JPH06343485A - 無水有機媒体内におけるスクロースエステル類の部位選択的酵素脱アシル化 - Google Patents
無水有機媒体内におけるスクロースエステル類の部位選択的酵素脱アシル化Info
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- JPH06343485A JPH06343485A JP6030927A JP3092794A JPH06343485A JP H06343485 A JPH06343485 A JP H06343485A JP 6030927 A JP6030927 A JP 6030927A JP 3092794 A JP3092794 A JP 3092794A JP H06343485 A JPH06343485 A JP H06343485A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 無水有機媒体内におけるスクロースエステル
類の部位選択的酵素脱アシル化。 【構成】 スクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化
によるスクロースの部分アシル化誘導体の製造方法であ
り、この方法は、無水有機媒体の中で、オクタアシル化
スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサア
シル化スクロースから成る群から選択されるスクロース
エステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触
媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで処理すること
により、予め選択した一の位置または複数の位置に遊離
ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロー
ス誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化
スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
類の部位選択的酵素脱アシル化。 【構成】 スクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化
によるスクロースの部分アシル化誘導体の製造方法であ
り、この方法は、無水有機媒体の中で、オクタアシル化
スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサア
シル化スクロースから成る群から選択されるスクロース
エステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触
媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで処理すること
により、予め選択した一の位置または複数の位置に遊離
ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロー
ス誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化
スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、無水有機溶媒中で酵素
類を用いて部位選択的にスクロースエステル類を脱アシ
ル化する方法に関する。
類を用いて部位選択的にスクロースエステル類を脱アシ
ル化する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】人工甘味料である４，１’，６’−トリ
クロロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロ
ース（「スクラロース（sucralose）」）は、スクロー
スを用いこれの４，１’および６’位のヒドロキシルを
塩素で置換することによって誘導される。（この甘味料
の製造方法において、その４位の立体配置が反転してい
る、従ってこの化合物はガラクトスクロースである）。
これらの塩素原子をその所望の位置にのみ向かわせるの
が主要な合成上の課題である、と言うのは、置換される
ヒドロキシルは異なる反応性を示し、その２つは第一級
でありそして１つは第二級であるからである。その最終
生成物の６位にある第一級ヒドロキシルは未置換である
事が、この合成を更に複雑にしている。
クロロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロ
ース（「スクラロース（sucralose）」）は、スクロー
スを用いこれの４，１’および６’位のヒドロキシルを
塩素で置換することによって誘導される。（この甘味料
の製造方法において、その４位の立体配置が反転してい
る、従ってこの化合物はガラクトスクロースである）。
これらの塩素原子をその所望の位置にのみ向かわせるの
が主要な合成上の課題である、と言うのは、置換される
ヒドロキシルは異なる反応性を示し、その２つは第一級
でありそして１つは第二級であるからである。その最終
生成物の６位にある第一級ヒドロキシルは未置換である
事が、この合成を更に複雑にしている。
【０００３】本発明は、スクロースエステル類への改良
されたルートを提供するものであり、ここで、これらの
エステル基は、そのスクロース分子上の予め決められた
位置に結合している。１つの態様において、本発明は、
スクラロースを製造する目的で用いられ得る４，２，
３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース
（「４−ＰＡＳ」）または６，２，３，３’，４’−ペ
ンタ−Ｏ−アセチルスクロース（「６−ＰＡＳ」）か或
はこれらの両方への改良されたルートを提供する。４−
ＰＡＳは容易に６−ＰＡＳに転位し、これを塩素化した
あと脱アシル化することによって、スクラロースを製造
することができる。
されたルートを提供するものであり、ここで、これらの
エステル基は、そのスクロース分子上の予め決められた
位置に結合している。１つの態様において、本発明は、
スクラロースを製造する目的で用いられ得る４，２，
３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース
（「４−ＰＡＳ」）または６，２，３，３’，４’−ペ
ンタ−Ｏ−アセチルスクロース（「６−ＰＡＳ」）か或
はこれらの両方への改良されたルートを提供する。４−
ＰＡＳは容易に６−ＰＡＳに転位し、これを塩素化した
あと脱アシル化することによって、スクラロースを製造
することができる。
【０００４】
【発明の簡単な要約】本発明は、スクロースエステル類
の酵素触媒脱アシル化によるスクロースの部分アシル化
誘導体の製造方法を提供するものであり、ここで、上記
方法は、無水有機媒体（本文中に定義する如き）の中
で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロ
ースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選
択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステ
ルの脱アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合
わせで処理することにより、予め選択した一または複数
の位置に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化さ
れたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部
分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含んで
いる。
の酵素触媒脱アシル化によるスクロースの部分アシル化
誘導体の製造方法を提供するものであり、ここで、上記
方法は、無水有機媒体（本文中に定義する如き）の中
で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロ
ースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選
択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステ
ルの脱アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合
わせで処理することにより、予め選択した一または複数
の位置に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化さ
れたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部
分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含んで
いる。
【０００５】
【従来技術】Bornemann他の米国特許第5,141,860号（お
よび英国特許第2 224 504 A号）には、スクロースのオ
クタエステル類を水系媒体中で酵素的に脱アシル化する
ことによって種々の部分脱アシル化スクロースエステル
類を生じさせる方法が開示されている。
よび英国特許第2 224 504 A号）には、スクロースのオ
クタエステル類を水系媒体中で酵素的に脱アシル化する
ことによって種々の部分脱アシル化スクロースエステル
類を生じさせる方法が開示されている。
【０００６】水系媒体（２相系であってもよい）内にお
けるオクタ−Ｏ−アセチルスクロースの酵素的加水分解
によるヘプタ−、ヘキサ−および／またはペンタ−Ｏ−
アセチルスクロース類の製造が、Chang他、J. Carbohyd
rate Chemistry、 10(2)、 251-261 (1991）およびCarboh
ydrate Reserach、 222、 121-129 (1991）；Kloosterman
他、 J. Carbohydrate Chemistry、 8(5)、 693-704 (198
9）；Mentech他、 ヨーロッパ特許第0 357 476号（1990
年3月7日−フランス特許番号2 634 497号に相当）；お
よびOng他、 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter
s、 2(2)、 161-164(1992）に開示されている。
けるオクタ−Ｏ−アセチルスクロースの酵素的加水分解
によるヘプタ−、ヘキサ−および／またはペンタ−Ｏ−
アセチルスクロース類の製造が、Chang他、J. Carbohyd
rate Chemistry、 10(2)、 251-261 (1991）およびCarboh
ydrate Reserach、 222、 121-129 (1991）；Kloosterman
他、 J. Carbohydrate Chemistry、 8(5)、 693-704 (198
9）；Mentech他、 ヨーロッパ特許第0 357 476号（1990
年3月7日−フランス特許番号2 634 497号に相当）；お
よびOng他、 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter
s、 2(2)、 161-164(1992）に開示されている。
【０００７】以下に示す文献の中に、水系媒体（２相系
であってもよい）内における炭水化物エステル類の部位
選択的酵素脱アシル化が一般的に開示されている。
であってもよい）内における炭水化物エステル類の部位
選択的酵素脱アシル化が一般的に開示されている。
【０００８】H. M. Sweers他、 J. Am. Chem. Soc.、 10
8、 6421 (1986); W. J. Hennen他、 J. Org. Chem.、 53、
4939 (1988); J. Zemek他、 Coll. Czech. Chem. Commu
n.、 53、 1851 (1988); A. Ballesteros他、 Tetrahedro
n、 45、 7077 (1989); S. Tomic他、 Carbohydrate Res.、
210、 191 (1991)；およびK. Kefurt他、 CarbohydrateR
es.、 223、 137 (1992）。
8、 6421 (1986); W. J. Hennen他、 J. Org. Chem.、 53、
4939 (1988); J. Zemek他、 Coll. Czech. Chem. Commu
n.、 53、 1851 (1988); A. Ballesteros他、 Tetrahedro
n、 45、 7077 (1989); S. Tomic他、 Carbohydrate Res.、
210、 191 (1991)；およびK. Kefurt他、 CarbohydrateR
es.、 223、 137 (1992）。
【０００９】J. S. Dordick著「有機溶媒で用いるため
の酵素設計」、Biotechnol. Prog.、1992、 No. 8、 259-2
67およびA. M. Klibanov著「有機溶媒中で働く酵素
類」、Chemtech、 1986年6月、 354-359には、非水系で反
応を触媒する酵素類を用いることで得ることが可能な利
点が考察されている。
の酵素設計」、Biotechnol. Prog.、1992、 No. 8、 259-2
67およびA. M. Klibanov著「有機溶媒中で働く酵素
類」、Chemtech、 1986年6月、 354-359には、非水系で反
応を触媒する酵素類を用いることで得ることが可能な利
点が考察されている。
【００１０】
【発明の具体的な説明】学術用語および省略形 本出願で用いる下記の短縮名、省略形および言葉はその
指示した意味を有する。
指示した意味を有する。
【００１１】スクラロース＝４，１’，６’−トリクロ
ロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロー
ス；ＳＨｅｐｔａＡ＝七酢酸スクロースもしくはヘプタ
−Ｏ−アセチルスクロース；ＳＨｅｘａＡ＝六酢酸スク
ロースもしくはヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；６−
ＰＡＳ＝６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチ
ルスクロース；４−ＰＡＳ＝４，２，３，３’，４’−
ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース；４’−ＯＨヘプタア
セテート＝２，３，４，６，１’，３’，６’−ヘプタ
−Ｏ−アセチルスクロース；１’−ＯＨヘプタアセテー
ト＝２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−
アセチルスクロース；６’−ＯＨヘプタアセテート＝
２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロース；１’，６’−ジＯＨヘキサアセテート
＝２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチル
スクロース；ＳＯＡ＝八酢酸スクロース；ＳＯＰ＝八プ
ロピオン酸スクロース；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；
２−メチルＴＨＦ＝２−メチルテトラヒドロフラン；
２，５−ジメチルＴＨＦ＝２，５−ジメチルテトラヒド
ロフラン；２，２，５，５−テトラメチルＴＨＦ＝２，
２，５，５−テトラメチルテトラヒドロフラン；および
ＣＣｌ4＝四塩化炭素。
ロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロー
ス；ＳＨｅｐｔａＡ＝七酢酸スクロースもしくはヘプタ
−Ｏ−アセチルスクロース；ＳＨｅｘａＡ＝六酢酸スク
ロースもしくはヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；６−
ＰＡＳ＝６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチ
ルスクロース；４−ＰＡＳ＝４，２，３，３’，４’−
ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース；４’−ＯＨヘプタア
セテート＝２，３，４，６，１’，３’，６’−ヘプタ
−Ｏ−アセチルスクロース；１’−ＯＨヘプタアセテー
ト＝２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−
アセチルスクロース；６’−ＯＨヘプタアセテート＝
２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロース；１’，６’−ジＯＨヘキサアセテート
＝２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチル
スクロース；ＳＯＡ＝八酢酸スクロース；ＳＯＰ＝八プ
ロピオン酸スクロース；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；
２−メチルＴＨＦ＝２−メチルテトラヒドロフラン；
２，５−ジメチルＴＨＦ＝２，５−ジメチルテトラヒド
ロフラン；２，２，５，５−テトラメチルＴＨＦ＝２，
２，５，５−テトラメチルテトラヒドロフラン；および
ＣＣｌ4＝四塩化炭素。
【００１２】ここで用いる「無水」有機媒体は、この反
応で用いる有機溶媒の体積を基準にして約１体積％以下
の水を含んでいる有機媒体を意味することを意図してお
り、ここで、該酵素に結合している水は排除する。更
