JP3994224B2 - 無水有機媒体内におけるスクロースエステル類の部位選択的酵素脱アシル化 - Google Patents
無水有機媒体内におけるスクロースエステル類の部位選択的酵素脱アシル化 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、無水有機溶媒中で酵素類を用いて部位選択的にスクロースエステル類を脱アシル化する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
人工甘味料である４，１’，６’−トリクロロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロース（「スクラロース（sucralose）」）は、スクロースを用いこれの４，１’および６’位のヒドロキシルを塩素で置換することによって誘導される。（この甘味料の製造方法において、その４位の立体配置が反転している、従ってこの化合物はガラクトスクロースである）。これらの塩素原子をその所望の位置にのみ向かわせるのが主要な合成上の課題である、と言うのは、置換されるヒドロキシルは異なる反応性を示し、その２つは第一級でありそして１つは第二級であるからである。その最終生成物の６位にある第一級ヒドロキシルは未置換である事が、この合成を更に複雑にしている。
【０００３】
本発明は、スクロースエステル類への改良されたルートを提供するものであり、ここで、これらのエステル基は、そのスクロース分子上の予め決められた位置に結合している。１つの態様において、本発明は、スクラロースを製造する目的で用いられ得る４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース（「４−ＰＡＳ」）または６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース（「６−ＰＡＳ」）か或はこれらの両方への改良されたルートを提供する。４−ＰＡＳは容易に６−ＰＡＳに転位し、これを塩素化したあと脱アシル化することによって、スクラロースを製造することができる。
【０００４】
【発明の簡単な要約】
本発明は、スクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化によるスクロースの部分アシル化誘導体の製造方法を提供するものであり、ここで、上記方法は、無水有機媒体（本文中に定義する如き）の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで処理することにより、予め選択した一または複数の位置に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
【０００５】
【従来技術】
Bornemann他の米国特許第5,141,860号（および英国特許第2 224 504 A号）には、スクロースのオクタエステル類を水系媒体中で酵素的に脱アシル化することによって種々の部分脱アシル化スクロースエステル類を生じさせる方法が開示されている。
【０００６】
水系媒体（２相系であってもよい）内におけるオクタ−Ｏ−アセチルスクロースの酵素的加水分解によるヘプタ−、ヘキサ−および／またはペンタ−Ｏ−アセチルスクロース類の製造が、Chang他、J. Carbohydrate Chemistry、 10(2)、 251-261 (1991）およびCarbohydrate Reserach、 222、 121-129 (1991）；Kloosterman他、 J. Carbohydrate Chemistry、 8(5)、 693-704 (1989）；Mentech他、 ヨーロッパ特許第0 357 476号（1990年3月7日−フランス特許番号2 634 497号に相当）；およびOng他、 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、 2(2)、 161-164
(1992）に開示されている。
【０００７】
以下に示す文献の中に、水系媒体（２相系であってもよい）内における炭水化物エステル類の部位選択的酵素脱アシル化が一般的に開示されている。
【０００８】
H. M. Sweers他、 J. Am. Chem. Soc.、 108、 6421 (1986); W. J. Hennen他、 J. Org. Chem.、 53、 4939 (1988); J. Zemek他、 Coll. Czech. Chem. Commun.、 53、 1851 (1988); A. Ballesteros他、 Tetrahedron、 45、 7077 (1989); S. Tomic他、 Carbohydrate Res.、 210、 191 (1991)；およびK. Kefurt他、 Carbohydrate Res.、 223、 137 (1992）。
【０００９】
J. S. Dordick著「有機溶媒で用いるための酵素設計」、Biotechnol. Prog.、 1992、 No. 8、 259-267およびA. M. Klibanov著「有機溶媒中で働く酵素類」、Chemtech、 1986年6月、 354-359には、非水系で反応を触媒する酵素類を用いることで得ることが可能な利点が考察されている。
【００１０】
【発明の具体的な説明】
学術用語および省略形
本出願で用いる下記の短縮名、省略形および言葉はその指示した意味を有する。
【００１１】
スクラロース＝４，１’，６’−トリクロロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロース；
ＳＨｅｐｔａＡ＝七酢酸スクロースもしくはヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
ＳＨｅｘａＡ＝六酢酸スクロースもしくはヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；
６−ＰＡＳ＝６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース；
４−ＰＡＳ＝４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース；
４’−ＯＨヘプタアセテート＝２，３，４，６，１’，３’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
１’−ＯＨヘプタアセテート＝２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
６’−ＯＨヘプタアセテート＝２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
１’，６’−ジＯＨヘキサアセテート＝２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；
ＳＯＡ＝八酢酸スクロース；
ＳＯＰ＝八プロピオン酸スクロース；
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；
２−メチルＴＨＦ＝２−メチルテトラヒドロフラン；
２，５−ジメチルＴＨＦ＝２，５−ジメチルテトラヒドロフラン；
２，２，５，５−テトラメチルＴＨＦ＝２，２，５，５−テトラメチルテトラヒドロフラン；および
ＣＣｌ4＝四塩化炭素。
【００１２】
ここで用いる「無水」有機媒体は、この反応で用いる有機溶媒の体積を基準にして約１体積％以下の水を含んでいる有機媒体を意味することを意図しており、ここで、該酵素に結合している水は排除する。更に、この有機媒体が水に混和性を示さない化合物である場合、本発明で用いる無水有機媒体は単相である（即ち、何らかの水が存在している場合、この水は水相を生じるに充分な割合では存在していない）ことを意図している。
【００１３】
本発明の方法は、無水有機媒体の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで処理することにより、予め選択した一または複数の位置に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
【００１４】
本発明の方法で用いられ得るスクロースエステル類の中には、八−、七−および六酢酸スクロース、八−、七−および六プロピオン酸スクロース、八−、七−および六（ｎ−もしくはｓ−酪酸）スクロース、スクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（α−ハロアルカノエート類）、例えば八クロロ酢酸スクロースおよび八フルオロ酢酸スクロースなど、スクロースのトリハロアルカノエート類、例えばスクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（トリクロロアセテート）およびスクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（トリフルオロアセテート）、並びにスクロースの他のオクタ−、ヘプタ−およびヘキサアシレート類およびハロアルカノエート類があり、ここで、このアルカノエート部分は約８個以下の炭素原子を有している。
【００１５】
本発明の方法では有機溶媒を用いる。本方法を実施するに有効であることが見いだされた有機溶媒は、単独で用いられるか或は組み合わせて用いられるかに拘らず、トルエン、ジイソプロピルエーテル、四塩化炭素、エチレングリコールジメチルおよびジエチルエーテル、アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキサノン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエチルエーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタノン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトール、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、ジ−ｎ−ブチルエーテル、並びに他の環状および非環状有機溶媒であり、これらには、本発明の方法で用いるスクロースエステル基質を溶かす炭化水素（脂肪族および芳香族炭化水素の両方）、エーテル類、ケトン類、エステル類、アルコール類およびハロゲン化炭化水素が含まれる。１つの種類として、エーテル類が本発明の方法で用いるに好適な有機溶媒であることが確認された。
【００１６】
本発明の１つの好適な態様において、この反応媒体の中でまた求核剤を用いる。上記求核剤には、水（水に混和性を示さない溶媒の場合、この媒体の中に独立した水相を形成する量よりも少ない量である、さもなくばこの有機溶媒の体積を基準にして１体積％以下の量である）が含まれ、そして好適には、有機求核剤、例えばアルコール類、アミン類、アミノアルコール類、チオール類およびオキシム類が含まれる。上記有機求核剤の説明的例には、ｎ−ブタノール、メタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ジイソプロピルアミン、エチレングリコール、プロピレングリコール、２−ピペリジンエタノール、ｎ−ブチルチオール、ベンジルメルカプタン、チオフェノール、シスチン［３，３’−ジチオビス（２−アミノプロピオン酸）］、アセトアルドキシム、アセトンオキシムおよびベンズアルドキシムが含まれる。
