第５表示す。
質を第５表示す。
【００１６】
【表５】
【００１７】
【表６】
【００１８】以上の菌学的性質を有する菌について、マ
イクロバイオロジカル・イミュノロジー（Microbiologi
cal Immunology）,34,99-119(1990)記載の菌学的性質と
照合した結果、本菌株をスフィンゴモナス（Sphingomon
as）属に属する微生物と同定し、スフィンゴモナス・エ
スピーＨＤ−１と命名した。本菌株は、ブダペスト条約
に基づいて平成５年１１月２日付で通産省工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４５６とし
て寄託されている。
イクロバイオロジカル・イミュノロジー（Microbiologi
cal Immunology）,34,99-119(1990)記載の菌学的性質と
照合した結果、本菌株をスフィンゴモナス（Sphingomon
as）属に属する微生物と同定し、スフィンゴモナス・エ
スピーＨＤ−１と命名した。本菌株は、ブダペスト条約
に基づいて平成５年１１月２日付で通産省工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４５６とし
て寄託されている。
【００１９】スフィンゴモナスに属し、ビタミンＤ類の
２５位を特異的に水酸化する能力を有する微生物を培養
するために用いる培地としては、該微生物が資化し得る
炭素源、窒素源、無機物その他の栄養素を含有し、該微
生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、
合成培地のいずれでも良い。炭素源としては、グルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、デンプンあ
るいはデンプン加水分解物などの各種炭水化物、ソルビ
トール、マンニトールなどの各種糖アルコール、グリセ
ロール、あるいは酢酸、プロピオン酸、クエン酸などの
各種有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー
ル類などが用いられる。
２５位を特異的に水酸化する能力を有する微生物を培養
するために用いる培地としては、該微生物が資化し得る
炭素源、窒素源、無機物その他の栄養素を含有し、該微
生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、
合成培地のいずれでも良い。炭素源としては、グルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、デンプンあ
るいはデンプン加水分解物などの各種炭水化物、ソルビ
トール、マンニトールなどの各種糖アルコール、グリセ
ロール、あるいは酢酸、プロピオン酸、クエン酸などの
各種有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー
ル類などが用いられる。
【００２０】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機または有機アンモニウム
塩、その他含窒素化合物、ならびに、ペプトン、ＮＺア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、
カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種
発酵菌体およびその消化物などが用いられる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機または有機アンモニウム
塩、その他含窒素化合物、ならびに、ペプトン、ＮＺア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、
カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種
発酵菌体およびその消化物などが用いられる。
【００２１】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。
【００２２】培養は、振盪培養または通気撹拌培養など
の好気的条件下で行われる。培養温度は１５〜３７℃が
好適で、培養時間は通常１６〜９６時間である。培養中
ｐＨは５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機
あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシュ
ウム、アンモニアなどを用いて行う。
の好気的条件下で行われる。培養温度は１５〜３７℃が
好適で、培養時間は通常１６〜９６時間である。培養中
ｐＨは５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機
あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシュ
ウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００２３】ビタミンＤ類を２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ類に変換させる反応は、スフィンゴモナス属に属する
微生物由来で、かつビタミンＤ類の２５位の位置で特異
的にビタミンＤ類を水酸化する反応を触媒する酵素源お
よびビタミンＤ類を水性媒体中に存在せしめることによ
り行うことができる。酵素源としては、、ビタミンＤ類
の２５位の位置で特異的にビタミンＤ類を水酸化する反
応を触媒する活性を有しているスフィンゴモナス属に属
する微生物の培養物、菌体または菌体処理物などが用い
られる。
Ｄ類に変換させる反応は、スフィンゴモナス属に属する
微生物由来で、かつビタミンＤ類の２５位の位置で特異
的にビタミンＤ類を水酸化する反応を触媒する酵素源お
よびビタミンＤ類を水性媒体中に存在せしめることによ
り行うことができる。酵素源としては、、ビタミンＤ類
の２５位の位置で特異的にビタミンＤ類を水酸化する反
応を触媒する活性を有しているスフィンゴモナス属に属
する微生物の培養物、菌体または菌体処理物などが用い
られる。
【００２４】菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理
物、機械的摩砕処理物、溶媒処理物、菌体の蛋白分画、
菌体および該菌体処理物の固定化物などがあげられる。
また、該菌体より抽出したビタミンＤ類の２５位を特異
的に水酸化する活性を有する酵素、それらの酵素の精製
標品、固定化物なども用いられる。
乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理
物、機械的摩砕処理物、溶媒処理物、菌体の蛋白分画、
菌体および該菌体処理物の固定化物などがあげられる。
また、該菌体より抽出したビタミンＤ類の２５位を特異
的に水酸化する活性を有する酵素、それらの酵素の精製
標品、固定化物なども用いられる。
【００２５】水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸
エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類およ
びアセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を含有し
た水溶液、およびスフィンゴモナス属に属し、ビタミン
Ｄ類の２５位を特異的に水酸化する能力を有する微生物
の培養液、菌体または菌体処理物を得るために用いる培
地などがあげられる。
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸
エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類およ
びアセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を含有し
た水溶液、およびスフィンゴモナス属に属し、ビタミン
Ｄ類の２５位を特異的に水酸化する能力を有する微生物
の培養液、菌体または菌体処理物を得るために用いる培
地などがあげられる。
【００２６】反応は通常、温度１５〜５０℃、ｐＨ６.
０〜９. ０で行う。反応時間は、培養物、菌体または菌
体処理物の量およびビタミンＤ類の量により異なるが、
通常１〜９６時間である。反応液中の菌体および菌体処
理物の濃度は、用いる基質の量などにより決定される
が、通常は湿菌体として１〜３００ｇ／Ｌで用いられ
る。
０〜９. ０で行う。反応時間は、培養物、菌体または菌
体処理物の量およびビタミンＤ類の量により異なるが、
通常１〜９６時間である。反応液中の菌体および菌体処
理物の濃度は、用いる基質の量などにより決定される
が、通常は湿菌体として１〜３００ｇ／Ｌで用いられ
る。
【００２７】反応に用いるビタミンＤ類は、０．０１〜
１０ｇ／Ｌの範囲で用いられる。水性媒体中から、２５
−ヒドロキシビタミンＤ類を回収する方法としては、該
水性媒体中より微生物菌体または菌体処理物などの沈殿
物を遠心分離などの手段により除去し、得られる上清を
溶媒抽出法、吸着樹脂およびイオン交換樹脂などを用い
るカラムクロマトグラフィーあるいは晶出法など、通常
の分離方法が用いられる。
１０ｇ／Ｌの範囲で用いられる。水性媒体中から、２５
−ヒドロキシビタミンＤ類を回収する方法としては、該
水性媒体中より微生物菌体または菌体処理物などの沈殿
物を遠心分離などの手段により除去し、得られる上清を
溶媒抽出法、吸着樹脂およびイオン交換樹脂などを用い