に、この有機媒体が水に混和性を示さない化合物である
場合、本発明で用いる無水有機媒体は単相である（即
ち、何らかの水が存在している場合、この水は水相を生
じるに充分な割合では存在していない）ことを意図して
いる。
応で用いる有機溶媒の体積を基準にして約１体積％以下
の水を含んでいる有機媒体を意味することを意図してお
り、ここで、該酵素に結合している水は排除する。更
に、この有機媒体が水に混和性を示さない化合物である
場合、本発明で用いる無水有機媒体は単相である（即
ち、何らかの水が存在している場合、この水は水相を生
じるに充分な割合では存在していない）ことを意図して
いる。
【００１３】本発明の方法は、無水有機媒体の中で、オ
クタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースお
よびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択され
るスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱
アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで
処理することにより、予め選択した一または複数の位置
に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたス
クロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱ア
シル化スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
クタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースお
よびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択され
るスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱
アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで
処理することにより、予め選択した一または複数の位置
に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたス
クロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱ア
シル化スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
【００１４】本発明の方法で用いられ得るスクロースエ
ステル類の中には、八−、七−および六酢酸スクロー
ス、八−、七−および六プロピオン酸スクロース、八
−、七−および六（ｎ−もしくはｓ−酪酸）スクロー
ス、スクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（α
−ハロアルカノエート類）、例えば八クロロ酢酸スクロ
ースおよび八フルオロ酢酸スクロースなど、スクロース
のトリハロアルカノエート類、例えばスクロースのオク
タ−、ヘプタ−およびヘキサ（トリクロロアセテート）
およびスクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ
（トリフルオロアセテート）、並びにスクロースの他の
オクタ−、ヘプタ−およびヘキサアシレート類およびハ
ロアルカノエート類があり、ここで、このアルカノエー
ト部分は約８個以下の炭素原子を有している。
ステル類の中には、八−、七−および六酢酸スクロー
ス、八−、七−および六プロピオン酸スクロース、八
−、七−および六（ｎ−もしくはｓ−酪酸）スクロー
ス、スクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（α
−ハロアルカノエート類）、例えば八クロロ酢酸スクロ
ースおよび八フルオロ酢酸スクロースなど、スクロース
のトリハロアルカノエート類、例えばスクロースのオク
タ−、ヘプタ−およびヘキサ（トリクロロアセテート）
およびスクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ
（トリフルオロアセテート）、並びにスクロースの他の
オクタ−、ヘプタ−およびヘキサアシレート類およびハ
ロアルカノエート類があり、ここで、このアルカノエー
ト部分は約８個以下の炭素原子を有している。
【００１５】本発明の方法では有機溶媒を用いる。本方
法を実施するに有効であることが見いだされた有機溶媒
は、単独で用いられるか或は組み合わせて用いられるか
に拘らず、トルエン、ジイソプロピルエーテル、四塩化
炭素、エチレングリコールジメチルおよびジエチルエー
テル、アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキ
サノン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエ
チルエーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサ
ノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタ
ノン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエー
テル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテ
ル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトー
ル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、
ジ−ｎ−ブチルエーテル、並びに他の環状および非環状
有機溶媒であり、これらには、本発明の方法で用いるス
クロースエステル基質を溶かす炭化水素（脂肪族および
芳香族炭化水素の両方）、エーテル類、ケトン類、エス
テル類、アルコール類およびハロゲン化炭化水素が含ま
れる。１つの種類として、エーテル類が本発明の方法で
用いるに好適な有機溶媒であることが確認された。
法を実施するに有効であることが見いだされた有機溶媒
は、単独で用いられるか或は組み合わせて用いられるか
に拘らず、トルエン、ジイソプロピルエーテル、四塩化
炭素、エチレングリコールジメチルおよびジエチルエー
テル、アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキ
サノン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエ
チルエーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサ
ノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタ
ノン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエー
テル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテ
ル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトー
ル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、
ジ−ｎ−ブチルエーテル、並びに他の環状および非環状
有機溶媒であり、これらには、本発明の方法で用いるス
クロースエステル基質を溶かす炭化水素（脂肪族および
芳香族炭化水素の両方）、エーテル類、ケトン類、エス
テル類、アルコール類およびハロゲン化炭化水素が含ま
れる。１つの種類として、エーテル類が本発明の方法で
用いるに好適な有機溶媒であることが確認された。
【００１６】本発明の１つの好適な態様において、この
反応媒体の中でまた求核剤を用いる。上記求核剤には、
水（水に混和性を示さない溶媒の場合、この媒体の中に
独立した水相を形成する量よりも少ない量である、さも
なくばこの有機溶媒の体積を基準にして１体積％以下の
量である）が含まれ、そして好適には、有機求核剤、例
えばアルコール類、アミン類、アミノアルコール類、チ
オール類およびオキシム類が含まれる。上記有機求核剤
の説明的例には、ｎ−ブタノール、メタノール、ベンジ
ルアルコール、フェネチルアルコール、ジイソプロピル
アミン、エチレングリコール、プロピレングリコール、
２−ピペリジンエタノール、ｎ−ブチルチオール、ベン
ジルメルカプタン、チオフェノール、シスチン［３，
３’−ジチオビス（２−アミノプロピオン酸）］、アセ
トアルドキシム、アセトンオキシムおよびベンズアルド
キシムが含まれる。
反応媒体の中でまた求核剤を用いる。上記求核剤には、
水（水に混和性を示さない溶媒の場合、この媒体の中に
独立した水相を形成する量よりも少ない量である、さも
なくばこの有機溶媒の体積を基準にして１体積％以下の
量である）が含まれ、そして好適には、有機求核剤、例
えばアルコール類、アミン類、アミノアルコール類、チ
オール類およびオキシム類が含まれる。上記有機求核剤
の説明的例には、ｎ−ブタノール、メタノール、ベンジ
ルアルコール、フェネチルアルコール、ジイソプロピル
アミン、エチレングリコール、プロピレングリコール、
２−ピペリジンエタノール、ｎ−ブチルチオール、ベン
ジルメルカプタン、チオフェノール、シスチン［３，
３’−ジチオビス（２−アミノプロピオン酸）］、アセ
トアルドキシム、アセトンオキシムおよびベンズアルド
キシムが含まれる。
【００１７】本発明で用いる酵素類は加水分解酵素類、
例えばリパーゼ類、プロテアーゼ類、エステラーゼ類お
よびアミラーゼ類である。そのスクロース部分上の予め
選択した位置にあるエステル基を優先的に除去する目的
で、これらの酵素類を用いる。１つの面において、酵素
であるリパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラセア
（Candida cylindracea））を用いることで優先的に主
に４’位のエステル基そして二次的に１’位のエステル
基を除去する。プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus sub
tilis））を用いて優先的に１’，４’および６’位の
エステル基を除去する。ブタのすい臓リパーゼを用いて
優先的に４’位のエステル基を除去する。アルカラーゼ
（バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformi
s））を用いて優先的に１’位のエステル基そして二次
的に６’位のエステル基を除去する。プロレザー（Prol
eather)（枯草菌（Bacillus subtilis））を用いて優先
的に１’位のエステル基そして二次的に６’位のエステ
ル基を除去する。リパーゼＡＰ１２（黒色アスペルギル
ス（Aspergillus niger））を用いて優先的に４位およ
び６位のエステル基を除去する。ＳＰ−４３５リパーゼ
（カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica））
を用いて優先的に主に６’位のエステル基そして二次的
に１’位のエステル基を除去する。
例えばリパーゼ類、プロテアーゼ類、エステラーゼ類お
よびアミラーゼ類である。そのスクロース部分上の予め
選択した位置にあるエステル基を優先的に除去する目的
で、これらの酵素類を用いる。１つの面において、酵素
であるリパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラセア
（Candida cylindracea））を用いることで優先的に主
に４’位のエステル基そして二次的に１’位のエステル
基を除去する。プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus sub
tilis））を用いて優先的に１’，４’および６’位の
エステル基を除去する。ブタのすい臓リパーゼを用いて
優先的に４’位のエステル基を除去する。アルカラーゼ
（バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformi
s））を用いて優先的に１’位のエステル基そして二次
的に６’位のエステル基を除去する。プロレザー（Prol
eather)（枯草菌（Bacillus subtilis））を用いて優先
的に１’位のエステル基そして二次的に６’位のエステ
ル基を除去する。リパーゼＡＰ１２（黒色アスペルギル
ス（Aspergillus niger））を用いて優先的に４位およ
び６位のエステル基を除去する。ＳＰ−４３５リパーゼ
（カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica））
を用いて優先的に主に６’位のエステル基そして二次的
に１’位のエステル基を除去する。
【００１８】本発明の方法で用いる反応媒体は、上に定
義した如く無水である。存在させ得る少量の水は、この
酵素を溶解させる量未満である。本発明の方法を無水媒
体（本文中に定義した如き）中で実施することにより下
記の利点が得られることを見い出した。
義した如く無水である。存在させ得る少量の水は、この
酵素を溶解させる量未満である。本発明の方法を無水媒
体（本文中に定義した如き）中で実施することにより下
記の利点が得られることを見い出した。
【００１９】１． 該スクロースのオクタエステル基質
の溶解性が増大すること； ２． 望まれない脱アシル化が抑制されること； ３． この脱アシル化反応の部位選択性が増強されるこ
と； ４． この酵素を固定する必要がないことからこの方法
が簡単になること、例えばこの酵素は簡単な濾過でその
反応混合物から除去され得ること； ５． 生成物の単離がより容易なこと、例えば単に溶媒
を蒸発させることが、必要とされている全てである可能
性があること； ６． 微生物学的汚染の可能性が有意に低いこと；そし
て ７． 酵素類を溶解させるに充分な量の水が存在してい
ないことでこれらの酵素が示す熱安定性がより高いこ
と。
の溶解性が増大すること； ２． 望まれない脱アシル化が抑制されること； ３． この脱アシル化反応の部位選択性が増強されるこ
と； ４． この酵素を固定する必要がないことからこの方法
が簡単になること、例えばこの酵素は簡単な濾過でその
反応混合物から除去され得ること； ５． 生成物の単離がより容易なこと、例えば単に溶媒
を蒸発させることが、必要とされている全てである可能
性があること； ６． 微生物学的汚染の可能性が有意に低いこと；そし
て ７． 酵素類を溶解させるに充分な量の水が存在してい
ないことでこれらの酵素が示す熱安定性がより高いこ
と。
【００２０】最初に、有機溶媒中でＳＯＡを部位選択的
に脱アセチル化する能力に関して、幅広い種類の加水分
解酵素のスクリーニングを行った。我々の初期のスクリ
ーニング実験で評価したものの中でリパーゼＡＹ３０が
有意な活性を示した。酵素活性は、この酵素を取り巻い
ている水の殻が最小限であることに依存している。公知
の相対湿度（ＲＨ）を有する飽和塩水溶液の上でその乾
燥した酵素を平衡にすることによって、この酵素、即ち
それの活性に結合している水の量を調節することができ
る。有機溶媒の中に入っている酵素が示す触媒力を改良
する１つの方法は、正しいイオン状態でそれを用いるこ
とであることは知られている。これは一般に、この酵素
の最適ｐＨにある緩衝液からこの酵素を凍結乾燥するか
或は沈澱させることによって達成される。本技術におけ
る一般的教示に一致して、ｐＨを調整した緩衝液（製造
業者が指定している最適ｐＨから±１のｐＨ単位）から
他の酵素類の多くを沈澱させると有意な活性が得られる
ことを見い出した（表１参照）。
に脱アセチル化する能力に関して、幅広い種類の加水分
解酵素のスクリーニングを行った。我々の初期のスクリ
ーニング実験で評価したものの中でリパーゼＡＹ３０が
有意な活性を示した。酵素活性は、この酵素を取り巻い
ている水の殻が最小限であることに依存している。公知
の相対湿度（ＲＨ）を有する飽和塩水溶液の上でその乾
燥した酵素を平衡にすることによって、この酵素、即ち
それの活性に結合している水の量を調節することができ
る。有機溶媒の中に入っている酵素が示す触媒力を改良
する１つの方法は、正しいイオン状態でそれを用いるこ
とであることは知られている。これは一般に、この酵素
の最適ｐＨにある緩衝液からこの酵素を凍結乾燥するか
或は沈澱させることによって達成される。本技術におけ
る一般的教示に一致して、ｐＨを調整した緩衝液（製造
業者が指定している最適ｐＨから±１のｐＨ単位）から
他の酵素類の多くを沈澱させると有意な活性が得られる
ことを見い出した（表１参照）。
【００２１】
【表１】
【００２２】ａ） この挙げた緩衝液ｐＨは、無水溶媒
内の酵素活性に最適なｐＨである。
内の酵素活性に最適なｐＨである。
【００２３】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。
の生成物の分布を得た。
【００２４】活性を示すとして同定された酵素のいくつ
かに関して、それらが異なる溶媒中で示す活性を評価す
る実験を行った。数多くの無水溶媒の中で同じ酵素に触
媒させたＳＯＡ脱アセチル化実験を行った。２４時間培
養した後の一定分量をＨＰＬＣで分析した。これらの溶
媒実験の結果を表２−５に示すが、これらは明らかに、
評価した各酵素が示す活性に対して溶媒が著しい影響を
与えることを表している。
かに関して、それらが異なる溶媒中で示す活性を評価す
る実験を行った。数多くの無水溶媒の中で同じ酵素に触
媒させたＳＯＡ脱アセチル化実験を行った。２４時間培
養した後の一定分量をＨＰＬＣで分析した。これらの溶