【００１７】
本発明で用いる酵素類は加水分解酵素類、例えばリパーゼ類、プロテアーゼ類、エステラーゼ類およびアミラーゼ類である。そのスクロース部分上の予め選択した位置にあるエステル基を優先的に除去する目的で、これらの酵素類を用いる。１つの面において、酵素であるリパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea））を用いることで優先的に主に４’位のエステル基そして二次的に１’位のエステル基を除去する。プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus subtilis））を用いて優先的に１’，４’および６’位のエステル基を除去する。ブタのすい臓リパーゼを用いて優先的に４’位のエステル基を除去する。アルカラーゼ（バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis））を用いて優先的に１’位のエステル基そして二次的に６’位のエステル基を除去する。プロレザー（Proleather)（枯草菌（Bacillus subtilis））を用いて優先的に１’位のエステル基そして二次的に６’位のエステル基を除去する。リパーゼＡＰ１２（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger））を用いて優先的に４位および６位のエステル基を除去する。ＳＰ−４３５リパーゼ（カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica））を用いて優先的に主に６’位のエステル基そして二次的に１’位のエステル基を除去する。
【００１８】
本発明の方法で用いる反応媒体は、上に定義した如く無水である。存在させ得る少量の水は、この酵素を溶解させる量未満である。本発明の方法を無水媒体（本文中に定義した如き）中で実施することにより下記の利点が得られることを見い出した。
【００１９】
１． 該スクロースのオクタエステル基質の溶解性が増大すること；
２． 望まれない脱アシル化が抑制されること；
３． この脱アシル化反応の部位選択性が増強されること；
４． この酵素を固定する必要がないことからこの方法が簡単になること、例えばこの酵素は簡単な濾過でその反応混合物から除去され得ること；
５． 生成物の単離がより容易なこと、例えば単に溶媒を蒸発させることが、必要とされている全てである可能性があること；
６． 微生物学的汚染の可能性が有意に低いこと；そして
７． 酵素類を溶解させるに充分な量の水が存在していないことでこれらの酵素が示す熱安定性がより高いこと。
【００２０】
最初に、有機溶媒中でＳＯＡを部位選択的に脱アセチル化する能力に関して、幅広い種類の加水分解酵素のスクリーニングを行った。我々の初期のスクリーニング実験で評価したものの中でリパーゼＡＹ３０が有意な活性を示した。酵素活性は、この酵素を取り巻いている水の殻が最小限であることに依存している。公知の相対湿度（ＲＨ）を有する飽和塩水溶液の上でその乾燥した酵素を平衡にすることによって、この酵素、即ちそれの活性に結合している水の量を調節することができる。有機溶媒の中に入っている酵素が示す触媒力を改良する１つの方法は、正しいイオン状態でそれを用いることであることは知られている。これは一般に、この酵素の最適ｐＨにある緩衝液からこの酵素を凍結乾燥するか或は沈澱させることによって達成される。本技術における一般的教示に一致して、ｐＨを調整した緩衝液（製造業者が指定している最適ｐＨから±１のｐＨ単位）から他の酵素類の多くを沈澱させると有意な活性が得られることを見い出した（表１参照）。
【００２１】
【表１】
【００２２】
ａ） この挙げた緩衝液ｐＨは、無水溶媒内の酵素活性に最適なｐＨである。
【００２３】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００２４】
活性を示すとして同定された酵素のいくつかに関して、それらが異なる溶媒中で示す活性を評価する実験を行った。数多くの無水溶媒の中で同じ酵素に触媒させたＳＯＡ脱アセチル化実験を行った。２４時間培養した後の一定分量をＨＰＬＣで分析した。これらの溶媒実験の結果を表２−５に示すが、これらは明らかに、評価した各酵素が示す活性に対して溶媒が著しい影響を与えることを表している。
【００２５】
【表２】
【００２６】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数［Rekker著「疎水性フラグメント定数」（The Hydrophobic Fragmental Constant）、Elsevier、 Amsterdam (1977)］）。この表のlog P値は、Laane他、 Biotechnol Bioeng. 30、 81 (1987）からのものである。
【００２７】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００２８】
ｃ） 七酢酸スクロースが検出されたのはＳＯＡ中に少量の不純物が存在していたことによるものである。
【００２９】
ｄ） エタノール、ジエチルエーテルおよびエトキシエタノールに関する公知log P値から見積もった。
【００３０】
ｅ） ＴＨＦに関するlog P値に１メチル基当たり０．５単位を増分的に加えることによって見積もった。
【００３１】
ｆ） 恐らくは溶媒による他のピークがこの六酢酸スクロースピークを干渉していたことからこの値を報告しなかった。
【００３２】
【表３】
【００３３】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００３４】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこれを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００３５】
【表４】
【００３６】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００３７】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。１種の七酢酸スクロース（Ｒt：８．１分）を検出した。
【００３８】
【表５】
【００３９】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００４０】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこれを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００４１】
固定化した加水分解酵素に対する溶媒の効果
アルカラーゼおよびリパーゼＡＹ３０をハイフロスーパーセル（Hyflo Super Cell）の上に堆積させ、そしてこれを、いくつかの無水溶媒中のＳＯＡ脱アセチル化反応用触媒として用いた。両方の固定化酵素を用いた時（表６および７）、有利な溶媒効果が観察された。
【００４２】
【表６】
【００４３】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００４４】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこれを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００４５】
【表７】
【００４６】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００４７】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００４８】
加水分解酵素によるＳＯＡ脱アセチル化に関する部位化学
この研究の重要な面は、ＳＯＡの酵素的脱アセチル化で得られる全ての七、六および五酢酸スクロースの構造を明白に帰属させることであった。Rathbone E. B.、 Carbohydr. Res.、 205、 402 (1990）が記述しているのと同様にして、完全デュテリウムアセチル化した後、1Ｈ−ＮＭＲ分析することでこれらの構造の帰属を行った。リパーゼＡＹ３０およびリパーゼＩＩ型を用いた表８（以下）に示す結果を調べた結果、主要な脱アセチル化生成物は４’−ＯＨヘプタアセテートである。それとは対照的に、プロテアーゼ類であるアルカラーゼおよびプロレザーは、主に１’−位の脱アセチル化を生じさせ、そしてある程度の反応がその６’−位に生じる。リパーゼＡＰ１２を用いた脱アセチル化は、４−および６−ＯＨヘプタアセテート類の両方を生じさせる一方、カンジダ・アンタルクチカ由来のＳＰ−４３５リパーゼは、１’−ＯＨヘプタアセテートと一緒に主に６’−ＯＨヘプタアセテートを生じさせる。最後に、プロテアーゼＮは、ほとんど等モル混合物で１’−、４’−および６’−ＯＨヘプタアセテート類を生じさせる。
【００４９】
【表８】
【００５０】
ａ． ＳＯＡの脱アセチル化に関して試験して変換率が＜６％であった他の酵素類（最適なｐＨ）は下記のものである：リパーゼＣＥ（９．０）；リパーゼＡＫ（８．０）；プロテアーゼＭ（６．０）；リパーゼＭＡＰ１０（７．０）；キモトリプシン（８．０）；ＰＣリパーゼ（５．０）；ＭＭリパーゼ（１０．０）；プロテアーゼＸＸＩＩ型（８．０）。
【００５１】
ｂ． このコラムの中にｐＨを示す場合、これらの酵素は、示したｐＨの緩衝液から沈澱を生じた。この緩衝液のｐＨは、無水ジイソプロピルエーテル内の酵素活性で見いだされた最適ｐＨである。
【００５２】
ｃ． 変換率（％）は、全七−および六−酢酸スクロースの合計である。脱アセチル化は酵素が存在していない場合全く生じなかった。
【００５３】
ｄ． この分子を完全デュテリウムアセチル化した後、1Ｈ−ＮＭＲ分析することにより、各酵素反応の七酢酸スクロースの構造の帰属を行った。定量化の目的で、この表ではＨＰＬＣにおける七酢酸スクロースのピーク高を用いた。
【００５４】
ｅ． プロテアーゼＮが触媒する反応生成物に関する部位化学を、ＨＰＬＣ保持時間を基準にして割り当てた。
【００５５】
ｆ． ２，３，４，１’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの構造を下記の事実から推論した。培養している間はＨＰＬＣで２種の七酢酸スクロース類が検出されたが、カラムクロマトグラフィーにかけた後では、２，３，６，１’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルのみが得られた。恐らくは、この精製を行っている間に、起こり得る過程であることが知られている４位から６位へのアセチル移動が起こったのであろう。
【００５６】
求核剤の選択および濃度の効果
アルカラーゼ、プロレザーまたはリパーゼＡＰ１２に触媒させた同じＳＯＡ脱アセチル化を、いくつかの求核剤の存在下で実施し、その結果を表９に示す。アルカラーゼが触媒する反応では、求核剤としてメタノールまたはジイソプロピルアミンを用いることによって有意な変化率の増大が達成された（求核剤を添加していない反応に比較して少なくとも２５％上昇した）一方、プロレザーが触媒する反応では、シクロヘキサノール、ジイソプロピルアミンおよびテトラメチルピペリジンを除く添加した全ての求核剤が同様な改良を与えた。リパーゼＡＰ１２が触媒する反応は、求核剤を存在させると、中間的な変換率の改良を示した。