るカラムクロマトグラフィーあるいは晶出法など、通常
の分離方法が用いられる。
【００２８】以下に本発明の実施例を示す。
【００２９】
実施例１ ＹＭＧ培地［グルコース０．４％、酵母エキス０．４
％、麦芽エキス１．０％を含み、６Ｎ水酸化ナトリウム
（ＮａＯＨ）でｐＨ７．３に調整した培地］を試験管
（径２５ｍｍｘ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分注し、１
２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、イースト・ブ
イヨン寒天平板培地［粉末ブイヨン（極東製薬社製）２
％、酵母エキス０. ５％、寒天１．５％を含み、６Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整後、１２０℃、２０分間殺
菌した培地］に生育したスフィンゴモナス・エスピーＨ
Ｄ−１を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し種
培養液として用いた。
％、麦芽エキス１．０％を含み、６Ｎ水酸化ナトリウム
（ＮａＯＨ）でｐＨ７．３に調整した培地］を試験管
（径２５ｍｍｘ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分注し、１
２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、イースト・ブ
イヨン寒天平板培地［粉末ブイヨン（極東製薬社製）２
％、酵母エキス０. ５％、寒天１．５％を含み、６Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整後、１２０℃、２０分間殺
菌した培地］に生育したスフィンゴモナス・エスピーＨ
Ｄ−１を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し種
培養液として用いた。
【００３０】この種培養液２０ｍｌを、２リットル三角
フラスコに２５０ｍｌ分注し、１２０℃、２０分間殺菌
した本培養用培地［グルコース１．５％、塩化ナトリウ
ム０．５％、コーンスティープリカー１．０％、バクト
ソイトーン（ディフコ社製）０．７５％を含み、６Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ７．１に調整した培地］に植菌し、２８
℃で２日間振盪培養した。該培養液に、ビタミンＤ3 の
２％エタノール溶液（ｗ／ｖ）２．７ｍｌを添加し、更
に２８℃で３日間振盪培養した。得られた本培養液２５
０ｍｌにメタノール７００ｍｌおよびクロロフォルム２
５０ｍｌを添加し、１０分間振盪を行った後に、クロロ
フォルム２５０ｍｌおよび水２５０ｍｌを加えて静置し
て二相に分離させ、このうち下層のクロロフォルム相を
採取した。クロロフォルム相に無水硫酸ナトリウムを加
えて脱水した後に、減圧下で濃縮し、得られた培養液の
抽出濃縮液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
により分析した。
フラスコに２５０ｍｌ分注し、１２０℃、２０分間殺菌
した本培養用培地［グルコース１．５％、塩化ナトリウ
ム０．５％、コーンスティープリカー１．０％、バクト
ソイトーン（ディフコ社製）０．７５％を含み、６Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ７．１に調整した培地］に植菌し、２８
℃で２日間振盪培養した。該培養液に、ビタミンＤ3 の
２％エタノール溶液（ｗ／ｖ）２．７ｍｌを添加し、更
に２８℃で３日間振盪培養した。得られた本培養液２５
０ｍｌにメタノール７００ｍｌおよびクロロフォルム２
５０ｍｌを添加し、１０分間振盪を行った後に、クロロ
フォルム２５０ｍｌおよび水２５０ｍｌを加えて静置し
て二相に分離させ、このうち下層のクロロフォルム相を
採取した。クロロフォルム相に無水硫酸ナトリウムを加
えて脱水した後に、減圧下で濃縮し、得られた培養液の
抽出濃縮液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
により分析した。
【００３１】ＨＰＬＣは島津製作所社製ＨＰＬＣシステ
ムを用いて行った。カラムはゾルバックスＳＩＬ（径4.
6mm ｘ250 mm、デュポン社製）を用いた。移動相は１２
％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含むｎ−ヘキサンを
使用し、カラム温度４０℃、流速１．５ｍｌ／分で分析
を行い、２６５ｎｍの紫外吸収にて一次検出を行い、検
出されたピークについて、フォトダイオードアレイ検出
器で吸収スペクトルの測定を行った。
ムを用いて行った。カラムはゾルバックスＳＩＬ（径4.