媒実験の結果を表２−５に示すが、これらは明らかに、
評価した各酵素が示す活性に対して溶媒が著しい影響を
与えることを表している。
【００２５】
【表２】
【００２６】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数［Rekker著「疎水性フラグメント定数」（The Hydr
ophobic Fragmental Constant）、Elsevier、 Amsterdam
(1977)］）。この表のlog P値は、Laane他、 Biotechno
l Bioeng. 30、 81 (1987）からのものである。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数［Rekker著「疎水性フラグメント定数」（The Hydr
ophobic Fragmental Constant）、Elsevier、 Amsterdam
(1977)］）。この表のlog P値は、Laane他、 Biotechno
l Bioeng. 30、 81 (1987）からのものである。
【００２７】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。
の生成物の分布を得た。
【００２８】ｃ） 七酢酸スクロースが検出されたのは
ＳＯＡ中に少量の不純物が存在していたことによるもの
である。
ＳＯＡ中に少量の不純物が存在していたことによるもの
である。
【００２９】ｄ） エタノール、ジエチルエーテルおよ
びエトキシエタノールに関する公知log P値から見積も
った。
びエトキシエタノールに関する公知log P値から見積も
った。
【００３０】ｅ） ＴＨＦに関するlog P値に１メチル
基当たり０．５単位を増分的に加えることによって見積
もった。
基当たり０．５単位を増分的に加えることによって見積
もった。
【００３１】ｆ） 恐らくは溶媒による他のピークがこ
の六酢酸スクロースピークを干渉していたことからこの
値を報告しなかった。
の六酢酸スクロースピークを干渉していたことからこの
値を報告しなかった。
【００３２】
【表３】
【００３３】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
【００３４】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち
１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．
５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこ
れを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
の生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち
１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．
５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこ
れを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００３５】
【表４】
【００３６】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
【００３７】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。１種の七酢酸スクロース
（Ｒt：８．１分）を検出した。
の生成物の分布を得た。１種の七酢酸スクロース
（Ｒt：８．１分）を検出した。
【００３８】
【表５】
【００３９】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
【００４０】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち
１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．
５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこ
れを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
の生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち
１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．
５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこ
れを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００４１】固定化した加水分解酵素に対する溶媒の効
果 アルカラーゼおよびリパーゼＡＹ３０をハイフロスーパ
ーセル（Hyflo SuperCell）の上に堆積させ、そしてこ
れを、いくつかの無水溶媒中のＳＯＡ脱アセチル化反応
用触媒として用いた。両方の固定化酵素を用いた時（表
６および７）、有利な溶媒効果が観察された。
果 アルカラーゼおよびリパーゼＡＹ３０をハイフロスーパ
ーセル（Hyflo SuperCell）の上に堆積させ、そしてこ
れを、いくつかの無水溶媒中のＳＯＡ脱アセチル化反応
用触媒として用いた。両方の固定化酵素を用いた時（表
６および７）、有利な溶媒効果が観察された。
【００４２】
【表６】
【００４３】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
【００４４】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち
１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．
５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこ
れを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
の生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち
１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．
５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこ
れを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００４５】
【表７】
【００４６】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
【００４７】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。
の生成物の分布を得た。
【００４８】加水分解酵素によるＳＯＡ脱アセチル化に
関する部位化学 この研究の重要な面は、ＳＯＡの酵素的脱アセチル化で
得られる全ての七、六および五酢酸スクロースの構造を
明白に帰属させることであった。Rathbone E.B.、 Carbo
hydr. Res.、 205、 402 (1990）が記述しているのと同様
にして、完全デュテリウムアセチル化した後、1Ｈ−Ｎ
ＭＲ分析することでこれらの構造の帰属を行った。リパ
ーゼＡＹ３０およびリパーゼＩＩ型を用いた表８（以
下）に示す結果を調べた結果、主要な脱アセチル化生成
物は４’−ＯＨヘプタアセテートである。それとは対照
的に、プロテアーゼ類であるアルカラーゼおよびプロレ
ザーは、主に１’−位の脱アセチル化を生じさせ、そし
てある程度の反応がその６’−位に生じる。リパーゼＡ
Ｐ１２を用いた脱アセチル化は、４−および６−ＯＨヘ
プタアセテート類の両方を生じさせる一方、カンジダ・
アンタルクチカ由来のＳＰ−４３５リパーゼは、１’−
ＯＨヘプタアセテートと一緒に主に６’−ＯＨヘプタア
セテートを生じさせる。最後に、プロテアーゼＮは、ほ
とんど等モル混合物で１’−、４’−および６’−ＯＨ
ヘプタアセテート類を生じさせる。
関する部位化学 この研究の重要な面は、ＳＯＡの酵素的脱アセチル化で
得られる全ての七、六および五酢酸スクロースの構造を
明白に帰属させることであった。Rathbone E.B.、 Carbo
hydr. Res.、 205、 402 (1990）が記述しているのと同様
にして、完全デュテリウムアセチル化した後、1Ｈ−Ｎ
ＭＲ分析することでこれらの構造の帰属を行った。リパ
ーゼＡＹ３０およびリパーゼＩＩ型を用いた表８（以
下）に示す結果を調べた結果、主要な脱アセチル化生成
物は４’−ＯＨヘプタアセテートである。それとは対照
的に、プロテアーゼ類であるアルカラーゼおよびプロレ
ザーは、主に１’−位の脱アセチル化を生じさせ、そし
てある程度の反応がその６’−位に生じる。リパーゼＡ
Ｐ１２を用いた脱アセチル化は、４−および６−ＯＨヘ
プタアセテート類の両方を生じさせる一方、カンジダ・
アンタルクチカ由来のＳＰ−４３５リパーゼは、１’−
ＯＨヘプタアセテートと一緒に主に６’−ＯＨヘプタア
セテートを生じさせる。最後に、プロテアーゼＮは、ほ
とんど等モル混合物で１’−、４’−および６’−ＯＨ
ヘプタアセテート類を生じさせる。
【００４９】
【表８】
【００５０】ａ． ＳＯＡの脱アセチル化に関して試験
して変換率が＜６％であった他の酵素類（最適なｐＨ）
は下記のものである：リパーゼＣＥ（９．０）；リパー
ゼＡＫ（８．０）；プロテアーゼＭ（６．０）；リパー
ゼＭＡＰ１０（７．０）；キモトリプシン（８．０）；
ＰＣリパーゼ（５．０）；ＭＭリパーゼ（１０．０）；
プロテアーゼＸＸＩＩ型（８．０）。
して変換率が＜６％であった他の酵素類（最適なｐＨ）
は下記のものである：リパーゼＣＥ（９．０）；リパー
ゼＡＫ（８．０）；プロテアーゼＭ（６．０）；リパー
ゼＭＡＰ１０（７．０）；キモトリプシン（８．０）；
ＰＣリパーゼ（５．０）；ＭＭリパーゼ（１０．０）；
プロテアーゼＸＸＩＩ型（８．０）。
【００５１】ｂ． このコラムの中にｐＨを示す場合、
これらの酵素は、示したｐＨの緩衝液から沈澱を生じ
た。この緩衝液のｐＨは、無水ジイソプロピルエーテル
内の酵素活性で見いだされた最適ｐＨである。
これらの酵素は、示したｐＨの緩衝液から沈澱を生じ
た。この緩衝液のｐＨは、無水ジイソプロピルエーテル
内の酵素活性で見いだされた最適ｐＨである。
【００５２】ｃ． 変換率（％）は、全七−および六−
酢酸スクロースの合計である。脱アセチル化は酵素が存
在していない場合全く生じなかった。
酢酸スクロースの合計である。脱アセチル化は酵素が存
在していない場合全く生じなかった。
【００５３】ｄ． この分子を完全デュテリウムアセチ
ル化した後、1Ｈ−ＮＭＲ分析することにより、各酵素
反応の七酢酸スクロースの構造の帰属を行った。定量化
の目的で、この表ではＨＰＬＣにおける七酢酸スクロー
スのピーク高を用いた。
ル化した後、1Ｈ−ＮＭＲ分析することにより、各酵素
反応の七酢酸スクロースの構造の帰属を行った。定量化
の目的で、この表ではＨＰＬＣにおける七酢酸スクロー
スのピーク高を用いた。
【００５４】ｅ． プロテアーゼＮが触媒する反応生成
物に関する部位化学を、ＨＰＬＣ保持時間を基準にして
割り当てた。
物に関する部位化学を、ＨＰＬＣ保持時間を基準にして
割り当てた。
【００５５】ｆ． ２，３，４，１’，３’，４’，
６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの構造を下記の
事実から推論した。培養している間はＨＰＬＣで２種の
七酢酸スクロース類が検出されたが、カラムクロマトグ
ラフィーにかけた後では、２，３，６，１’，３’，
４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルのみが得られた。恐
らくは、この精製を行っている間に、起こり得る過程で
あることが知られている４位から６位へのアセチル移動
が起こったのであろう。
６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの構造を下記の
事実から推論した。培養している間はＨＰＬＣで２種の
七酢酸スクロース類が検出されたが、カラムクロマトグ
ラフィーにかけた後では、２，３，６，１’，３’，
４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルのみが得られた。恐
らくは、この精製を行っている間に、起こり得る過程で
あることが知られている４位から６位へのアセチル移動
が起こったのであろう。
【００５６】求核剤の選択および濃度の効果 アルカラーゼ、プロレザーまたはリパーゼＡＰ１２に触
媒させた同じＳＯＡ脱アセチル化を、いくつかの求核剤
の存在下で実施し、その結果を表９に示す。アルカラー
ゼが触媒する反応では、求核剤としてメタノールまたは
ジイソプロピルアミンを用いることによって有意な変化
率の増大が達成された（求核剤を添加していない反応に
比較して少なくとも２５％上昇した）一方、プロレザー
が触媒する反応では、シクロヘキサノール、ジイソプロ
ピルアミンおよびテトラメチルピペリジンを除く添加し
た全ての求核剤が同様な改良を与えた。リパーゼＡＰ１
２が触媒する反応は、求核剤を存在させると、中間的な
変換率の改良を示した。
媒させた同じＳＯＡ脱アセチル化を、いくつかの求核剤
の存在下で実施し、その結果を表９に示す。アルカラー
ゼが触媒する反応では、求核剤としてメタノールまたは
ジイソプロピルアミンを用いることによって有意な変化
率の増大が達成された（求核剤を添加していない反応に
比較して少なくとも２５％上昇した）一方、プロレザー
が触媒する反応では、シクロヘキサノール、ジイソプロ
ピルアミンおよびテトラメチルピペリジンを除く添加し
た全ての求核剤が同様な改良を与えた。リパーゼＡＰ１
２が触媒する反応は、求核剤を存在させると、中間的な
変換率の改良を示した。
【００５７】
【表９】
【００５８】ａ） この実験全体で用いた求核剤濃度は
２００ｍＭである。ＳＯＡの脱アセチル化はこれらの酵
素なしでは全く生じなかった。
２００ｍＭである。ＳＯＡの脱アセチル化はこれらの酵
素なしでは全く生じなかった。
【００５９】ｂ） 変換率（％）（６６時間培養）を、
残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スク
ロース類の合計で表す。
残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スク
ロース類の合計で表す。
【００６０】ｃ） ２，３，４，６，１’，３’，４’
−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った
２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよび
プロレザー部位化学を定義する。
−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った
２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよび
プロレザー部位化学を定義する。
【００６１】ｄ） 反応は全く生じなかった。
【００６２】表１０に示すように、それぞれ０．５およ
び１．０Ｍのメタノール存在下でアルカラーゼおよびリ
パーゼＡＰ１２に触媒させた反応において、全体変換率
に関して中程度の増強が達成された。プロレザーに触媒
させた反応で１．０Ｍのメタノールを用いると、注目す
べき１２０％の変換率上昇が得られた。１．０Ｍのｎ−
ブタノールまたはフェネチルアルコールを用いた時も同
様な結果が得られた。
び１．０Ｍのメタノール存在下でアルカラーゼおよびリ
パーゼＡＰ１２に触媒させた反応において、全体変換率
に関して中程度の増強が達成された。プロレザーに触媒
させた反応で１．０Ｍのメタノールを用いると、注目す
べき１２０％の変換率上昇が得られた。１．０Ｍのｎ−
ブタノールまたはフェネチルアルコールを用いた時も同
様な結果が得られた。
【００６３】
【表１０】
【００６４】ａ） 変換率（％）（６６時間培養）を、
残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スク
ロース類の合計で表す。
残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スク
ロース類の合計で表す。
【００６５】ｂ） ２，３，４，６，１’，３’，４’
−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った
２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよび
プロレザー部位化学を定義する。
−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った
２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよび
プロレザー部位化学を定義する。
【００６６】本発明の１つの好適な面において、上の表
８に示す酵素類の組み合わせを用い、ＳＯＡの４−、
１’−および６’−位または６−、１’−および６’−
位のエステル基の脱アセチル化を生じさせるに適当な上
記酵素類の組み合わせでＳＯＡの同時もしくは逐次的処
理を行うことにより、４−ＰＡＳおよび／または６−Ｐ
ＡＳを製造した。
８に示す酵素類の組み合わせを用い、ＳＯＡの４−、
１’−および６’−位または６−、１’−および６’−
位のエステル基の脱アセチル化を生じさせるに適当な上