【００５７】
【表９】
【００５８】
ａ） この実験全体で用いた求核剤濃度は２００ｍＭである。ＳＯＡの脱アセチル化はこれらの酵素なしでは全く生じなかった。
【００５９】
ｂ） 変換率（％）（６６時間培養）を、残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スクロース類の合計で表す。
【００６０】
ｃ） ２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよびプロレザー部位化学を定義する。
【００６１】
ｄ） 反応は全く生じなかった。
【００６２】
表１０に示すように、それぞれ０．５および１．０Ｍのメタノール存在下でアルカラーゼおよびリパーゼＡＰ１２に触媒させた反応において、全体変換率に関して中程度の増強が達成された。プロレザーに触媒させた反応で１．０Ｍのメタノールを用いると、注目すべき１２０％の変換率上昇が得られた。１．０Ｍのｎ−ブタノールまたはフェネチルアルコールを用いた時も同様な結果が得られた。
【００６３】
【表１０】
【００６４】
ａ） 変換率（％）（６６時間培養）を、残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スクロース類の合計で表す。
【００６５】
ｂ） ２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよびプロレザー部位化学を定義する。
【００６６】
本発明の１つの好適な面において、上の表８に示す酵素類の組み合わせを用い、ＳＯＡの４−、１’−および６’−位または６−、１’−および６’−位のエステル基の脱アセチル化を生じさせるに適当な上記酵素類の組み合わせでＳＯＡの同時もしくは逐次的処理を行うことにより、４−ＰＡＳおよび／または６−ＰＡＳを製造した。
【００６７】
ジイソプロピルエーテル中でアルカラーゼまたはアルカラーゼ／リパーゼＡＰ１２が触媒するＳＯＡの脱アセチル化による６−ＰＡＳの合成
アルカラーゼ触媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大規模で行った。（詳細は以下の実験セクションの中に示す）。５日間培養を行った後、このアルカラーゼを濾過で除去した。シリカゲルクロマトグラフィーでＳＯＡの脱アセチル化生成物を分離し、そして完全デュテリウムアセチル化技術を用いて構造帰属を行った。２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースとの１対７混合物；２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；および６−ＰＡＳがそれぞれ３０％、７％および０．５％収率で得られた。二者択一的に、リパーゼＡＰ１２を用いて２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースを脱アシル化することによって４−ＰＡＳおよび／または６−ＰＡＳを得ることができる。完全デュテリウムアセチル化技術を用いて、その得られる五酢酸スクロース（ＨＰＬＣで９７％純度）を６−ＰＡＳとして同定した（収率：１１％）。
【００６８】
メタノールが入っているジイソプロピルエーテル中でプロレザーが触媒するＳＯＡの脱アセチル化による６−ＰＡＳの合成
求核剤として１．０Ｍメタノールを用い、プロレザー触媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大規模で行った。（詳細は以下の実験セクションの中に示す）。５日間培養を行った後、このプロレザーを濾過で除去した。シリカゲルクロマトグラフィーでＳＯＡ脱アセチル化生成物を分離し、そして完全デュテリウムアセチル化技術を用いて構造帰属を行った。２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースとの１対７混合物；２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；および６−ＰＡＳがそれぞれ４８％、１７％および２％収率で得られた。
【００６９】
ＳＯＰの脱アシル化に関する酵素スクリーニング
この研究の範囲および利用度を広げる目的で、八プロピオン酸スクロースを合成し、これを酵素触媒脱アシル化反応における基質として用いた。ＳＯＡに対してＳＯＰが与える１つの重要な利点は、より高い疎水性を示す溶媒、例えばヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンなどへの溶解性が有意に増大する点である。求核剤としてｎ−ブタノールが入っているヘプタン内でＳＯＰを脱アシル化する能力に関して、加水分解酵素類のスクリーニングを行った。２４時間培養した後の一定分量をＨＰＬＣで分析した。表１１に示すように、数多くの加水分解酵素がＳＯＰの脱アシル化を生じさせた。１つの興味の持たれる実施例において、リパーゼＡＹ３０およびプロテアーゼＸＸＩＩＩ型から得られるヘプタプロピオネートを一緒にＨＰＬＣに注入すると、２つの異なる化合物が現れ、このことは、酵素部位選択性が異なることを立証している。
【００７０】
【表１１】
【００７１】
【表１２】
【００７２】
ａ） さらなる詳細を実験セクションの中に見い出すことができるであろう。
【００７３】
ｂ） ブタノールとアシル酵素との反応で生じるプロピオン酸ブチル。
【００７４】
ｃ） ｃＡＵｓは、吸収単位を１００で割った値で表すピーク面積である。
【００７５】
ｄ） ＨＰＬＣ分析を用いてこの生成物分布を得た。
【００７６】
ｅ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ保持時間である。
【００７７】
リパーゼＡＹ３０およびプロテアーゼＸＸＩＩＩ型が触媒するＳＯＰ脱アシル化に対する溶媒の効果
表１２および１３に示すように、数多くの無水有機溶媒中のリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩＩ型を用いて同じＳＯＰ脱アシル化を実施した。ＳＯＡの場合と同様、ＳＯＰの酵素脱アシル化は際だった溶媒効果を示し、ヘキサン、ヘプタンおよびオクタンなどの如き非常に高い疎水性を示す溶媒を含む種々の溶媒の中で良好な変換率を達成することが可能であった。
【００７８】
【表１３】
【００７９】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００８０】
ｂ） ＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００８１】
ｃ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ保持時間である。
【００８２】
ｄ） 他のピークがこの七および六プロピオン酸スクロースのピークを干渉していることからこれらの値を検出することができなかった。
【００８３】
【表１４】
【００８４】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００８５】
ｂ） ＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００８６】
ｃ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ保持時間である。
【００８７】
ｄ） 他のピークがこの七および六プロピオン酸スクロースのピークを干渉していることからこれらの値を検出することができなかった。
【００８８】
ｐＨ沈澱させたＳＯＰ脱アセチル化用加水分解酵素
ＳＯＰで活性を示す酵素類の数および活性を増大させる目的で、ＳＯＡに関して記述したのと同様なｐＨ沈澱実験を行った。いくつかの追加的酵素、例えばリパーゼＡＰ１２、アルカラーゼ、プロレザー、プロテアーゼＮ、リパーゼＩＩ型およびＭＭリパーゼが、ＳＯＰを脱アセチル化する能力を有することが見いだされた。これらの後者の酵素類はＳＯＡおよびＳＯＰ両方の脱アシル化を行う。これらの実験の結果を表１４に示す。
【００８９】
【表１５】
【００９０】
ａ） この挙げた緩衝液ｐＨは、無水媒体内の酵素活性に最適なｐＨである。
【００９１】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００９２】
実験
下記の酵素類をAmanoから入手した：リパーゼＡＰ１２（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、１２５Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）、３４Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＧＣ４（ゲオトリクム・カンジヅム（Geotrichum candidum）、４．４Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＫ（シュードモナス種（Pseudomonas sp.）、２２Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＣＥ（フミコロサ・ランギノサ（Humicolosa langinosa）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＮ（リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、８０Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＬ１０（カンジダ・リポリチカ（Candida lypolitica）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＭＡＰ１０（ムコル・ジャバニクス（Mucor javanicus）、１０．６Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＰＧＥ（ウシ舌根および唾液腺、０．７Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＲ１０（ペニシリウム・ロクエホルチ（Penicillium roqueforti）、１０Ｕ／ｍｇ）、ＬＰＬ−８０（リポ蛋白質リパーゼ、８８１Ｕ／ｍｇ）、ニューラーゼＡ（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、４１．８Ｕ／ｍｇ）、ニューラーゼ２（リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、１５Ｕ／ｍｇ）、ペプチダーゼＡ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、１０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼ２Ａ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、２２．