6mm ｘ250 mm、デュポン社製）を用いた。移動相は１２
％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含むｎ−ヘキサンを
使用し、カラム温度４０℃、流速１．５ｍｌ／分で分析
を行い、２６５ｎｍの紫外吸収にて一次検出を行い、検
出されたピークについて、フォトダイオードアレイ検出
器で吸収スペクトルの測定を行った。
【００３２】その結果、保持時間２．６８分および４．
３９分に、ビタミンＤ3 類の吸収スペクトルと一致する
２６５ｎｍに吸収極大を有するピークを認めた。標準品
のＨＰＬＣ分析の結果と比較した結果、２．６８分のピ
ークはビタミンＤ3 のピークと、４．３９分のピークは
２５−ヒドロキシビタミンＤ3 のピークとそれぞれ一致
した。また、ビタミンＤ3 および２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ3 のピーク以外には、ビタミンＤ類の吸収スペク
トルを示すピークは確認されなかった。
３９分に、ビタミンＤ3 類の吸収スペクトルと一致する
２６５ｎｍに吸収極大を有するピークを認めた。標準品
のＨＰＬＣ分析の結果と比較した結果、２．６８分のピ
ークはビタミンＤ3 のピークと、４．３９分のピークは
２５−ヒドロキシビタミンＤ3 のピークとそれぞれ一致
した。また、ビタミンＤ3 および２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ3 のピーク以外には、ビタミンＤ類の吸収スペク
トルを示すピークは確認されなかった。
【００３３】本培養液１リットル分の抽出濃縮液を併
せ、１０％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含むｎ−ヘ
キサンで平衡化したシリカゲル（ＢＷ−３００、富士シ
リアル化学社製）カラム（径25mmｘ250mm ）に吸着後、
同じ溶媒にて溶出し、２５−ヒドロキシビタミンＤ3 に
対応する画分を集め、減圧下で濃縮した。濃縮液を３０
％（ｖ／ｖ）ｎ−ヘキサンを含むジクロロメタンで平衡
化したセファデックスＬＨ−２０カラム（径30mmｘ450m
m 、ファルマシア社製）に吸着後、同じ溶媒にて溶出分
画を行った。２５−ヒドロキシビタミンＤ3 に対応する
画分を集め、減圧下で濃縮し、２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ3 を３．０ｍｇ得た。本標品を分析した結果、13Ｃ
−ＮＭＲスペクトル、 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マスス
ペクトルで、２５−ヒドロキシビタミンＤ3 標準品（フ
ナコシ株式会社製）と一致した。
せ、１０％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含むｎ−ヘ
キサンで平衡化したシリカゲル（ＢＷ−３００、富士シ
リアル化学社製）カラム（径25mmｘ250mm ）に吸着後、
同じ溶媒にて溶出し、２５−ヒドロキシビタミンＤ3 に
対応する画分を集め、減圧下で濃縮した。濃縮液を３０
％（ｖ／ｖ）ｎ−ヘキサンを含むジクロロメタンで平衡
化したセファデックスＬＨ−２０カラム（径30mmｘ450m
m 、ファルマシア社製）に吸着後、同じ溶媒にて溶出分
画を行った。２５−ヒドロキシビタミンＤ3 に対応する
画分を集め、減圧下で濃縮し、２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ3 を３．０ｍｇ得た。本標品を分析した結果、13Ｃ
−ＮＭＲスペクトル、 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マスス
ペクトルで、２５−ヒドロキシビタミンＤ3 標準品（フ
ナコシ株式会社製）と一致した。
【００３４】実施例２ 本培養用培地を試験管（径25mmｘ200mm)に１０ｍｌずつ
分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地に、実
施例１と同様の方法で取得した種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃で２日間振盪培養した後、ビタミンＤ
3 の２％（ｗ／ｖ）エタノール溶液を２００μｌ添加
し、更に３日間２８℃で振盪培養した。得られた培養液
０．１ｍｌに、メタノール０．２ｍｌおよびクロロフォ
ルム０．１ｍｌを加え、１０分間振盪した後に、クロロ
フォルム０．１ｍｌ、水０．１ｍｌを加え、１５，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、下層のクロロフォルム相
を採取した。残存する上層にクロロフォルム０．２ｍｌ
を加え、１０分間振盪した後、遠心分離し下層のクロロ
フォルム相を採取した。採取したクロロフォルム相を併
せ、減圧下で濃縮乾固した。これを１２％（ｖ／ｖ）の
２−プロパノールを含むｎ−ヘキサン０．２ｍｌに溶解
し、ＨＰＬＣにより分析を行った。
分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地に、実
施例１と同様の方法で取得した種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃で２日間振盪培養した後、ビタミンＤ