記酵素類の組み合わせでＳＯＡの同時もしくは逐次的処
理を行うことにより、４−ＰＡＳおよび／または６−Ｐ
ＡＳを製造した。
【００６７】ジイソプロピルエーテル中でアルカラーゼ
またはアルカラーゼ／リパーゼＡＰ１２が触媒するＳＯ
Ａの脱アセチル化による６−ＰＡＳの合成 アルカラーゼ触媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大
規模で行った。（詳細は以下の実験セクションの中に示
す）。５日間培養を行った後、このアルカラーゼを濾過
で除去した。シリカゲルクロマトグラフィーでＳＯＡの
脱アセチル化生成物を分離し、そして完全デュテリウム
アセチル化技術を用いて構造帰属を行った。２，３，
４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスク
ロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−
Ｏ−アセチルスクロースとの１対７混合物；２，３，
４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロー
ス；および６−ＰＡＳがそれぞれ３０％、７％および
０．５％収率で得られた。二者択一的に、リパーゼＡＰ
１２を用いて２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ
−アセチルスクロースを脱アシル化することによって４
−ＰＡＳおよび／または６−ＰＡＳを得ることができ
る。完全デュテリウムアセチル化技術を用いて、その得
られる五酢酸スクロース（ＨＰＬＣで９７％純度）を６
−ＰＡＳとして同定した（収率：１１％）。
またはアルカラーゼ／リパーゼＡＰ１２が触媒するＳＯ
Ａの脱アセチル化による６−ＰＡＳの合成 アルカラーゼ触媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大
規模で行った。（詳細は以下の実験セクションの中に示
す）。５日間培養を行った後、このアルカラーゼを濾過
で除去した。シリカゲルクロマトグラフィーでＳＯＡの
脱アセチル化生成物を分離し、そして完全デュテリウム
アセチル化技術を用いて構造帰属を行った。２，３，
４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスク
ロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−
Ｏ−アセチルスクロースとの１対７混合物；２，３，
４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロー
ス；および６−ＰＡＳがそれぞれ３０％、７％および
０．５％収率で得られた。二者択一的に、リパーゼＡＰ
１２を用いて２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ
−アセチルスクロースを脱アシル化することによって４
−ＰＡＳおよび／または６−ＰＡＳを得ることができ
る。完全デュテリウムアセチル化技術を用いて、その得
られる五酢酸スクロース（ＨＰＬＣで９７％純度）を６
−ＰＡＳとして同定した（収率：１１％）。
【００６８】メタノールが入っているジイソプロピルエ
ーテル中でプロレザーが触媒するＳＯＡの脱アセチル化
による６−ＰＡＳの合成 求核剤として１．０Ｍメタノールを用い、プロレザー触
媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大規模で行った。
（詳細は以下の実験セクションの中に示す）。５日間培
養を行った後、このプロレザーを濾過で除去した。シリ
カゲルクロマトグラフィーでＳＯＡ脱アセチル化生成物
を分離し、そして完全デュテリウムアセチル化技術を用
いて構造帰属を行った。２，３，４，６，１’，３’，
４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，
６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロー
スとの１対７混合物；２，３，４，６，３’，４’−ヘ
キサ−Ｏ−アセチルスクロース；および６−ＰＡＳがそ
れぞれ４８％、１７％および２％収率で得られた。
ーテル中でプロレザーが触媒するＳＯＡの脱アセチル化
による６−ＰＡＳの合成 求核剤として１．０Ｍメタノールを用い、プロレザー触
媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大規模で行った。
（詳細は以下の実験セクションの中に示す）。５日間培
養を行った後、このプロレザーを濾過で除去した。シリ
カゲルクロマトグラフィーでＳＯＡ脱アセチル化生成物
を分離し、そして完全デュテリウムアセチル化技術を用
いて構造帰属を行った。２，３，４，６，１’，３’，
４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，
６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロー
スとの１対７混合物；２，３，４，６，３’，４’−ヘ
キサ−Ｏ−アセチルスクロース；および６−ＰＡＳがそ
れぞれ４８％、１７％および２％収率で得られた。
【００６９】ＳＯＰの脱アシル化に関する酵素スクリー
ニング この研究の範囲および利用度を広げる目的で、八プロピ
オン酸スクロースを合成し、これを酵素触媒脱アシル化
反応における基質として用いた。ＳＯＡに対してＳＯＰ
が与える１つの重要な利点は、より高い疎水性を示す溶
媒、例えばヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オク
タンなどへの溶解性が有意に増大する点である。求核剤
としてｎ−ブタノールが入っているヘプタン内でＳＯＰ
を脱アシル化する能力に関して、加水分解酵素類のスク
リーニングを行った。２４時間培養した後の一定分量を
ＨＰＬＣで分析した。表１１に示すように、数多くの加
水分解酵素がＳＯＰの脱アシル化を生じさせた。１つの
興味の持たれる実施例において、リパーゼＡＹ３０およ
びプロテアーゼＸＸＩＩＩ型から得られるヘプタプロピ
オネートを一緒にＨＰＬＣに注入すると、２つの異なる
化合物が現れ、このことは、酵素部位選択性が異なるこ
とを立証している。
ニング この研究の範囲および利用度を広げる目的で、八プロピ
オン酸スクロースを合成し、これを酵素触媒脱アシル化
反応における基質として用いた。ＳＯＡに対してＳＯＰ
が与える１つの重要な利点は、より高い疎水性を示す溶
媒、例えばヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オク
タンなどへの溶解性が有意に増大する点である。求核剤
としてｎ−ブタノールが入っているヘプタン内でＳＯＰ
を脱アシル化する能力に関して、加水分解酵素類のスク
リーニングを行った。２４時間培養した後の一定分量を
ＨＰＬＣで分析した。表１１に示すように、数多くの加
水分解酵素がＳＯＰの脱アシル化を生じさせた。１つの
興味の持たれる実施例において、リパーゼＡＹ３０およ
びプロテアーゼＸＸＩＩＩ型から得られるヘプタプロピ
オネートを一緒にＨＰＬＣに注入すると、２つの異なる
化合物が現れ、このことは、酵素部位選択性が異なるこ
とを立証している。
【００７０】
【表１１】
【００７１】
【表１２】
【００７２】ａ） さらなる詳細を実験セクションの中
に見い出すことができるであろう。
に見い出すことができるであろう。
【００７３】ｂ） ブタノールとアシル酵素との反応で
生じるプロピオン酸ブチル。
生じるプロピオン酸ブチル。
【００７４】ｃ） ｃＡＵｓは、吸収単位を１００で割
った値で表すピーク面積である。
った値で表すピーク面積である。
【００７５】ｄ） ＨＰＬＣ分析を用いてこの生成物分
布を得た。
布を得た。
【００７６】ｅ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ
保持時間である。
保持時間である。
【００７７】リパーゼＡＹ３０およびプロテアーゼＸＸ
ＩＩＩ型が触媒するＳＯＰ脱アシル化に対する溶媒の効
果 表１２および１３に示すように、数多くの無水有機溶媒
中のリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩＩ型
を用いて同じＳＯＰ脱アシル化を実施した。ＳＯＡの場
合と同様、ＳＯＰの酵素脱アシル化は際だった溶媒効果
を示し、ヘキサン、ヘプタンおよびオクタンなどの如き
非常に高い疎水性を示す溶媒を含む種々の溶媒の中で良
好な変換率を達成することが可能であった。
ＩＩＩ型が触媒するＳＯＰ脱アシル化に対する溶媒の効
果 表１２および１３に示すように、数多くの無水有機溶媒
中のリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩＩ型
を用いて同じＳＯＰ脱アシル化を実施した。ＳＯＡの場
合と同様、ＳＯＰの酵素脱アシル化は際だった溶媒効果
を示し、ヘキサン、ヘプタンおよびオクタンなどの如き
非常に高い疎水性を示す溶媒を含む種々の溶媒の中で良
好な変換率を達成することが可能であった。
【００７８】
【表１３】
【００７９】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
【００８０】ｂ） ＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を
得た。
得た。
【００８１】ｃ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ
保持時間である。
保持時間である。
【００８２】ｄ） 他のピークがこの七および六プロピ
オン酸スクロースのピークを干渉していることからこれ
らの値を検出することができなかった。
オン酸スクロースのピークを干渉していることからこれ
らの値を検出することができなかった。
【００８３】
【表１４】
【００８４】ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の
対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものであ
る。
【００８５】ｂ） ＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を
得た。
得た。
【００８６】ｃ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ
保持時間である。
保持時間である。
【００８７】ｄ） 他のピークがこの七および六プロピ
オン酸スクロースのピークを干渉していることからこれ
らの値を検出することができなかった。
オン酸スクロースのピークを干渉していることからこれ
らの値を検出することができなかった。
【００８８】ｐＨ沈澱させたＳＯＰ脱アセチル化用加水分解酵素 ＳＯＰで活性を示す酵素類の数および活性を増大させる
目的で、ＳＯＡに関して記述したのと同様なｐＨ沈澱実
験を行った。いくつかの追加的酵素、例えばリパーゼＡ
Ｐ１２、アルカラーゼ、プロレザー、プロテアーゼＮ、
リパーゼＩＩ型およびＭＭリパーゼが、ＳＯＰを脱アセ
チル化する能力を有することが見いだされた。これらの
後者の酵素類はＳＯＡおよびＳＯＰ両方の脱アシル化を
行う。これらの実験の結果を表１４に示す。
目的で、ＳＯＡに関して記述したのと同様なｐＨ沈澱実
験を行った。いくつかの追加的酵素、例えばリパーゼＡ
Ｐ１２、アルカラーゼ、プロレザー、プロテアーゼＮ、
リパーゼＩＩ型およびＭＭリパーゼが、ＳＯＰを脱アセ
チル化する能力を有することが見いだされた。これらの
後者の酵素類はＳＯＡおよびＳＯＰ両方の脱アシル化を
行う。これらの実験の結果を表１４に示す。
【００８９】
【表１５】
【００９０】ａ） この挙げた緩衝液ｐＨは、無水媒体
内の酵素活性に最適なｐＨである。
内の酵素活性に最適なｐＨである。
【００９１】ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこ
の生成物の分布を得た。
の生成物の分布を得た。
【００９２】実験 下記の酵素類をAmanoから入手した：リパーゼＡＰ１２
（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、１２５
Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラ
セア（Candida cylindracea）、３４Ｕ／ｍｇ）、リパ
ーゼＧＣ４（ゲオトリクム・カンジヅム（Geotrichum c
andidum）、４．４Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＫ（シュー
ドモナス種（Pseudomonas sp.）、２２Ｕ／ｍｇ）、リ
パーゼＣＥ（フミコロサ・ランギノサ（Humicolosa lan
ginosa）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＮ（リゾプス・ニ
ベウス（Rhizopus niveus）、８０Ｕ／ｍｇ）、リパー
ゼＬ１０（カンジダ・リポリチカ（Candida lypolitic
a）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＭＡＰ１０（ムコル・
ジャバニクス（Mucor javanicus）、１０．６Ｕ／ｍ
ｇ）、リパーゼＰＧＥ（ウシ舌根および唾液腺、０．７
Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＲ１０（ペニシリウム・ロクエホ
ルチ（Penicillium roqueforti）、１０Ｕ／ｍｇ）、Ｌ
ＰＬ−８０（リポ蛋白質リパーゼ、８８１Ｕ／ｍｇ）、
ニューラーゼＡ（黒色アスペルギルス（Aspergillus ni
ger）、４１．８Ｕ／ｍｇ）、ニューラーゼ２（リゾプ
ス・ニベウス（Rhizopus niveus）、１５Ｕ／ｍｇ）、
ペプチダーゼＡ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergil
lus oryzae）、１０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼ２Ａ（ア
スペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、２
２．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＢ（ペニシリウム種
（Penicillium sp.）、２Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＭ
（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、
６Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus sub
tilis）、１８６Ｕ／ｍｇ）、プロレザー（枯草菌（Bac
illus subtilis）、１０．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼ
ＰＺＴ（ブタのすい臓およびアスペルギルス属（Asperg
illus）、５４Ｕ／ｍｇ）、スタキアーゼ（黒色アスペ
ルギルス（Aspergillus niger）、０．３Ｕ／ｍｇ）、
ＰＬＥ−Ａ（ブタの肝臓、５．２Ｕ／ｍｇ）、ビオチー
ムＳ（菌・カビのアミラーゼ、６４Ｕ／ｍｇ）；下記の
酵素類をSigmaから入手した：リパーゼＩ型（麦芽、
９．６Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＩＩ型（ブタのすい臓、５
０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＩＩＩ型（アスペルギル
ス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、０．４Ｕ／ｍ
ｇ）、プロテアーゼＸＩＸ型（アスペルギルス・ソジャ
エ（Aspergillus sojae）、０．４４Ｕ／ｍｇ）、プロ
テアーゼＸＸＩＩＩ型（アスペルギルス・オリザエ（As
pergillus oryzae）、３．５Ｕ／ｍｇ）、キモトリプシ
ン（ウシのすい臓、４８Ｕ／ｍｇ）、パパイン（パパイ
ヤ・ラテックス（Papaya latex）、２．８Ｕ／ｍｇ）、
ブロメライン（パイナップルの茎、２２．９Ｕ／ｍ
ｇ）、ホスファターゼアシッド（麦芽）；Biocatalysts
から下記の酵素類を入手した：ＭＭリパーゼ（ムコル・
ミエヘイ（Mucor miehei）、１７Ｕ／ｍｇ）、ＣＶリパ
ーゼ（クロモバクテリウム・ビスコスム（Chromobacter
ium viscosum）、２５Ｕ／ｍｇ）、ＰＣリパーゼ（ペニ
シリウム・シクロピウム（Penicillium cyclopium）、
１．２５Ｕ／ｍｇ）、ＲＡリパーゼ（リゾプス・アリザ
ス（Rhizopus arrhizus）、３．５Ｕ／ｍｇ）、ＰＦリ
パーゼ（シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomona
s fluorescens）、１４．５Ｕ／ｍｇ）。ニュートラー
ゼ（Newtrase）、ＳＰ−４３５リパーゼ（カンジダ・ア
ンタルクチカ（Candidaantarctica）、７ＰＬＵ／ｍ
ｇ）、およびアルカラーゼ（バチルス・リケニホルミス
（Bacillus licheniformis））はNovo Nordiskから与え
られたものであった。
（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、１２５
Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラ
セア（Candida cylindracea）、３４Ｕ／ｍｇ）、リパ
ーゼＧＣ４（ゲオトリクム・カンジヅム（Geotrichum c
andidum）、４．４Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＫ（シュー
ドモナス種（Pseudomonas sp.）、２２Ｕ／ｍｇ）、リ
パーゼＣＥ（フミコロサ・ランギノサ（Humicolosa lan
ginosa）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＮ（リゾプス・ニ
ベウス（Rhizopus niveus）、８０Ｕ／ｍｇ）、リパー
ゼＬ１０（カンジダ・リポリチカ（Candida lypolitic
a）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＭＡＰ１０（ムコル・
ジャバニクス（Mucor javanicus）、１０．６Ｕ／ｍ
ｇ）、リパーゼＰＧＥ（ウシ舌根および唾液腺、０．７
Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＲ１０（ペニシリウム・ロクエホ
ルチ（Penicillium roqueforti）、１０Ｕ／ｍｇ）、Ｌ
ＰＬ−８０（リポ蛋白質リパーゼ、８８１Ｕ／ｍｇ）、
ニューラーゼＡ（黒色アスペルギルス（Aspergillus ni
ger）、４１．８Ｕ／ｍｇ）、ニューラーゼ２（リゾプ
ス・ニベウス（Rhizopus niveus）、１５Ｕ／ｍｇ）、
ペプチダーゼＡ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergil
lus oryzae）、１０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼ２Ａ（ア
スペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、２
２．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＢ（ペニシリウム種
（Penicillium sp.）、２Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＭ
（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、
６Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus sub
tilis）、１８６Ｕ／ｍｇ）、プロレザー（枯草菌（Bac
illus subtilis）、１０．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼ
ＰＺＴ（ブタのすい臓およびアスペルギルス属（Asperg
illus）、５４Ｕ／ｍｇ）、スタキアーゼ（黒色アスペ
ルギルス（Aspergillus niger）、０．３Ｕ／ｍｇ）、
ＰＬＥ−Ａ（ブタの肝臓、５．２Ｕ／ｍｇ）、ビオチー
ムＳ（菌・カビのアミラーゼ、６４Ｕ／ｍｇ）；下記の
酵素類をSigmaから入手した：リパーゼＩ型（麦芽、
９．６Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＩＩ型（ブタのすい臓、５
０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＩＩＩ型（アスペルギル
ス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、０．４Ｕ／ｍ
ｇ）、プロテアーゼＸＩＸ型（アスペルギルス・ソジャ
エ（Aspergillus sojae）、０．４４Ｕ／ｍｇ）、プロ
テアーゼＸＸＩＩＩ型（アスペルギルス・オリザエ（As
pergillus oryzae）、３．５Ｕ／ｍｇ）、キモトリプシ
ン（ウシのすい臓、４８Ｕ／ｍｇ）、パパイン（パパイ
ヤ・ラテックス（Papaya latex）、２．８Ｕ／ｍｇ）、
ブロメライン（パイナップルの茎、２２．９Ｕ／ｍ
ｇ）、ホスファターゼアシッド（麦芽）；Biocatalysts
から下記の酵素類を入手した：ＭＭリパーゼ（ムコル・
ミエヘイ（Mucor miehei）、１７Ｕ／ｍｇ）、ＣＶリパ
ーゼ（クロモバクテリウム・ビスコスム（Chromobacter
ium viscosum）、２５Ｕ／ｍｇ）、ＰＣリパーゼ（ペニ
シリウム・シクロピウム（Penicillium cyclopium）、
１．２５Ｕ／ｍｇ）、ＲＡリパーゼ（リゾプス・アリザ
ス（Rhizopus arrhizus）、３．５Ｕ／ｍｇ）、ＰＦリ
パーゼ（シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomona
s fluorescens）、１４．５Ｕ／ｍｇ）。ニュートラー
ゼ（Newtrase）、ＳＰ−４３５リパーゼ（カンジダ・ア
ンタルクチカ（Candidaantarctica）、７ＰＬＵ／ｍ
ｇ）、およびアルカラーゼ（バチルス・リケニホルミス
（Bacillus licheniformis））はNovo Nordiskから与え
られたものであった。
【００９３】Fluka AG.からハイフロスーパーセルおよ
びシリカゲル（７０−２３０メッシュ）を入手した。他
の全ての化学品は最高グレードのものであり、Aldrich
から購入した。
びシリカゲル（７０−２３０メッシュ）を入手した。他
の全ての化学品は最高グレードのものであり、Aldrich
から購入した。
【００９４】この研究で用いた有機溶媒は、無水物とし
て購入したものであるか、或は３Åのモレキュラーシー
ブ上で貯蔵したものであった。「生物化学および分子生
物学の実用ハンドブック」（Practical Handbook of Bi
ochemistry and Molecular Biology）に記述されている
操作に従って、この研究で用いた全ての緩衝液を調製し
た（ｐＨ１０および９に関してはグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液を用い、ｐＨ８および７に関しては燐酸ナトリウム
緩衝液を用い、そしてｐＨ６、５および４に関してはク
エン酸塩−燐酸塩緩衝液を用いた）。
て購入したものであるか、或は３Åのモレキュラーシー
ブ上で貯蔵したものであった。「生物化学および分子生
物学の実用ハンドブック」（Practical Handbook of Bi
ochemistry and Molecular Biology）に記述されている
操作に従って、この研究で用いた全ての緩衝液を調製し
た（ｐＨ１０および９に関してはグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液を用い、ｐＨ８および７に関しては燐酸ナトリウム
緩衝液を用い、そしてｐＨ６、５および４に関してはク
エン酸塩−燐酸塩緩衝液を用いた）。
【００９５】ＨＰＬＣ分析。それぞれ八酢酸スクロース
（ＳＯＡ）および八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）
を伴う反応用溶離剤としてアセトニトリル／水（３５／
６５）またはアセトニトリル／水（６０／４０）のどち
らかを用いたイソクラティック（isocratic）モード使
用Supelcosil LC-18-DBカラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、
５μ）を用いて常規スクリーニングを行った。全ての流
量は１．０ｍＬ／分であり、２２０ｎｍでＵＶを検出し
た。ＳＯＡの脱アセチル化で得られる全ての生成物を同
定する目的で、水中１５％から３５％のアセトニトリル
を４０分間用いた後３５／６５のアセトニトリル／水イ
ソクラティック溶離を２０分間用いた勾配モードを使用
した。ＳＯＡ脱アセチル化のための求核剤をスクリーニ
ングする目的で、３０／７０のアセトニトリル／水を１
６分間用いた後、水中３０％から３５％のアセトニトリ
ル勾配を５分間用い、そして最後に３５／６５のアセト
ニトリル／水を用いたイソクラティック溶離を１６分間
用いた、イソクラティック溶離モードを使用した。ＳＯ
Ａ脱アセチル化に関する酵素部位化学を評価する目的
で、２５／７５のアセトニトリル／水を５５分間用いた
イソクラティック溶離モードを使用した。
（ＳＯＡ）および八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）
を伴う反応用溶離剤としてアセトニトリル／水（３５／
６５）またはアセトニトリル／水（６０／４０）のどち
らかを用いたイソクラティック（isocratic）モード使
用Supelcosil LC-18-DBカラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、
５μ）を用いて常規スクリーニングを行った。全ての流
量は１．０ｍＬ／分であり、２２０ｎｍでＵＶを検出し
た。ＳＯＡの脱アセチル化で得られる全ての生成物を同
定する目的で、水中１５％から３５％のアセトニトリル
を４０分間用いた後３５／６５のアセトニトリル／水イ
ソクラティック溶離を２０分間用いた勾配モードを使用
した。ＳＯＡ脱アセチル化のための求核剤をスクリーニ
ングする目的で、３０／７０のアセトニトリル／水を１
６分間用いた後、水中３０％から３５％のアセトニトリ
ル勾配を５分間用い、そして最後に３５／６５のアセト
ニトリル／水を用いたイソクラティック溶離を１６分間
用いた、イソクラティック溶離モードを使用した。ＳＯ
Ａ脱アセチル化に関する酵素部位化学を評価する目的
で、２５／７５のアセトニトリル／水を５５分間用いた
イソクラティック溶離モードを使用した。
【００９６】酵素的に得られる五、六または七酢酸スク
ロース類の同定。五、六または七酢酸スクロース類の画
分を下記の如く同定した。興味の持たれる化合物（類）
を、１．０ｍＬの９９．０原子％ピリジン−ｄ5の中に
溶解させた後、１．０ｍＬの９９＋原子％無水酢酸−ｄ
6を添加した。この得られる溶液を、ＴＬＣ分析（シリ
カゲル、９／１のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ）で反応が完結
したことが示されるまで、４５℃および３００ＲＰＭで
数時間振とうした。この反応混合物を真空中で蒸発させ
た後、その残渣を水で数回洗浄することにより、残存し
ているピリジン−ｄ5または無水酢酸−ｄ6を除去した。
この得られる油状固体を５ｍＬのクロロホルムの中に溶
解させた後、１ＰＳシリコンで処理した１２．５ｃｍの
Whatmann濾紙に通すことで水を除去した。クロロホルム
を蒸発させた後、その残渣を1Ｈ−ＮＭＲ分析の目的で
１／１のピリジン−ｄ5／ベンゼン−ｄ6の中に溶解させ
た。
ロース類の同定。五、六または七酢酸スクロース類の画
分を下記の如く同定した。興味の持たれる化合物（類）
を、１．０ｍＬの９９．０原子％ピリジン−ｄ5の中に
溶解させた後、１．０ｍＬの９９＋原子％無水酢酸−ｄ
6を添加した。この得られる溶液を、ＴＬＣ分析（シリ
カゲル、９／１のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ）で反応が完結
したことが示されるまで、４５℃および３００ＲＰＭで
数時間振とうした。この反応混合物を真空中で蒸発させ
た後、その残渣を水で数回洗浄することにより、残存し
ているピリジン−ｄ5または無水酢酸−ｄ6を除去した。
この得られる油状固体を５ｍＬのクロロホルムの中に溶
解させた後、１ＰＳシリコンで処理した１２．５ｃｍの
Whatmann濾紙に通すことで水を除去した。クロロホルム
を蒸発させた後、その残渣を1Ｈ−ＮＭＲ分析の目的で
１／１のピリジン−ｄ5／ベンゼン−ｄ6の中に溶解させ
た。
【００９７】酵素沈澱。Novoから供給された２５ｍＬの
アルカラーゼ溶液に３７．５ｍＬの冷アセトン（−２０
℃）を添加することによってアルカラーゼを調製した。
水系アセトンをデカンテーションで除き、そしてその残
渣を２５ｍＬのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．
０）の中に溶解させた。ＮａＯＨ希釈溶液を数滴用いて
この溶液のｐＨを９．０に調整した。この緩衝させたア
ルカラーゼ溶液に冷アセトン（−２０℃の３７．５ｍ
Ｌ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗を
用いて濾過することで沈澱物を集めた後、２ミリトール
で一晩乾燥させた。この得られるペレットを微粉末に粉
砕した後、飽和炭酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）
４℃で２４時間貯蔵した。
アルカラーゼ溶液に３７．５ｍＬの冷アセトン（−２０
℃）を添加することによってアルカラーゼを調製した。
水系アセトンをデカンテーションで除き、そしてその残
渣を２５ｍＬのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．
０）の中に溶解させた。ＮａＯＨ希釈溶液を数滴用いて
この溶液のｐＨを９．０に調整した。この緩衝させたア
ルカラーゼ溶液に冷アセトン（−２０℃の３７．５ｍ
Ｌ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗を
用いて濾過することで沈澱物を集めた後、２ミリトール
で一晩乾燥させた。この得られるペレットを微粉末に粉
砕した後、飽和炭酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）
４℃で２４時間貯蔵した。
【００９８】市販の粉末酵素類のｐＨを下記の方法で調
整した。酵素（３ｇ）を２５ｍＬの適当な緩衝液の中に
溶解させた後、希釈ＮａＯＨまたはクエン酸／燐酸溶液
でｐＨを調整した。冷アセトン（（−２０℃の３７．５
ｍＬ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗
上に沈澱物を集めた後、２ミリトールで一晩乾燥させ
た。この蛋白質ペレットを微粉末に粉砕した後、飽和炭
酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）４℃で２４時間平
衡にした。
整した。酵素（３ｇ）を２５ｍＬの適当な緩衝液の中に
溶解させた後、希釈ＮａＯＨまたはクエン酸／燐酸溶液
でｐＨを調整した。冷アセトン（（−２０℃の３７．５
ｍＬ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗
上に沈澱物を集めた後、２ミリトールで一晩乾燥させ
た。この蛋白質ペレットを微粉末に粉砕した後、飽和炭
酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）４℃で２４時間平
衡にした。
【００９９】酵素固定化。１８ｍＬの水の中に９００ｍ
ｇの緩衝させたアルカラーゼが入っている溶液のｐＨを
希釈ＮａＯＨで９．０に調整した。ハイフロスーパーセ
ル（６ｇ）を加えた後、このスラリーを完全混合した。
この混合物を２ミリトールの真空下で一晩乾燥させた
後、飽和硫酸アンモニウム水溶液上（ＲＨ：８２％）で
２４時間貯蔵した。蛋白質溶液を燐酸ナトリウムでｐＨ
７．０に調整する以外は同様にしてリパーゼＡＹ３０の
固定化を行った。
ｇの緩衝させたアルカラーゼが入っている溶液のｐＨを
希釈ＮａＯＨで９．０に調整した。ハイフロスーパーセ
ル（６ｇ）を加えた後、このスラリーを完全混合した。
この混合物を２ミリトールの真空下で一晩乾燥させた
後、飽和硫酸アンモニウム水溶液上（ＲＨ：８２％）で
２４時間貯蔵した。蛋白質溶液を燐酸ナトリウムでｐＨ
７．０に調整する以外は同様にしてリパーゼＡＹ３０の
固定化を行った。
【０１００】ＳＯＡ脱アセチル化のための酵素および溶
媒スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連
続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素
の１００ｍｇと、有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの
八酢酸スクロース（ＳＯＡ）の１．０ｍＬを仕込んだ。
５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調
節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養し
た。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して
遠心分離にかけた。その上澄み液を集めてＮ2流下で蒸
発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中
で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析
した。
媒スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連
続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素
の１００ｍｇと、有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの
八酢酸スクロース（ＳＯＡ）の１．０ｍＬを仕込んだ。
５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調
節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養し
た。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して