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＢ（ペニシリウム種（Penicillium sp.）、２Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＭ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、６Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus subtilis）、１８６Ｕ／ｍｇ）、プロレザー（枯草菌（Bacillus subtilis）、１０．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＰＺＴ（ブタのすい臓およびアスペルギルス属（Aspergillus）、５４Ｕ／ｍｇ）、スタキアーゼ（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、０．３Ｕ／ｍｇ）、ＰＬＥ−Ａ（ブタの肝臓、５．２Ｕ／ｍｇ）、ビオチームＳ（菌・カビのアミラーゼ、６４Ｕ／ｍｇ）；下記の酵素類をSigmaから入手した：リパーゼＩ型（麦芽、９．６Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＩＩ型（ブタのすい臓、５０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＩＩＩ型（アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、０．４Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＩＸ型（アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus sojae）、０．４４Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＸＩＩＩ型（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、３．５Ｕ／ｍｇ）、キモトリプシン（ウシのすい臓、４８Ｕ／ｍｇ）、パパイン（パパイヤ・ラテックス（Papaya latex）、２．８Ｕ／ｍｇ）、ブロメライン（パイナップルの茎、２２．９Ｕ／ｍｇ）、ホスファターゼアシッド（麦芽）；Biocatalystsから下記の酵素類を入手した：ＭＭリパーゼ（ムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）、１７Ｕ／ｍｇ）、ＣＶリパーゼ（クロモバクテリウム・ビスコスム（Chromobacterium viscosum）、２５Ｕ／ｍｇ）、ＰＣリパーゼ（ペニシリウム・シクロピウム（Penicillium cyclopium）、１．２５Ｕ／ｍｇ）、ＲＡリパーゼ（リゾプス・アリザス（Rhizopus arrhizus）、３．５Ｕ／ｍｇ）、ＰＦリパーゼ（シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、１４．５Ｕ／ｍｇ）。ニュートラーゼ（Newtrase）、ＳＰ−４３５リパーゼ（カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、７ＰＬＵ／ｍｇ）、およびアルカラーゼ（バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis））はNovo Nordiskから与えられたものであった。
【００９３】
Fluka AG.からハイフロスーパーセルおよびシリカゲル（７０−２３０メッシュ）を入手した。他の全ての化学品は最高グレードのものであり、Aldrichから購入した。
【００９４】
この研究で用いた有機溶媒は、無水物として購入したものであるか、或は３Åのモレキュラーシーブ上で貯蔵したものであった。「生物化学および分子生物学の実用ハンドブック」（Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology）に記述されている操作に従って、この研究で用いた全ての緩衝液を調製した（ｐＨ１０および９に関してはグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用い、ｐＨ８および７に関しては燐酸ナトリウム緩衝液を用い、そしてｐＨ６、５および４に関してはクエン酸塩−燐酸塩緩衝液を用いた）。
【００９５】
ＨＰＬＣ分析。それぞれ八酢酸スクロース（ＳＯＡ）および八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）を伴う反応用溶離剤としてアセトニトリル／水（３５／６５）またはアセトニトリル／水（６０／４０）のどちらかを用いたイソクラティック（isocratic）モード使用Supelcosil LC-18-DBカラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、５μ）を用いて常規スクリーニングを行った。全ての流量は１．０ｍＬ／分であり、２２０ｎｍでＵＶを検出した。ＳＯＡの脱アセチル化で得られる全ての生成物を同定する目的で、水中１５％から３５％のアセトニトリルを４０分間用いた後３５／６５のアセトニトリル／水イソクラティック溶離を２０分間用いた勾配モードを使用した。ＳＯＡ脱アセチル化のための求核剤をスクリーニングする目的で、３０／７０のアセトニトリル／水を１６分間用いた後、水中３０％から３５％のアセトニトリル勾配を５分間用い、そして最後に３５／６５のアセトニトリル／水を用いたイソクラティック溶離を１６分間用いた、イソクラティック溶離モードを使用した。ＳＯＡ脱アセチル化に関する酵素部位化学を評価する目的で、２５／７５のアセトニトリル／水を５５分間用いたイソクラティック溶離モードを使用した。
【００９６】
酵素的に得られる五、六または七酢酸スクロース類の同定。五、六または七酢酸スクロース類の画分を下記の如く同定した。興味の持たれる化合物（類）を、１．０ｍＬの９９．０原子％ピリジン−ｄ5の中に溶解させた後、１．０ｍＬの９９＋原子％無水酢酸−ｄ6を添加した。この得られる溶液を、ＴＬＣ分析（シリカゲル、９／１のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ）で反応が完結したことが示されるまで、４５℃および３００ＲＰＭで数時間振とうした。この反応混合物を真空中で蒸発させた後、その残渣を水で数回洗浄することにより、残存しているピリジン−ｄ5または無水酢酸−ｄ6を除去した。この得られる油状固体を５ｍＬのクロロホルムの中に溶解させた後、１ＰＳシリコンで処理した１２．５ｃｍのWhatmann濾紙に通すことで水を除去した。クロロホルムを蒸発させた後、その残渣を1Ｈ−ＮＭＲ分析の目的で１／１のピリジン−ｄ5／ベンゼン−ｄ6の中に溶解させた。
【００９７】
酵素沈澱。Novoから供給された２５ｍＬのアルカラーゼ溶液に３７．５ｍＬの冷アセトン（−２０℃）を添加することによってアルカラーゼを調製した。水系アセトンをデカンテーションで除き、そしてその残渣を２５ｍＬのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）の中に溶解させた。ＮａＯＨ希釈溶液を数滴用いてこの溶液のｐＨを９．０に調整した。この緩衝させたアルカラーゼ溶液に冷アセトン（−２０℃の３７．５ｍＬ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗を用いて濾過することで沈澱物を集めた後、２ミリトールで一晩乾燥させた。この得られるペレットを微粉末に粉砕した後、飽和炭酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）４℃で２４時間貯蔵した。
【００９８】
市販の粉末酵素類のｐＨを下記の方法で調整した。酵素（３ｇ）を２５ｍＬの適当な緩衝液の中に溶解させた後、希釈ＮａＯＨまたはクエン酸／燐酸溶液でｐＨを調整した。冷アセトン（（−２０℃の３７．５ｍＬ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗上に沈澱物を集めた後、２ミリトールで一晩乾燥させた。この蛋白質ペレットを微粉末に粉砕した後、飽和炭酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）４℃で２４時間平衡にした。
【００９９】
酵素固定化。１８ｍＬの水の中に９００ｍｇの緩衝させたアルカラーゼが入っている溶液のｐＨを希釈ＮａＯＨで９．０に調整した。ハイフロスーパーセル（６ｇ）を加えた後、このスラリーを完全混合した。この混合物を２ミリトールの真空下で一晩乾燥させた後、飽和硫酸アンモニウム水溶液上（ＲＨ：８２％）で２４時間貯蔵した。蛋白質溶液を燐酸ナトリウムでｐＨ７．０に調整する以外は同様にしてリパーゼＡＹ３０の固定化を行った。
【０１００】
ＳＯＡ脱アセチル化のための酵素および溶媒スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素の１００ｍｇと、有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの八酢酸スクロース（ＳＯＡ）の１．０ｍＬを仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めてＮ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１０１】
酵素的ＳＯＡ脱アセチル化による七酢酸スクロース類の合成
方法Ａ（プロレザー、リパーゼＩＩ型、リパーゼＡＰ１２、ＳＰ−４３５リパーゼまたはアルカラーゼ）：ＳＯＡの０．２０３ｇ（０．３ミリモル）を１５ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた後、該加水分解酵素を１．５ｇ添加した。この反応混合物の音波処理（５秒間）を行った後、４５℃および３００ＲＰＭにセットした回転振とう器の中に６日間入れた。この酵素を濾過で除去してアセトニトリルで洗浄した。濾液／洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、その残渣を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（２／３）を用いたシリカゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。蒸発させることで、相当する七酢酸スクロース類がそれぞれ４０ｍｇ（アルカラーゼ）、３９ｍｇ（リパーゼＩＩ型）、３４ｍｇ（リパーゼＡＰ１２）、１１ｍｇ（ＳＰ−４３５リパーゼ）および６０ｍｇ（プロレザー）得られた。
【０１０２】
方法Ｂ（リパーゼＡＹ３０）：ＳＯＡの０．１７０ｇ（０．２５ミリモル）を５ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルの中に溶解させた後、０．５ｇのリパーゼＡＹ３０を添加した。この反応混合物を方法Ａと同じ条件下で処理した後、後処理することにより、４３ｍｇの七酢酸スクロース類が得られた。