3 の２％（ｗ／ｖ）エタノール溶液を２００μｌ添加
し、更に３日間２８℃で振盪培養した。得られた培養液
０．１ｍｌに、メタノール０．２ｍｌおよびクロロフォ
ルム０．１ｍｌを加え、１０分間振盪した後に、クロロ
フォルム０．１ｍｌ、水０．１ｍｌを加え、１５，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、下層のクロロフォルム相
を採取した。残存する上層にクロロフォルム０．２ｍｌ
を加え、１０分間振盪した後、遠心分離し下層のクロロ
フォルム相を採取した。採取したクロロフォルム相を併
せ、減圧下で濃縮乾固した。これを１２％（ｖ／ｖ）の
２−プロパノールを含むｎ−ヘキサン０．２ｍｌに溶解
し、ＨＰＬＣにより分析を行った。
【００３５】ＨＰＬＣは島津製作所製ＨＰＬＣシステム
を用いて行った。カラムはゾルバックスＳＩＬ（径4.6m
m ｘ250 mm、デュポン社製）を用いた。移動相は１２％
（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含むｎ−ヘキサンを使
用し、カラム温度４０℃、流速１．５ｍｌ／分で分析を
行い、２６５ｎｍの紫外吸収にて検出を行った。その結
果、１２．９ｍｇ／Ｌの２５−ヒドロキシビタミンＤ3
が生成していることが確認された。また、２５−ヒドロ
キシビタミンＤ3 以外にはビタミンＤ3由来の水酸化化
合物は確認されなかった。
を用いて行った。カラムはゾルバックスＳＩＬ（径4.6m
m ｘ250 mm、デュポン社製）を用いた。移動相は１２％
（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含むｎ−ヘキサンを使
用し、カラム温度４０℃、流速１．５ｍｌ／分で分析を
行い、２６５ｎｍの紫外吸収にて検出を行った。その結
果、１２．９ｍｇ／Ｌの２５−ヒドロキシビタミンＤ3
が生成していることが確認された。また、２５−ヒドロ
キシビタミンＤ3 以外にはビタミンＤ3由来の水酸化化
合物は確認されなかった。
【００３６】実施例３ 本培養用培地を試験管（径25mmｘ200mm)に１０ｍｌずつ
分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地に、実
施例１と同様の方法で取得した種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃で２日間振盪培養した。該本培養液１
０ｍｌを１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、湿
菌体を採取した。得られた湿菌体を２５ｍＭコハク酸２
ナトリウムを含む０．１Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
３）〔N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesul
fonic acid、和光純薬工業社製〕により洗浄後、遠心分
離し、得られた菌体を同緩衝液１０ｍｌに懸濁した。懸
濁液にビタミンＤ3 の２％（ｗ／ｖ）エタノール溶液
０．１ｍｌを添加し、２８℃で３日間振盪して反応させ
た。反応液より実施例２と同様の方法で２５−ヒドロキ
シビタミンＤ3 を抽出し、ＨＰＬＣにより分析を行っ
た。
分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地に、実
施例１と同様の方法で取得した種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃で２日間振盪培養した。該本培養液１
０ｍｌを１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、湿
菌体を採取した。得られた湿菌体を２５ｍＭコハク酸２
ナトリウムを含む０．１Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
３）〔N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesul
fonic acid、和光純薬工業社製〕により洗浄後、遠心分
離し、得られた菌体を同緩衝液１０ｍｌに懸濁した。懸
濁液にビタミンＤ3 の２％（ｗ／ｖ）エタノール溶液
０．１ｍｌを添加し、２８℃で３日間振盪して反応させ
た。反応液より実施例２と同様の方法で２５−ヒドロキ
シビタミンＤ3 を抽出し、ＨＰＬＣにより分析を行っ
た。
【００３７】その結果、１４．４ｍｇ／Ｌの２５−ヒド
ロキシビタミンＤ3 が生成していることが確認された。
ロキシビタミンＤ3 が生成していることが確認された。
【００３８】実施例４ 実施例３と同様の方法で取得した湿菌体１０ｇを生理食
塩水を用いて洗浄し、遠心分離した後、得られた菌体を
蒸留水に懸濁し１５ｍｌとした。この懸濁液にアルギン
酸ナトリウム（富士化学工業社製）０．９ｇを蒸留水３
０ｍｌに溶解した溶液を加え、得られた混合液を２％塩
化カルシウム溶液に滴下することにより、粒径約２ｍｍ
の固定化菌体を得た。固定化菌体を湿菌体として１００
ｇ／ｌとなるように２５ｍＭコハク酸２ナトリウムを含
む０．１Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製