遠心分離にかけた。その上澄み液を集めてＮ2流下で蒸
発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中
で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析
した。
【０１０１】酵素的ＳＯＡ脱アセチル化による七酢酸ス
クロース類の合成 方法Ａ（プロレザー、リパーゼＩＩ型、リパーゼＡＰ１
２、ＳＰ−４３５リパーゼまたはアルカラーゼ）：ＳＯ
Ａの０．２０３ｇ（０．３ミリモル）を１５ｍＬのジイ
ソプロピルエーテルの中に溶解させた後、該加水分解酵
素を１．５ｇ添加した。この反応混合物の音波処理（５
秒間）を行った後、４５℃および３００ＲＰＭにセット
した回転振とう器の中に６日間入れた。この酵素を濾過
で除去してアセトニトリルで洗浄した。濾液／洗浄液を
一緒にして減圧下で蒸発させた後、その残渣を、溶離剤
としてヘキサン／酢酸エチル（２／３）を用いたシリカ
ゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィ
ーにかけた。蒸発させることで、相当する七酢酸スクロ
ース類がそれぞれ４０ｍｇ（アルカラーゼ）、３９ｍｇ
（リパーゼＩＩ型）、３４ｍｇ（リパーゼＡＰ１２）、
１１ｍｇ（ＳＰ−４３５リパーゼ）および６０ｍｇ（プ
ロレザー）得られた。
クロース類の合成 方法Ａ（プロレザー、リパーゼＩＩ型、リパーゼＡＰ１
２、ＳＰ−４３５リパーゼまたはアルカラーゼ）：ＳＯ
Ａの０．２０３ｇ（０．３ミリモル）を１５ｍＬのジイ
ソプロピルエーテルの中に溶解させた後、該加水分解酵
素を１．５ｇ添加した。この反応混合物の音波処理（５
秒間）を行った後、４５℃および３００ＲＰＭにセット
した回転振とう器の中に６日間入れた。この酵素を濾過
で除去してアセトニトリルで洗浄した。濾液／洗浄液を
一緒にして減圧下で蒸発させた後、その残渣を、溶離剤
としてヘキサン／酢酸エチル（２／３）を用いたシリカ
ゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィ
ーにかけた。蒸発させることで、相当する七酢酸スクロ
ース類がそれぞれ４０ｍｇ（アルカラーゼ）、３９ｍｇ
（リパーゼＩＩ型）、３４ｍｇ（リパーゼＡＰ１２）、
１１ｍｇ（ＳＰ−４３５リパーゼ）および６０ｍｇ（プ
ロレザー）得られた。
【０１０２】方法Ｂ（リパーゼＡＹ３０）：ＳＯＡの
０．１７０ｇ（０．２５ミリモル）を５ｍＬのｔ−ブチ
ルメチルエーテルの中に溶解させた後、０．５ｇのリパ
ーゼＡＹ３０を添加した。この反応混合物を方法Ａと同
じ条件下で処理した後、後処理することにより、４３ｍ
ｇの七酢酸スクロース類が得られた。
０．１７０ｇ（０．２５ミリモル）を５ｍＬのｔ−ブチ
ルメチルエーテルの中に溶解させた後、０．５ｇのリパ
ーゼＡＹ３０を添加した。この反応混合物を方法Ａと同
じ条件下で処理した後、後処理することにより、４３ｍ
ｇの七酢酸スクロース類が得られた。
【０１０３】６−ＰＡＳの合成：ジイソプロピルエーテ
ル中のアルカラーゼを用いたＳＯＡの脱アセチル化。Ｓ
ＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモル）を１００ｍＬのジイソ
プロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、アル
カラーゼ（１０ｇ、ｐＨ９の緩衝液から沈澱させた）を
加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物
を４５℃および３００ＲＰＭで４日間振とうした。この
酵素を濾過で除去してアセトニトリル（１００ｍＬ）で
洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発
させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（２３ｘ２．
５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。ヘキサン／
酢酸エチル（２／３）で溶離させることにより、２，
３，４，６，１’，３’，４’−と２，３，４，６，
３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの
混合物（１／７）が３６０ｍｇ得られた。続けてヘキサ
ン／酢酸エチル（１／４）で溶離させることにより、
２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルス
クロースが８６ｍｇ得られた。最後に、５００ｍＬの酢
酸エチルで溶離させることにより、４−ＰＡＳと６−Ｐ
ＡＳの混合物が４０ｍｇ得られた。シリカゲルクロマト
グラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用いヘキサン／酢酸
エチル（１／９）で溶離させることで五酢酸スクロース
を精製することにより、６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
ル中のアルカラーゼを用いたＳＯＡの脱アセチル化。Ｓ
ＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモル）を１００ｍＬのジイソ
プロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、アル
カラーゼ（１０ｇ、ｐＨ９の緩衝液から沈澱させた）を
加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物
を４５℃および３００ＲＰＭで４日間振とうした。この
酵素を濾過で除去してアセトニトリル（１００ｍＬ）で
洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発
させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（２３ｘ２．
５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。ヘキサン／
酢酸エチル（２／３）で溶離させることにより、２，
３，４，６，１’，３’，４’−と２，３，４，６，
３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの
混合物（１／７）が３６０ｍｇ得られた。続けてヘキサ
ン／酢酸エチル（１／４）で溶離させることにより、
２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルス
クロースが８６ｍｇ得られた。最後に、５００ｍＬの酢
酸エチルで溶離させることにより、４−ＰＡＳと６−Ｐ
ＡＳの混合物が４０ｍｇ得られた。シリカゲルクロマト
グラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用いヘキサン／酢酸
エチル（１／９）で溶離させることで五酢酸スクロース
を精製することにより、６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
【０１０４】６−ＰＡＳの合成：メタノールが入ってい
るジイソプロピルエーテル中のプロレザーに触媒させた
ＳＯＡの脱アセチル化。ＳＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモ
ル）を、１Ｍのメタノールが入っている１００ｍＬのジ
イソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、
プロレザー（５ｇ、ｐＨ１０の緩衝液から沈澱させた）
を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合
物を４５℃および３００ＲＰＭで振とうした。２日後、
５ｇのプロレザーを添加して更に３日間この混合物の振
とうを行った。この酵素を濾過で除去してアセトニトリ
ル（１００ｍＬ）で洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒
にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲル
カラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーに
かけた。ヘキサン／酢酸エチル（２／３）で溶離させる
ことにより、２，３，４，６，１’，３’，４’−と
２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロースの混合物（１／７）が５７９ｍｇ得られ
た。続けてヘキサン／酢酸エチル（１／４）で溶離させ
ることにより、２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−
Ｏ−アセチルスクロースが２０５ｍｇ得られた。最後
に、５００ｍＬの酢酸エチルで溶離させることにより、
五酢酸スクロース類の混合物が８６ｍｇ得られた。シリ
カゲルクロマトグラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用い
ヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで五
酢酸スクロースを精製することにより、６−ＰＡＳが２
４ｍｇ得られた。
るジイソプロピルエーテル中のプロレザーに触媒させた
ＳＯＡの脱アセチル化。ＳＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモ
ル）を、１Ｍのメタノールが入っている１００ｍＬのジ
イソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、
プロレザー（５ｇ、ｐＨ１０の緩衝液から沈澱させた）
を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合
物を４５℃および３００ＲＰＭで振とうした。２日後、
５ｇのプロレザーを添加して更に３日間この混合物の振
とうを行った。この酵素を濾過で除去してアセトニトリ
ル（１００ｍＬ）で洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒
にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲル
カラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーに
かけた。ヘキサン／酢酸エチル（２／３）で溶離させる
ことにより、２，３，４，６，１’，３’，４’−と
２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセ
チルスクロースの混合物（１／７）が５７９ｍｇ得られ
た。続けてヘキサン／酢酸エチル（１／４）で溶離させ
ることにより、２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−
Ｏ−アセチルスクロースが２０５ｍｇ得られた。最後
に、５００ｍＬの酢酸エチルで溶離させることにより、
五酢酸スクロース類の混合物が８６ｍｇ得られた。シリ
カゲルクロマトグラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用い
ヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで五
酢酸スクロースを精製することにより、６−ＰＡＳが２
４ｍｇ得られた。
【０１０５】６−ＰＡＳの合成：ジイソプロピルエーテ
ル中のリパーゼＡＰ１２に触媒させた２，３，４，６，
３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースの脱アセ
チル化。２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−ア
セチルスクロース（０．０５５ｇ、０．０９２ミリモ
ル）を、８ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解さ
せた。この溶液に、リパーゼＡＰ１２（０．８ｇ、ｐＨ
６の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処
理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００Ｒ
ＰＭで２０時間振とうした。この酵素を濾過で除去して
アセトニトリルで洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒に
して減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカ
ラム（１０ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにか
け、ヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させること
で６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
ル中のリパーゼＡＰ１２に触媒させた２，３，４，６，
３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースの脱アセ
チル化。２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−ア
セチルスクロース（０．０５５ｇ、０．０９２ミリモ
ル）を、８ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解さ
せた。この溶液に、リパーゼＡＰ１２（０．８ｇ、ｐＨ
６の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処
理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００Ｒ
ＰＭで２０時間振とうした。この酵素を濾過で除去して
アセトニトリルで洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒に
して減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカ
ラム（１０ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにか
け、ヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させること
で６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
【０１０６】アルカラーゼ、プロレザーまたはリパーゼ
ＡＰ１２に触媒させたＳＯＡ脱アセチル化のための求核
剤スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連
続して、記述した如く調製した粉末酵素を１００ｍｇ、
そしてジイソプロピルエーテルの中に溶解させた２０ｍ
Ｍの八酢酸スクロース（ＳＯＡ）と２００ｍＭの求核剤
を１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小
びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００
ＲＰＭで６６時間培養した。この反応混合物の一定分量
２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み
液を集めてＮ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μ
Ｌのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１
０μＬをＨＰＬＣで分析した。
ＡＰ１２に触媒させたＳＯＡ脱アセチル化のための求核
剤スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連
続して、記述した如く調製した粉末酵素を１００ｍｇ、
そしてジイソプロピルエーテルの中に溶解させた２０ｍ
Ｍの八酢酸スクロース（ＳＯＡ）と２００ｍＭの求核剤
を１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小
びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００
ＲＰＭで６６時間培養した。この反応混合物の一定分量
２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み
液を集めてＮ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μ
Ｌのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１
０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１０７】酵素活性に対する濃度の効果をスクリーニ
ングする目的で、この求核剤濃度を０から２００ｍＭで
変化させる以外は同じプロトコルに従った。
ングする目的で、この求核剤濃度を０から２００ｍＭで
変化させる以外は同じプロトコルに従った。
【０１０８】八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）の合
成。１００ｍＬのピリジンの中に１０．２７ｇ（３０．
０ミリモル）のスクロースが入っている懸濁液を撹拌し
ながら還流にまで加熱した。約７５分後、溶解していな
いスクロースが若干入っている半透明の溶液が得られ、
これを周囲温度にまで冷却した後、４６．９ｍＬ（３６