【０１０３】
６−ＰＡＳの合成：ジイソプロピルエーテル中のアルカラーゼを用いたＳＯＡの脱アセチル化。ＳＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモル）を１００ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、アルカラーゼ（１０ｇ、ｐＨ９の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００ＲＰＭで４日間振とうした。この酵素を濾過で除去してアセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。ヘキサン／酢酸エチル（２／３）で溶離させることにより、２，３，４，６，１’，３’，４’−と２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの混合物（１／７）が３６０ｍｇ得られた。続けてヘキサン／酢酸エチル（１／４）で溶離させることにより、２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースが８６ｍｇ得られた。最後に、５００ｍＬの酢酸エチルで溶離させることにより、４−ＰＡＳと６−ＰＡＳの混合物が４０ｍｇ得られた。シリカゲルクロマトグラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用いヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで五酢酸スクロースを精製することにより、６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
【０１０４】
６−ＰＡＳの合成：メタノールが入っているジイソプロピルエーテル中のプロレザーに触媒させたＳＯＡの脱アセチル化。ＳＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモル）を、１Ｍのメタノールが入っている１００ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、プロレザー（５ｇ、ｐＨ１０の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００ＲＰＭで振とうした。２日後、５ｇのプロレザーを添加して更に３日間この混合物の振とうを行った。この酵素を濾過で除去してアセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。ヘキサン／酢酸エチル（２／３）で溶離させることにより、２，３，４，６，１’，３’，４’−と２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの混合物（１／７）が５７９ｍｇ得られた。続けてヘキサン／酢酸エチル（１／４）で溶離させることにより、２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースが２０５ｍｇ得られた。最後に、５００ｍＬの酢酸エチルで溶離させることにより、五酢酸スクロース類の混合物が８６ｍｇ得られた。シリカゲルクロマトグラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用いヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで五酢酸スクロースを精製することにより、６−ＰＡＳが２４ｍｇ得られた。
【０１０５】
６−ＰＡＳの合成：ジイソプロピルエーテル中のリパーゼＡＰ１２に触媒させた２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースの脱アセチル化。２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース（０．０５５ｇ、０．０９２ミリモル）を、８ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、リパーゼＡＰ１２（０．８ｇ、ｐＨ６の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００ＲＰＭで２０時間振とうした。この酵素を濾過で除去してアセトニトリルで洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（１０ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけ、ヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
【０１０６】
アルカラーゼ、プロレザーまたはリパーゼＡＰ１２に触媒させたＳＯＡ脱アセチル化のための求核剤スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如く調製した粉末酵素を１００ｍｇ、そしてジイソプロピルエーテルの中に溶解させた２０ｍＭの八酢酸スクロース（ＳＯＡ）と２００ｍＭの求核剤を１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで６６時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めてＮ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１０７】
酵素活性に対する濃度の効果をスクリーニングする目的で、この求核剤濃度を０から２００ｍＭで変化させる以外は同じプロトコルに従った。
【０１０８】
八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）の合成。１００ｍＬのピリジンの中に１０．２７ｇ（３０．０ミリモル）のスクロースが入っている懸濁液を撹拌しながら還流にまで加熱した。約７５分後、溶解していないスクロースが若干入っている半透明の溶液が得られ、これを周囲温度にまで冷却した後、４６．９ｍＬ（３６２．７ミリモル、５１％過剰）の無水プロピオン酸を一度に加えることで処理した。初期の発熱で４５−４６℃になった後、この反応混合物を周囲温度で１９時間撹拌した。ＴＬＣ分析（シリカゲル、ジエチルエーテル／アセトン、４／１）で、この反応が完了したことが示された。この混合物を真空中で蒸発させることでシロップ状物を残存させ、これをトルエンの中に溶解させた後、３回再蒸発させることで、できるだけ多くのピリジンを除去した。このシロップ状物を１００ｍＬの塩化メチレンの中に溶解させそして連続して２５ｍＬの水、１００ｍＬの１％ＮａＨＣＯ3そして２５ｍＬの水で洗浄することにより、残存しているピリジンおよび／またはプロピオン酸を除去した。ＭｇＳＯ4上で乾燥しそして濾過した後、塩化メチレンを蒸発させることでほとんど無色のシロップ状物を残存させたが、これは、周囲温度で数日後にゆっくりと結晶化して白色のワックス状固体を生じた。Supelcosil LC-18-DB逆相カラムを使用したＨＰＬＣ分析で６０／４０アセトニトリル／水を用いたイソクラティック溶離を行うことにより、Ｒt＝２２．９分であることが示され、純度は９８．６％であると見積もられた。Ｃ36Ｈ54Ｏ19に関する分析：理論値Ｃ：５４．６８；Ｈ：６．８８；測定値Ｃ：５４．２３；Ｈ：６．８０。
【０１０９】
ヘプタン中のＳＯＰ脱アシル化のための酵素スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素を１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍＭのブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めて、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１１０】
ＳＯＰ脱アシル化のための溶媒スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如きリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩＩを１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍＭのブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めて、Ｎ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１１１】
ここで用いる言葉「１’−酢酸スクロース」、「４’−酢酸スクロース」、「６’−酢酸スクロース」、「４−酢酸スクロース」および「６−酢酸スクロース」は、オクタ−、ヘプタ−またはヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース類を表しており、ここで、示した位置にアセチル置換基が含まれており、その残りのアセチル置換基の位置に関する特別な指示はない。
【０１１２】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【０１１３】
１． 少なくとも６個のエステル基を有するスクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化によるスクロースの部分アシル化誘導体の製造方法において、このスクロースエステルを溶解し得る有機溶媒を含む無水反応溶媒の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触媒し得る加水分解酵素または加水分解酵素類の組み合わせで処理することにより、予め選択した一の位置または複数の位置においてその出発スクロースエステルよりも少なくとも１個多い遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含む方法。
【０１１４】
２． 該スクロースエステルがスクロースアルカノエート、スクロースα−ハロアルカノエートまたはスクローストリハロアルカノエートであり、ここで、このアルカノエート部分が８個以下の炭素原子を有している第１項の方法。
【０１１５】
３． 該スクロースエステルが酢酸スクロース類、プロピオン酸スクロース類、ｎ−もしくはｓ−酪酸スクロース類、クロロ酢酸スクロース類、フルオロ酢酸スクロース類、トリクロロ酢酸スクロース類およびトリフルオロ酢酸スクロース類から成る群から選択される第２項の方法。
【０１１６】
４． 該スクロースエステルが八酢酸スクロース、七酢酸スクロース、六酢酸スクロース、八プロピオン酸スクロース、七プロピオン酸スクロースまたは六プロピオン酸スクロースである第３項の方法。
【０１１７】
５． 該酵素がリパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはアミラーゼである第１項の方法。
【０１１８】
６． 該酵素がリパーゼＡＹ３０、ＳＰ−４３５リパーゼ、プロテアーゼＮ、リパーゼＩＩ型、アルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２、プロテアーゼＸＸＩＩＩ型、プロテアーゼＭ、リパーゼＶＩＩ型、プロテアーゼＸＩＩＩ型、ビオチームＳ、プロテアーゼ２Ａ、リパーゼＣＥ、ＰＣリパーゼおよびＭＭリパーゼから成る群から選択される第５項の方法。