した。該固定化菌体懸濁液１０ｍｌにビタミンＤ3 の２
％（ｗ／ｖ）エタノール溶液０．１ｍｌを添加し、２８
℃で３日間振盪して反応させた。反応液より実施例２と
同様の方法で２５−ヒドロキシビタミンＤ3 を抽出し、
ＨＰＬＣにより分析を行った。その結果、５．３ｍｇ／
ｌの２５−ヒドロキシビタミンＤ3 の生成を確認した。
塩水を用いて洗浄し、遠心分離した後、得られた菌体を
蒸留水に懸濁し１５ｍｌとした。この懸濁液にアルギン
酸ナトリウム（富士化学工業社製）０．９ｇを蒸留水３
０ｍｌに溶解した溶液を加え、得られた混合液を２％塩
化カルシウム溶液に滴下することにより、粒径約２ｍｍ
の固定化菌体を得た。固定化菌体を湿菌体として１００
ｇ／ｌとなるように２５ｍＭコハク酸２ナトリウムを含
む０．１Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製
した。該固定化菌体懸濁液１０ｍｌにビタミンＤ3 の２
％（ｗ／ｖ）エタノール溶液０．１ｍｌを添加し、２８
℃で３日間振盪して反応させた。反応液より実施例２と
同様の方法で２５−ヒドロキシビタミンＤ3 を抽出し、
ＨＰＬＣにより分析を行った。その結果、５．３ｍｇ／
ｌの２５−ヒドロキシビタミンＤ3 の生成を確認した。
【００３９】実施例５ 実施例２と同様の操作を、ビタミンＤ3 の代わりに１α
−ヒドロキシビタミンＤ3 を用いて実施した。その結
果、８．８ｍｇ／ｌの１α、２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ3 が生成していることが確認された。１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ3 以外の１α−ヒドロキシビタ
ミンＤ3 由来水酸化化合物は確認されなかった。
−ヒドロキシビタミンＤ3 を用いて実施した。その結
果、８．８ｍｇ／ｌの１α、２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ3 が生成していることが確認された。１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ3 以外の１α−ヒドロキシビタ
ミンＤ3 由来水酸化化合物は確認されなかった。
【００４０】実施例６ 実施例２と同様の操作を、ビタミンＤ3の代わりにビタ
ミンＤ2を用いて実施した。その結果、１０．９ｍｇ／
ｌの２５−ヒドロキシビタミンＤ2が生成していること
が確認された。２５−ヒドロキシビタミンＤ2以外のビ
タミンＤ2由来水酸化化合物は確認されなかった。
ミンＤ2を用いて実施した。その結果、１０．９ｍｇ／
ｌの２５−ヒドロキシビタミンＤ2が生成していること
が確認された。２５−ヒドロキシビタミンＤ2以外のビ
タミンＤ2由来水酸化化合物は確認されなかった。
【００４１】参考例１ 菌株としてアミコラータ・オートロフィカ（Amycolata
autorophica）ＪＣＭ４３４８を、本培養培地としてグ
ルコース１．５％、塩化ナトリウム０．５％、コーンス
ティープリカー０．５％、バクトソイトーン１．５％を
含む培地（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．１に調整）を用い
る以外は、実施例２と同様の方法で培養、抽出および分
析を行った。
autorophica）ＪＣＭ４３４８を、本培養培地としてグ
ルコース１．５％、塩化ナトリウム０．５％、コーンス
ティープリカー０．５％、バクトソイトーン１．５％を
含む培地（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．１に調整）を用い
る以外は、実施例２と同様の方法で培養、抽出および分
析を行った。
【００４２】その結果、３．８ｍｇ／ｌの２５−ヒドロ
キシビタミンＤ3 および０．９４ｍｇ／ｌの１α，２５
−ヒドロキシビタミンＤ3 が生成していることが確認さ
れた。
キシビタミンＤ3 および０．９４ｍｇ／ｌの１α，２５
−ヒドロキシビタミンＤ3 が生成していることが確認さ
れた。
【００４３】参考例２ 実施例２と同様の操作を、ビタミンＤ3 の代わりに２５
−ヒドロキシビタミンＤ3 を用いて実施した。その結
果、２５−ヒドロキシビタミンＤ3 以外の２５−ヒドロ
キシビタミンＤ 3 由来の水酸化化合物は確認されなかっ
た。
−ヒドロキシビタミンＤ3 を用いて実施した。その結
果、２５−ヒドロキシビタミンＤ3 以外の２５−ヒドロ
キシビタミンＤ 3 由来の水酸化化合物は確認されなかっ
た。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、安価で効率よく２５−
ヒドロキシビタミンＤ類を製造する方法を提供すること
ができる。
ヒドロキシビタミンＤ類を製造する方法を提供すること
ができる。
Claims (3)
- 【請求項１】スフィンゴモナス属に属する微生物由来
で、かつビタミンＤ類の２５位の位置で特異的にビタミ
ンＤ類を水酸化する反応を触媒する酵素源およびビタミ
ンＤ類を水性媒体中に存在せしめ、ビタミンＤ類を２５
−ヒドロキシビタミンＤ類に変換させ、生成した２５−
ヒドロキシビタミンＤ類を該水性媒体中より採取するこ
とを特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造
法。 - 【請求項２】スフィンゴモナス属に属する微生物が、ス