２．７ミリモル、５１％過剰）の無水プロピオン酸を一
度に加えることで処理した。初期の発熱で４５−４６℃
になった後、この反応混合物を周囲温度で１９時間撹拌
した。ＴＬＣ分析（シリカゲル、ジエチルエーテル／ア
セトン、４／１）で、この反応が完了したことが示され
た。この混合物を真空中で蒸発させることでシロップ状
物を残存させ、これをトルエンの中に溶解させた後、３
回再蒸発させることで、できるだけ多くのピリジンを除
去した。このシロップ状物を１００ｍＬの塩化メチレン
の中に溶解させそして連続して２５ｍＬの水、１００ｍ
Ｌの１％ＮａＨＣＯ3そして２５ｍＬの水で洗浄するこ
とにより、残存しているピリジンおよび／またはプロピ
オン酸を除去した。ＭｇＳＯ4上で乾燥しそして濾過し
た後、塩化メチレンを蒸発させることでほとんど無色の
シロップ状物を残存させたが、これは、周囲温度で数日
後にゆっくりと結晶化して白色のワックス状固体を生じ
た。Supelcosil LC-18-DB逆相カラムを使用したＨＰＬ
Ｃ分析で６０／４０アセトニトリル／水を用いたイソク
ラティック溶離を行うことにより、Ｒt＝２２．９分で
あることが示され、純度は９８．６％であると見積もら
れた。Ｃ36Ｈ54Ｏ19に関する分析：理論値Ｃ：５４．６
８；Ｈ：６．８８；測定値Ｃ：５４．２３；Ｈ：６．８
０。
成。１００ｍＬのピリジンの中に１０．２７ｇ（３０．
０ミリモル）のスクロースが入っている懸濁液を撹拌し
ながら還流にまで加熱した。約７５分後、溶解していな
いスクロースが若干入っている半透明の溶液が得られ、
これを周囲温度にまで冷却した後、４６．９ｍＬ（３６
２．７ミリモル、５１％過剰）の無水プロピオン酸を一
度に加えることで処理した。初期の発熱で４５−４６℃
になった後、この反応混合物を周囲温度で１９時間撹拌
した。ＴＬＣ分析（シリカゲル、ジエチルエーテル／ア
セトン、４／１）で、この反応が完了したことが示され
た。この混合物を真空中で蒸発させることでシロップ状
物を残存させ、これをトルエンの中に溶解させた後、３
回再蒸発させることで、できるだけ多くのピリジンを除
去した。このシロップ状物を１００ｍＬの塩化メチレン
の中に溶解させそして連続して２５ｍＬの水、１００ｍ
Ｌの１％ＮａＨＣＯ3そして２５ｍＬの水で洗浄するこ
とにより、残存しているピリジンおよび／またはプロピ
オン酸を除去した。ＭｇＳＯ4上で乾燥しそして濾過し
た後、塩化メチレンを蒸発させることでほとんど無色の
シロップ状物を残存させたが、これは、周囲温度で数日
後にゆっくりと結晶化して白色のワックス状固体を生じ
た。Supelcosil LC-18-DB逆相カラムを使用したＨＰＬ
Ｃ分析で６０／４０アセトニトリル／水を用いたイソク
ラティック溶離を行うことにより、Ｒt＝２２．９分で
あることが示され、純度は９８．６％であると見積もら
れた。Ｃ36Ｈ54Ｏ19に関する分析：理論値Ｃ：５４．６
８；Ｈ：６．８８；測定値Ｃ：５４．２３；Ｈ：６．８
０。
【０１０９】ヘプタン中のＳＯＰ脱アシル化のための酵
素スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連
続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素
を１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０ｍ
Ｍの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍＭ
のブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理し
た後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振と
う器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合
物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけ
た。その上澄み液を集めて、この溶液の１０μＬをＨＰ
ＬＣで分析した。
素スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連
続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素
を１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０ｍ
Ｍの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍＭ
のブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理し
た後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振と
う器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合
物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけ
た。その上澄み液を集めて、この溶液の１０μＬをＨＰ
ＬＣで分析した。
【０１１０】ＳＯＰ脱アシル化のための溶媒スクリーニ
ング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述
した如きリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩ
Ｉを１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０
ｍＭの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍ
Ｍのブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理
した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振
とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混
合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけ
た。その上澄み液を集めて、Ｎ2流下で蒸発させた。こ
の残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した
後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
ング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述
した如きリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩ
Ｉを１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０
ｍＭの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍ
Ｍのブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理
した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振
とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混
合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけ
た。その上澄み液を集めて、Ｎ2流下で蒸発させた。こ
の残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した
後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１１１】ここで用いる言葉「１’−酢酸スクロー
ス」、「４’−酢酸スクロース」、「６’−酢酸スクロ
ース」、「４−酢酸スクロース」および「６−酢酸スク
ロース」は、オクタ−、ヘプタ−またはヘキサ−Ｏ−ア
セチルスクロース類を表しており、ここで、示した位置
にアセチル置換基が含まれており、その残りのアセチル
置換基の位置に関する特別な指示はない。
ス」、「４’−酢酸スクロース」、「６’−酢酸スクロ
ース」、「４−酢酸スクロース」および「６−酢酸スク
ロース」は、オクタ−、ヘプタ−またはヘキサ−Ｏ−ア
セチルスクロース類を表しており、ここで、示した位置
にアセチル置換基が含まれており、その残りのアセチル
置換基の位置に関する特別な指示はない。
【０１１２】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
ある。
【０１１３】１． 少なくとも６個のエステル基を有す
るスクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化によるス
クロースの部分アシル化誘導体の製造方法において、こ
のスクロースエステルを溶解し得る有機溶媒を含む無水
反応溶媒の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタア
シル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから
成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スク
ロースエステルの脱アシル化を触媒し得る加水分解酵素
または加水分解酵素類の組み合わせで処理することによ
り、予め選択した一の位置または複数の位置においてそ
の出発スクロースエステルよりも少なくとも１個多い遊
離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロ
ース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル
化スクロース誘導体を回収することを含む方法。
るスクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化によるス
クロースの部分アシル化誘導体の製造方法において、こ
のスクロースエステルを溶解し得る有機溶媒を含む無水
反応溶媒の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタア
シル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから
成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スク
ロースエステルの脱アシル化を触媒し得る加水分解酵素
または加水分解酵素類の組み合わせで処理することによ
り、予め選択した一の位置または複数の位置においてそ
の出発スクロースエステルよりも少なくとも１個多い遊
離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロ
ース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル
化スクロース誘導体を回収することを含む方法。
【０１１４】２． 該スクロースエステルがスクロース
アルカノエート、スクロースα−ハロアルカノエートま
たはスクローストリハロアルカノエートであり、ここ
で、このアルカノエート部分が８個以下の炭素原子を有
している第１項の方法。
アルカノエート、スクロースα−ハロアルカノエートま
たはスクローストリハロアルカノエートであり、ここ
で、このアルカノエート部分が８個以下の炭素原子を有
している第１項の方法。
【０１１５】３． 該スクロースエステルが酢酸スクロ
ース類、プロピオン酸スクロース類、ｎ−もしくはｓ−
酪酸スクロース類、クロロ酢酸スクロース類、フルオロ
酢酸スクロース類、トリクロロ酢酸スクロース類および
トリフルオロ酢酸スクロース類から成る群から選択され
る第２項の方法。
ース類、プロピオン酸スクロース類、ｎ−もしくはｓ−
酪酸スクロース類、クロロ酢酸スクロース類、フルオロ
酢酸スクロース類、トリクロロ酢酸スクロース類および
トリフルオロ酢酸スクロース類から成る群から選択され
る第２項の方法。
【０１１６】４． 該スクロースエステルが八酢酸スク
ロース、七酢酸スクロース、六酢酸スクロース、八プロ
ピオン酸スクロース、七プロピオン酸スクロースまたは
六プロピオン酸スクロースである第３項の方法。
ロース、七酢酸スクロース、六酢酸スクロース、八プロ
ピオン酸スクロース、七プロピオン酸スクロースまたは
六プロピオン酸スクロースである第３項の方法。
【０１１７】５． 該酵素がリパーゼ、プロテアーゼ、
エステラーゼまたはアミラーゼである第１項の方法。
エステラーゼまたはアミラーゼである第１項の方法。
【０１１８】６． 該酵素がリパーゼＡＹ３０、ＳＰ−
４３５リパーゼ、プロテアーゼＮ、リパーゼＩＩ型、ア
ルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２、プロテア
ーゼＸＸＩＩＩ型、プロテアーゼＭ、リパーゼＶＩＩ
型、プロテアーゼＸＩＩＩ型、ビオチームＳ、プロテア
ーゼ２Ａ、リパーゼＣＥ、ＰＣリパーゼおよびＭＭリパ
ーゼから成る群から選択される第５項の方法。
４３５リパーゼ、プロテアーゼＮ、リパーゼＩＩ型、ア
ルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２、プロテア
ーゼＸＸＩＩＩ型、プロテアーゼＭ、リパーゼＶＩＩ
型、プロテアーゼＸＩＩＩ型、ビオチームＳ、プロテア
ーゼ２Ａ、リパーゼＣＥ、ＰＣリパーゼおよびＭＭリパ
ーゼから成る群から選択される第５項の方法。
【０１１９】７． 該有機溶媒が炭化水素、エーテル、
ケトン、エステル、アルコールまたはハロゲン化炭化水
素である第１項の方法。
ケトン、エステル、アルコールまたはハロゲン化炭化水
素である第１項の方法。
【０１２０】８． 該有機溶媒がトルエン、ジイソプロ
ピルエーテル、四塩化炭素、エチレングリコールジメチ
ルおよびジエチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、
アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキサノ
ン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエチル
エーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサノー
ル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタノ
ン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエーテ
ル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテ
ル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトー
ル、ヘキサン、ヘプタン、オクタンおよびシクロヘキサ
ンから成る群から選択される１員である第７項の方法。
ピルエーテル、四塩化炭素、エチレングリコールジメチ
ルおよびジエチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、
アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキサノ
ン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエチル
エーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサノー
ル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタノ
ン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエーテ
ル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテ
ル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトー
ル、ヘキサン、ヘプタン、オクタンおよびシクロヘキサ
ンから成る群から選択される１員である第７項の方法。
【０１２１】９． 該有機溶媒がジイソプロピルエーテ
ル、エチレングリコールジエチルエーテル、ｔ−ブチル
メチルエーテル、３−ヘプタノン、ジプロピルエーテ
ル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテ
ル、クロロホルム、２，２，５，５−テトラメチルＴＨ
Ｆ、トルエン、四塩化炭素、酢酸ｎ−ブチル、ベンゼン
またはアニソールである第８項の方法。
ル、エチレングリコールジエチルエーテル、ｔ−ブチル
メチルエーテル、３−ヘプタノン、ジプロピルエーテ
ル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテ
ル、クロロホルム、２，２，５，５−テトラメチルＴＨ
Ｆ、トルエン、四塩化炭素、酢酸ｎ−ブチル、ベンゼン
またはアニソールである第８項の方法。
【０１２２】１０． 該反応媒体がまた有機求核剤を含
んでおり、ここで、この求核剤が、アルコール類、アミ
ン類、アミノアルコール類、チオール類およびオキシム
類から成る群から選択される１員である第１項の方法。
んでおり、ここで、この求核剤が、アルコール類、アミ
ン類、アミノアルコール類、チオール類およびオキシム
類から成る群から選択される１員である第１項の方法。
【０１２３】１１． 該求核剤がメタノール、エタノー