【０１１９】
７． 該有機溶媒が炭化水素、エーテル、ケトン、エステル、アルコールまたはハロゲン化炭化水素である第１項の方法。
【０１２０】
８． 該有機溶媒がトルエン、ジイソプロピルエーテル、四塩化炭素、エチレングリコールジメチルおよびジエチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキサノン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエチルエーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタノン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトール、ヘキサン、ヘプタン、オクタンおよびシクロヘキサンから成る群から選択される１員である第７項の方法。
【０１２１】
９． 該有機溶媒がジイソプロピルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、３−ヘプタノン、ジプロピルエーテル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテル、クロロホルム、２，２，５，５−テトラメチルＴＨＦ、トルエン、四塩化炭素、酢酸ｎ−ブチル、ベンゼンまたはアニソールである第８項の方法。
【０１２２】
１０． 該反応媒体がまた有機求核剤を含んでおり、ここで、この求核剤が、アルコール類、アミン類、アミノアルコール類、チオール類およびオキシム類から成る群から選択される１員である第１項の方法。
【０１２３】
１１． 該求核剤がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、シクロヘキシルメタノール、フェネチルアルコールおよびジイソプロピルアミンから成る群から選択される１員である第１０項の方法。
【０１２４】
１２． 該求核剤がメタノール、ｎ−ブタノール、ジイソプロピルアミンまたはフェネチルアルコールである第１１項の方法。
【０１２５】
１３． ＳＰ−４３５リパーゼ、プロテアーゼＮ、アルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２から成る群から選択される酵素類の組み合わせで八酢酸スクロースを同時もしくは逐次的に処理することを含み、ここで、上記組み合わせは、該八酢酸スクロースの４−、１’−および６’−位または６−、１’−および６’−位のエステル基を脱アセチル化する目的で選択され、そしてこのようにして生じさせた６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースまたは４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースか或はこれらの両方を回収することを含む第１項の方法。
【０１２６】
１４． １’−酢酸スクロースをアルカラーゼで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２７】
１５． １’−酢酸スクロースをプロレザーで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２８】
１６． １’−酢酸スクロースをプロテアーゼＮで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２９】
１７． ４’−酢酸スクロースをプロテアーゼＮで処理することによりこの４’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３０】
１８． ６’−酢酸スクロースをプロテアーゼＮで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３１】
１９． １’−酢酸スクロースをリパーゼＡＹ３０で処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３２】
２０． ４’−酢酸スクロースをリパーゼＡＹ３０で処理することによりこの４’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３３】
２１． ６’−酢酸スクロースをＳＰ−４３５リパーゼで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３４】
２２． ４−酢酸スクロースをリパーゼＡＰ１２で処理することによりこの４−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３５】
２３． ６−酢酸スクロースをリパーゼＡＰ１２で処理することによりこの６−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３６】
２４． （ａ）アルカラーゼまたはプロレザーで八酢酸スクロースを処理することにより２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースとの混合物を生じさせ、そして
（ｂ）段階（ａ）の生成物をアルカラーゼまたはプロレザーで処理することにより２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる、
段階を含む第１項の方法。
【０１３７】
２５． 段階（ｂ）の生成物を更にアルカラーゼまたはプロレザーで処理することにより２，３，６，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる第２４項の方法。
【０１３８】
２６． 段階（ｂ）の生成物を更にリパーゼＡＰ１２で処理することにより２，３，６，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる第２４項の方法。
【０１３９】
２７． 該有機溶媒がエーテルである第２４項の方法。
【０１４０】
２８． 該有機溶媒がエーテルである第２５項の方法。
【０１４１】
２９． 該有機溶媒がエーテルである第２６項の方法。
【０１４２】
３０． 該反応媒体がエーテルとアルコールの混合物である第２７項の方法。
【０１４３】
３１． 該反応媒体がエーテルとアルコールの混合物である第２８項の方法。
【０１４４】
３２． 該反応媒体がエーテルとアルコールの混合物である第２９項の方法。
【０１４５】
３３． ６’−酢酸スクロースをアルカラーゼで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１４６】
３４． ６’−酢酸スクロースをプロレザーで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１４７】
３５． ４’−酢酸スクロースをリパーゼＩＩ型で処理することによりこの４’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【産業上の利用分野】
本発明は、無水有機溶媒中で酵素類を用いて部位選択的にスクロースエステル類を脱アシル化する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
人工甘味料である４，１’，６’−トリクロロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロース（「スクラロース（sucralose）」）は、スクロースを用いこれの４，１’および６’位のヒドロキシルを塩素で置換することによって誘導される。（この甘味料の製造方法において、その４位の立体配置が反転している、従ってこの化合物はガラクトスクロースである）。これらの塩素原子をその所望の位置にのみ向かわせるのが主要な合成上の課題である、と言うのは、置換されるヒドロキシルは異なる反応性を示し、その２つは第一級でありそして１つは第二級であるからである。その最終生成物の６位にある第一級ヒドロキシルは未置換である事が、この合成を更に複雑にしている。
【０００３】
本発明は、スクロースエステル類への改良されたルートを提供するものであり、ここで、これらのエステル基は、そのスクロース分子上の予め決められた位置に結合している。１つの態様において、本発明は、スクラロースを製造する目的で用いられ得る４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース（「４−ＰＡＳ」）または６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース（「６−ＰＡＳ」）か或はこれらの両方への改良されたルートを提供する。４−ＰＡＳは容易に６−ＰＡＳに転位し、これを塩素化したあと脱アシル化することによって、スクラロースを製造することができる。
【０００４】
【発明の簡単な要約】
本発明は、スクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化によるスクロースの部分アシル化誘導体の製造方法を提供するものであり、ここで、上記方法は、無水有機媒体（本文中に定義する如き）の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで処理することにより、予め選択した一または複数の位置に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
【０００５】
【従来技術】
Bornemann他の米国特許第5,141,860号（および英国特許第2 224 504 A号）には、スクロースのオクタエステル類を水系媒体中で酵素的に脱アシル化することによって種々の部分脱アシル化スクロースエステル類を生じさせる方法が開示されている。
【０００６】
水系媒体（２相系であってもよい）内におけるオクタ−Ｏ−アセチルスクロースの酵素的加水分解によるヘプタ−、ヘキサ−および／またはペンタ−Ｏ−アセチルスクロース類の製造が、Chang他、J. Carbohydrate Chemistry、 10(2)、 251-261 (1991）およびCarbohydrate Reserach、 222、 121-129 (1991）；Kloosterman他、 J. Carbohydrate Chemistry、 8(5)、 693-704 (1989）；Mentech他、 ヨーロッパ特許第0 357 476号（1990年3月7日−フランス特許番号2 634 497号に相当）；およびOng他、 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、 2(2)、 161-164
(1992）に開示されている。
【０００７】
以下に示す文献の中に、水系媒体（２相系であってもよい）内における炭水化物エステル類の部位選択的酵素脱アシル化が一般的に開示されている。
【０００８】