フィンゴモナス・エスピーＨＤ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４４５６）である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】酵素源が、微生物の培養物、菌体または菌
体処理物である請求項１または２記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30592794A JPH07241197A (ja) | 1994-01-11 | 1994-12-09 | ２５−ヒドロキシビタミンｄ類の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP114994 | 1994-01-11 | ||
| JP6-1149 | 1994-01-11 | ||
| JP30592794A JPH07241197A (ja) | 1994-01-11 | 1994-12-09 | ２５−ヒドロキシビタミンｄ類の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07241197A true JPH07241197A (ja) | 1995-09-19 |
Family
ID=26334318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30592794A Withdrawn JPH07241197A (ja) | 1994-01-11 | 1994-12-09 | ２５−ヒドロキシビタミンｄ類の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07241197A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0916736A1 (en) * | 1996-06-27 | 1999-05-19 | Mercian Corporation | Biological process for preparing 25-hydroxylated steroids |
| WO2000061776A1 (fr) * | 1999-04-14 | 2000-10-19 | Mercian Corporation | Derives de vitamine d et procede de production correspondant |
| US6146844A (en) * | 1995-08-28 | 2000-11-14 | Mercian Corporation | Process for producing hydroxylated cholesterols and dihydroxycholesterols using amycolata |
| CN111440779A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-07-24 | 沈阳美得欣医药科技有限公司 | 一种维生素d3羟化酶转化生产25-羟基维生素d3的方法 |
-
1994
- 1994-12-09 JP JP30592794A patent/JPH07241197A/ja not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6146844A (en) * | 1995-08-28 | 2000-11-14 | Mercian Corporation | Process for producing hydroxylated cholesterols and dihydroxycholesterols using amycolata |
| US6410759B1 (en) | 1995-08-28 | 2002-06-25 | Mercian Corporation | Dihydroxycholesterol hydroxylated at 17- and 25-positions |
| EP0916736A1 (en) * | 1996-06-27 | 1999-05-19 | Mercian Corporation | Biological process for preparing 25-hydroxylated steroids |
| EP0916736A4 (en) * | 1996-06-27 | 2002-04-10 | Mercian Corp | BIOLOGICAL PROCESS FOR PRODUCING 25-HYDROXYLATED STEROIDS |
| WO2000061776A1 (fr) * | 1999-04-14 | 2000-10-19 | Mercian Corporation | Derives de vitamine d et procede de production correspondant |
| CN111440779A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-07-24 | 沈阳美得欣医药科技有限公司 | 一种维生素d3羟化酶转化生产25-羟基维生素d3的方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020305 |