ル、プロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、
シクロヘキシルメタノール、フェネチルアルコールおよ
びジイソプロピルアミンから成る群から選択される１員
である第１０項の方法。
ル、プロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、
シクロヘキシルメタノール、フェネチルアルコールおよ
びジイソプロピルアミンから成る群から選択される１員
である第１０項の方法。
【０１２４】１２． 該求核剤がメタノール、ｎ−ブタ
ノール、ジイソプロピルアミンまたはフェネチルアルコ
ールである第１１項の方法。
ノール、ジイソプロピルアミンまたはフェネチルアルコ
ールである第１１項の方法。
【０１２５】１３． ＳＰ−４３５リパーゼ、プロテア
ーゼＮ、アルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２
から成る群から選択される酵素類の組み合わせで八酢酸
スクロースを同時もしくは逐次的に処理することを含
み、ここで、上記組み合わせは、該八酢酸スクロースの
４−、１’−および６’−位または６−、１’−および
６’−位のエステル基を脱アセチル化する目的で選択さ
れ、そしてこのようにして生じさせた６，２，３，
３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースまたは
４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロ
ースか或はこれらの両方を回収することを含む第１項の
方法。
ーゼＮ、アルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２
から成る群から選択される酵素類の組み合わせで八酢酸
スクロースを同時もしくは逐次的に処理することを含
み、ここで、上記組み合わせは、該八酢酸スクロースの
４−、１’−および６’−位または６−、１’−および
６’−位のエステル基を脱アセチル化する目的で選択さ
れ、そしてこのようにして生じさせた６，２，３，
３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースまたは
４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロ
ースか或はこれらの両方を回収することを含む第１項の
方法。
【０１２６】１４． １’−酢酸スクロースをアルカラ
ーゼで処理することによりこの１’−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ーゼで処理することによりこの１’−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２７】１５． １’−酢酸スクロースをプロレザ
ーで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱
アセチル化することを含む第１項の方法。
ーで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱
アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２８】１６． １’−酢酸スクロースをプロテア
ーゼＮで処理することによりこの１’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ーゼＮで処理することによりこの１’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２９】１７． ４’−酢酸スクロースをプロテア
ーゼＮで処理することによりこの４’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ーゼＮで処理することによりこの４’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３０】１８． ６’−酢酸スクロースをプロテア
ーゼＮで処理することによりこの６’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ーゼＮで処理することによりこの６’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３１】１９． １’−酢酸スクロースをリパーゼ
ＡＹ３０で処理することによりこの１’−位のエステル
基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ＡＹ３０で処理することによりこの１’−位のエステル
基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３２】２０． ４’−酢酸スクロースをリパーゼ
ＡＹ３０で処理することによりこの４’−位のエステル
基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ＡＹ３０で処理することによりこの４’−位のエステル
基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３３】２１． ６’−酢酸スクロースをＳＰ−４
３５リパーゼで処理することによりこの６’−位のエス
テル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
３５リパーゼで処理することによりこの６’−位のエス
テル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３４】２２． ４−酢酸スクロースをリパーゼＡ
Ｐ１２で処理することによりこの４−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
Ｐ１２で処理することによりこの４−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３５】２３． ６−酢酸スクロースをリパーゼＡ
Ｐ１２で処理することによりこの６−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
Ｐ１２で処理することによりこの６−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３６】２４． （ａ）アルカラーゼまたはプロレ
ザーで八酢酸スクロースを処理することにより２，３，
４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスク
ロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−
Ｏ−アセチルスクロースとの混合物を生じさせ、そして
（ｂ）段階（ａ）の生成物をアルカラーゼまたはプロレ
ザーで処理することにより２，３，４，６，３’，４’
−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる、段階
を含む第１項の方法。
ザーで八酢酸スクロースを処理することにより２，３，
４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスク
ロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−
Ｏ−アセチルスクロースとの混合物を生じさせ、そして
（ｂ）段階（ａ）の生成物をアルカラーゼまたはプロレ
ザーで処理することにより２，３，４，６，３’，４’
−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる、段階
を含む第１項の方法。
【０１３７】２５． 段階（ｂ）の生成物を更にアルカ
ラーゼまたはプロレザーで処理することにより２，３，
６，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと
２，３，４，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロ
ースを生じさせる第２４項の方法。
ラーゼまたはプロレザーで処理することにより２，３，
６，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと
２，３，４，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロ
ースを生じさせる第２４項の方法。
【０１３８】２６． 段階（ｂ）の生成物を更にリパー
ゼＡＰ１２で処理することにより２，３，６，３’，
４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，
３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさ
せる第２４項の方法。
ゼＡＰ１２で処理することにより２，３，６，３’，
４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，
３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさ
せる第２４項の方法。
【０１３９】２７． 該有機溶媒がエーテルである第２
４項の方法。
４項の方法。
【０１４０】２８． 該有機溶媒がエーテルである第２
５項の方法。
５項の方法。
【０１４１】２９． 該有機溶媒がエーテルである第２
６項の方法。
６項の方法。
【０１４２】３０． 該反応媒体がエーテルとアルコー
ルの混合物である第２７項の方法。
ルの混合物である第２７項の方法。
【０１４３】３１． 該反応媒体がエーテルとアルコー
ルの混合物である第２８項の方法。
ルの混合物である第２８項の方法。
【０１４４】３２． 該反応媒体がエーテルとアルコー
ルの混合物である第２９項の方法。
ルの混合物である第２９項の方法。
【０１４５】３３． ６’−酢酸スクロースをアルカラ
ーゼで処理することによりこの６’−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ーゼで処理することによりこの６’−位のエステル基を
脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１４６】３４． ６’−酢酸スクロースをプロレザ
ーで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱
アセチル化することを含む第１項の方法。
ーで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱
アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１４７】３５． ４’−酢酸スクロースをリパーゼ
ＩＩ型で処理することによりこの４’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
ＩＩ型で処理することによりこの４’−位のエステル基
を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フエルナンド・テラダス フランス・74500エビアン−レ−バン・リ ユナシヨナル88
Claims (1)
- 【請求項１】 少なくとも６個のエステル基を有するス
クロースエステル類の酵素触媒脱アシル化によるスクロ
ースの部分アシル化誘導体の製造方法において、このス
クロースエステルを溶解し得る有機溶媒を含む無水反応
溶媒の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル
化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る
群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロー
スエステルの脱アシル化を触媒し得る加水分解酵素また
は加水分解酵素類の組み合わせで処理することにより、
予め選択した一の位置または複数の位置においてその出
発スクロースエステルよりも少なくとも１個多い遊離ヒ
ドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース
誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化ス
クロース誘導体を回収することを含む方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1218293A | 1993-02-02 | 1993-02-02 | |
| US012182 | 1993-10-07 | ||
| US08/133,725 US5445951A (en) | 1993-02-02 | 1993-10-07 | Regioselective enzymatic deacylation of sucrose esters in anhydrous organic media |
| US133725 | 1993-10-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343485A true JPH06343485A (ja) | 1994-12-20 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03092794A Expired - Fee Related JP3994224B2 (ja) | 1993-02-02 | 1994-02-02 | 無水有機媒体内におけるスクロースエステル類の部位選択的酵素脱アシル化 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3994224B2 (ja) |
| TW (1) | TW301673B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011111457A (ja) * | 2009-11-26 | 2011-06-09 | National Taiwan Univ | 樟芝の抗ガン活性物質、製備方法およびその用途 |
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|---|---|---|---|---|
| ATE478960T1 (de) * | 2001-02-21 | 2010-09-15 | Dsm Ip Assets Bv | Verfahren zur herstellung eines vitamin e - zwischenproduktes |
| EP1940858A4 (en) * | 2005-09-22 | 2009-06-17 | Vb Medicare Pvt Ltd | CATALYZED DESACYLATION BY ENZYMES OF CHLORINATED SUGAR DERIVATIVES |
| US20100009917A1 (en) * | 2007-02-22 | 2010-01-14 | Novo Nordisk Health Care Ag | Modulating Enzymatic Processes by Addition of Diolcontaining Substances |
| CN106047744B (zh) * | 2016-05-06 | 2019-09-24 | 杭州鑫富科技有限公司 | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2634497B1 (fr) * | 1988-07-20 | 1992-02-28 | Beghin Say Sa | Nouveau procede d'obtention de derives du saccharose modifies en position 4(prime) |
| GB8822673D0 (en) * | 1988-09-27 | 1988-11-02 | Tate & Lyle Plc | Selective acylation of sugars |
| GB8822674D0 (en) * | 1988-09-27 | 1988-11-02 | Tate & Lyle Plc | Preparation of acylated sucrose derivatives |
-
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- 1993-10-07 US US08/133,725 patent/US5445951A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-02-01 EP EP94300734A patent/EP0610063B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1994-04-22 TW TW083103571A patent/TW301673B/zh active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011111457A (ja) * | 2009-11-26 | 2011-06-09 | National Taiwan Univ | 樟芝の抗ガン活性物質、製備方法およびその用途 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US5445951A (en) | 1995-08-29 |
| EP0610063B1 (en) | 2000-05-03 |
| TW301673B (ja) | 1997-04-01 |
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