H. M. Sweers他、 J. Am. Chem. Soc.、 108、 6421 (1986); W. J. Hennen他、 J. Org. Chem.、 53、 4939 (1988); J. Zemek他、 Coll. Czech. Chem. Commun.、 53、 1851 (1988); A. Ballesteros他、 Tetrahedron、 45、 7077 (1989); S. Tomic他、 Carbohydrate Res.、 210、 191 (1991)；およびK. Kefurt他、 Carbohydrate Res.、 223、 137 (1992）。
【０００９】
J. S. Dordick著「有機溶媒で用いるための酵素設計」、Biotechnol. Prog.、 1992、 No. 8、 259-267およびA. M. Klibanov著「有機溶媒中で働く酵素類」、Chemtech、 1986年6月、 354-359には、非水系で反応を触媒する酵素類を用いることで得ることが可能な利点が考察されている。
【００１０】
【発明の具体的な説明】
学術用語および省略形
本出願で用いる下記の短縮名、省略形および言葉はその指示した意味を有する。
【００１１】
スクラロース＝４，１’，６’−トリクロロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロース；
ＳＨｅｐｔａＡ＝七酢酸スクロースもしくはヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
ＳＨｅｘａＡ＝六酢酸スクロースもしくはヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；
６−ＰＡＳ＝６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース；
４−ＰＡＳ＝４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロース；
４’−ＯＨヘプタアセテート＝２，３，４，６，１’，３’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
１’−ＯＨヘプタアセテート＝２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
６’−ＯＨヘプタアセテート＝２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロース；
１’，６’−ジＯＨヘキサアセテート＝２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；
ＳＯＡ＝八酢酸スクロース；
ＳＯＰ＝八プロピオン酸スクロース；
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；
２−メチルＴＨＦ＝２−メチルテトラヒドロフラン；
２，５−ジメチルＴＨＦ＝２，５−ジメチルテトラヒドロフラン；
２，２，５，５−テトラメチルＴＨＦ＝２，２，５，５−テトラメチルテトラヒドロフラン；および
ＣＣｌ4＝四塩化炭素。
【００１２】
ここで用いる「無水」有機媒体は、この反応で用いる有機溶媒の体積を基準にして約１体積％以下の水を含んでいる有機媒体を意味することを意図しており、ここで、該酵素に結合している水は排除する。更に、この有機媒体が水に混和性を示さない化合物である場合、本発明で用いる無水有機媒体は単相である（即ち、何らかの水が存在している場合、この水は水相を生じるに充分な割合では存在していない）ことを意図している。
【００１３】
本発明の方法は、無水有機媒体の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触媒し得る酵素または酵素類の組み合わせで処理することにより、予め選択した一または複数の位置に遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含んでいる。
【００１４】
本発明の方法で用いられ得るスクロースエステル類の中には、八−、七−および六酢酸スクロース、八−、七−および六プロピオン酸スクロース、八−、七−および六（ｎ−もしくはｓ−酪酸）スクロース、スクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（α−ハロアルカノエート類）、例えば八クロロ酢酸スクロースおよび八フルオロ酢酸スクロースなど、スクロースのトリハロアルカノエート類、例えばスクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（トリクロロアセテート）およびスクロースのオクタ−、ヘプタ−およびヘキサ（トリフルオロアセテート）、並びにスクロースの他のオクタ−、ヘプタ−およびヘキサアシレート類およびハロアルカノエート類があり、ここで、このアルカノエート部分は約８個以下の炭素原子を有している。
【００１５】
本発明の方法では有機溶媒を用いる。本方法を実施するに有効であることが見いだされた有機溶媒は、単独で用いられるか或は組み合わせて用いられるかに拘らず、トルエン、ジイソプロピルエーテル、四塩化炭素、エチレングリコールジメチルおよびジエチルエーテル、アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキサノン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエチルエーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタノン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトール、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、ジ−ｎ−ブチルエーテル、並びに他の環状および非環状有機溶媒であり、これらには、本発明の方法で用いるスクロースエステル基質を溶かす炭化水素（脂肪族および芳香族炭化水素の両方）、エーテル類、ケトン類、エステル類、アルコール類およびハロゲン化炭化水素が含まれる。１つの種類として、エーテル類が本発明の方法で用いるに好適な有機溶媒であることが確認された。
【００１６】
本発明の１つの好適な態様において、この反応媒体の中でまた求核剤を用いる。上記求核剤には、水（水に混和性を示さない溶媒の場合、この媒体の中に独立した水相を形成する量よりも少ない量である、さもなくばこの有機溶媒の体積を基準にして１体積％以下の量である）が含まれ、そして好適には、有機求核剤、例えばアルコール類、アミン類、アミノアルコール類、チオール類およびオキシム類が含まれる。上記有機求核剤の説明的例には、ｎ−ブタノール、メタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ジイソプロピルアミン、エチレングリコール、プロピレングリコール、２−ピペリジンエタノール、ｎ−ブチルチオール、ベンジルメルカプタン、チオフェノール、シスチン［３，３’−ジチオビス（２−アミノプロピオン酸）］、アセトアルドキシム、アセトンオキシムおよびベンズアルドキシムが含まれる。
【００１７】
本発明で用いる酵素類は加水分解酵素類、例えばリパーゼ類、プロテアーゼ類、エステラーゼ類およびアミラーゼ類である。そのスクロース部分上の予め選択した位置にあるエステル基を優先的に除去する目的で、これらの酵素類を用いる。１つの面において、酵素であるリパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea））を用いることで優先的に主に４’位のエステル基そして二次的に１’位のエステル基を除去する。プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus subtilis））を用いて優先的に１’，４’および６’位のエステル基を除去する。ブタのすい臓リパーゼを用いて優先的に４’位のエステル基を除去する。アルカラーゼ（バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis））を用いて優先的に１’位のエステル基そして二次的に６’位のエステル基を除去する。プロレザー（Proleather)（枯草菌（Bacillus subtilis））を用いて優先的に１’位のエステル基そして二次的に６’位のエステル基を除去する。リパーゼＡＰ１２（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger））を用いて優先的に４位および６位のエステル基を除去する。ＳＰ−４３５リパーゼ（カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica））を用いて優先的に主に６’位のエステル基そして二次的に１’位のエステル基を除去する。
【００１８】
本発明の方法で用いる反応媒体は、上に定義した如く無水である。存在させ得る少量の水は、この酵素を溶解させる量未満である。本発明の方法を無水媒体（本文中に定義した如き）中で実施することにより下記の利点が得られることを見い出した。
【００１９】
１． 該スクロースのオクタエステル基質の溶解性が増大すること；
２． 望まれない脱アシル化が抑制されること；
３． この脱アシル化反応の部位選択性が増強されること；
４． この酵素を固定する必要がないことからこの方法が簡単になること、例えばこの酵素は簡単な濾過でその反応混合物から除去され得ること；
５． 生成物の単離がより容易なこと、例えば単に溶媒を蒸発させることが、必要とされている全てである可能性があること；
６． 微生物学的汚染の可能性が有意に低いこと；そして
７． 酵素類を溶解させるに充分な量の水が存在していないことでこれらの酵素が示す熱安定性がより高いこと。
【００２０】
最初に、有機溶媒中でＳＯＡを部位選択的に脱アセチル化する能力に関して、幅広い種類の加水分解酵素のスクリーニングを行った。我々の初期のスクリーニング実験で評価したものの中でリパーゼＡＹ３０が有意な活性を示した。酵素活性は、この酵素を取り巻いている水の殻が最小限であることに依存している。公知の相対湿度（ＲＨ）を有する飽和塩水溶液の上でその乾燥した酵素を平衡にすることによって、この酵素、即ちそれの活性に結合している水の量を調節することができる。有機溶媒の中に入っている酵素が示す触媒力を改良する１つの方法は、正しいイオン状態でそれを用いることであることは知られている。これは一般に、この酵素の最適ｐＨにある緩衝液からこの酵素を凍結乾燥するか或は沈澱させることによって達成される。本技術における一般的教示に一致して、ｐＨを調整した緩衝液（製造業者が指定している最適ｐＨから±１のｐＨ単位）から他の酵素類の多くを沈澱させると有意な活性が得られることを見い出した（表１参照）。
【００２１】
【表１】
ａ） この挙げた緩衝液ｐＨは、無水溶媒内の酵素活性に最適なｐＨである。
【００２３】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００２４】
活性を示すとして同定された酵素のいくつかに関して、それらが異なる溶媒中で示す活性を評価する実験を行った。数多くの無水溶媒の中で同じ酵素に触媒させたＳＯＡ脱アセチル化実験を行った。２４時間培養した後の一定分量をＨＰＬＣで分析した。これらの溶媒実験の結果を表２−５に示すが、これらは明らかに、評価した各酵素が示す活性に対して溶媒が著しい影響を与えることを表している。
【００２５】
【表２】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数［Rekker著「疎水性フラグメント定数」（The Hydrophobic Fragmental Constant）、Elsevier、 Amsterdam (1977)］）。この表のlog P値は、Laane他、 Biotechnol Bioeng. 30、 81 (1987）からのものである。
【００２７】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００２８】
ｃ） 七酢酸スクロースが検出されたのはＳＯＡ中に少量の不純物が存在していたことによるものである。
【００２９】
ｄ） エタノール、ジエチルエーテルおよびエトキシエタノールに関する公知log P値から見積もった。
【００３０】
ｅ） ＴＨＦに関するlog P値に１メチル基当たり０．５単位を増分的に加えることによって見積もった。
【００３１】
ｆ） 恐らくは溶媒による他のピークがこの六酢酸スクロースピークを干渉していたことからこの値を報告しなかった。
【００３２】
【表３】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００３４】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこれを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００３５】
【表４】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００３７】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。１種の七酢酸スクロース（Ｒt：８．１分）を検出した。
【００３８】
【表５】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００４０】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこれを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００４１】
固定化した加水分解酵素に対する溶媒の効果
アルカラーゼおよびリパーゼＡＹ３０をハイフロスーパーセル（Hyflo Super Cell）の上に堆積させ、そしてこれを、いくつかの無水溶媒中のＳＯＡ脱アセチル化反応用触媒として用いた。両方の固定化酵素を用いた時（表６および７）、有利な溶媒効果が観察された。
【００４２】
【表６】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００４４】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。２種の七酢酸スクロース、即ち１’−ＯＨおよび６’−ＯＨ（Ｒt：７．７および８．５分）を検出し、これらのピーク面積を加え、そしてこれを用いてヘプタアセテート類の全％を得た。
【００４５】
【表７】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００４７】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００４８】
加水分解酵素によるＳＯＡ脱アセチル化に関する部位化学
この研究の重要な面は、ＳＯＡの酵素的脱アセチル化で得られる全ての七、六および五酢酸スクロースの構造を明白に帰属させることであった。Rathbone E. B.、 Carbohydr. Res.、 205、 402 (1990）が記述しているのと同様にして、完全デュテリウムアセチル化した後、1Ｈ−ＮＭＲ分析することでこれらの構造の帰属を行った。リパーゼＡＹ３０およびリパーゼＩＩ型を用いた表８（以下）に示す結果を調べた結果、主要な脱アセチル化生成物は４’−ＯＨヘプタアセテートである。それとは対照的に、プロテアーゼ類であるアルカラーゼおよびプロレザーは、主に１’−位の脱アセチル化を生じさせ、そしてある程度の反応がその６’−位に生じる。リパーゼＡＰ１２を用いた脱アセチル化は、４−および６−ＯＨヘプタアセテート類の両方を生じさせる一方、カンジダ・アンタルクチカ由来のＳＰ−４３５リパーゼは、１’−ＯＨヘプタアセテートと一緒に主に６’−ＯＨヘプタアセテートを生じさせる。最後に、プロテアーゼＮは、ほとんど等モル混合物で１’−、４’−および６’−ＯＨヘプタアセテート類を生じさせる。
【００４９】
【表８】
ａ． ＳＯＡの脱アセチル化に関して試験して変換率が＜６％であった他の酵素類（最適なｐＨ）は下記のものである：リパーゼＣＥ（９．０）；リパーゼＡＫ（８．０）；プロテアーゼＭ（６．０）；リパーゼＭＡＰ１０（７．０）；キモトリプシン（８．０）；ＰＣリパーゼ（５．０）；ＭＭリパーゼ（１０．０）；プロテアーゼＸＸＩＩ型（８．０）。
【００５１】
ｂ． このコラムの中にｐＨを示す場合、これらの酵素は、示したｐＨの緩衝液から沈澱を生じた。この緩衝液のｐＨは、無水ジイソプロピルエーテル内の酵素活性で見いだされた最適ｐＨである。
【００５２】
ｃ． 変換率（％）は、全七−および六−酢酸スクロースの合計である。脱アセチル化は酵素が存在していない場合全く生じなかった。
【００５３】
ｄ． この分子を完全デュテリウムアセチル化した後、1Ｈ−ＮＭＲ分析することにより、各酵素反応の七酢酸スクロースの構造の帰属を行った。定量化の目的で、この表ではＨＰＬＣにおける七酢酸スクロースのピーク高を用いた。
【００５４】
ｅ． プロテアーゼＮが触媒する反応生成物に関する部位化学を、ＨＰＬＣ保持時間を基準にして割り当てた。
【００５５】
ｆ． ２，３，４，１’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの構造を下記の事実から推論した。培養している間はＨＰＬＣで２種の七酢酸スクロース類が検出されたが、カラムクロマトグラフィーにかけた後では、２，３，６，１’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルのみが得られた。恐らくは、この精製を行っている間に、起こり得る過程であることが知られている４位から６位へのアセチル移動が起こったのであろう。
【００５６】
求核剤の選択および濃度の効果
アルカラーゼ、プロレザーまたはリパーゼＡＰ１２に触媒させた同じＳＯＡ脱アセチル化を、いくつかの求核剤の存在下で実施し、その結果を表９に示す。アルカラーゼが触媒する反応では、求核剤としてメタノールまたはジイソプロピルアミンを用いることによって有意な変化率の増大が達成された（求核剤を添加していない反応に比較して少なくとも２５％上昇した）一方、プロレザーが触媒する反応では、シクロヘキサノール、ジイソプロピルアミンおよびテトラメチルピペリジンを除く添加した全ての求核剤が同様な改良を与えた。リパーゼＡＰ１２が触媒する反応は、求核剤を存在させると、中間的な変換率の改良を示した。
【００５７】
【表９】
ａ） この実験全体で用いた求核剤濃度は２００ｍＭである。ＳＯＡの脱アセチル化はこれらの酵素なしでは全く生じなかった。
【００５９】
ｂ） 変換率（％）（６６時間培養）を、残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スクロース類の合計で表す。
【００６０】
ｃ） ２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよびプロレザー部位化学を定義する。
【００６１】
ｄ） 反応は全く生じなかった。
【００６２】
表１０に示すように、それぞれ０．５および１．０Ｍのメタノール存在下でアルカラーゼおよびリパーゼＡＰ１２に触媒させた反応において、全体変換率に関して中程度の増強が達成された。プロレザーに触媒させた反応で１．０Ｍのメタノールを用いると、注目すべき１２０％の変換率上昇が得られた。１．０Ｍのｎ−ブタノールまたはフェネチルアルコールを用いた時も同様な結果が得られた。
【００６３】
【表１０】
ａ） 変換率（％）（６６時間培養）を、残存しているＳＯＡに比較した時の得られる七酢酸スクロース類の合計で表す。
【００６５】
ｂ） ２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高で割った２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースのピーク高として、アルカラーゼおよびプロレザー部位化学を定義する。
【００６６】
本発明の１つの好適な面において、上の表８に示す酵素類の組み合わせを用い、ＳＯＡの４−、１’−および６’−位または６−、１’−および６’−位のエステル基の脱アセチル化を生じさせるに適当な上記酵素類の組み合わせでＳＯＡの同時もしくは逐次的処理を行うことにより、４−ＰＡＳおよび／または６−ＰＡＳを製造した。
【００６７】
ジイソプロピルエーテル中でアルカラーゼまたはアルカラーゼ／リパーゼＡＰ１２が触媒するＳＯＡの脱アセチル化による６−ＰＡＳの合成
アルカラーゼ触媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大規模で行った。（詳細は以下の実験セクションの中に示す）。５日間培養を行った後、このアルカラーゼを濾過で除去した。シリカゲルクロマトグラフィーでＳＯＡの脱アセチル化生成物を分離し、そして完全デュテリウムアセチル化技術を用いて構造帰属を行った。２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースとの１対７混合物；２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；および６−ＰＡＳがそれぞれ３０％、７％および０．５％収率で得られた。二者択一的に、リパーゼＡＰ１２を用いて２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースを脱アシル化することによって４−ＰＡＳおよび／または６−ＰＡＳを得ることができる。完全デュテリウムアセチル化技術を用いて、その得られる五酢酸スクロース（ＨＰＬＣで９７％純度）を６−ＰＡＳとして同定した（収率：１１％）。
【００６８】
メタノールが入っているジイソプロピルエーテル中でプロレザーが触媒するＳＯＡの脱アセチル化による６−ＰＡＳの合成
求核剤として１．０Ｍメタノールを用い、プロレザー触媒によるＳＯＡの脱アセチル化反応を大規模で行った。（詳細は以下の実験セクションの中に示す）。５日間培養を行った後、このプロレザーを濾過で除去した。シリカゲルクロマトグラフィーでＳＯＡ脱アセチル化生成物を分離し、そして完全デュテリウムアセチル化技術を用いて構造帰属を行った。２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースとの１対７混合物；２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース；および６−ＰＡＳがそれぞれ４８％、１７％および２％収率で得られた。
【００６９】
ＳＯＰの脱アシル化に関する酵素スクリーニング
この研究の範囲および利用度を広げる目的で、八プロピオン酸スクロースを合成し、これを酵素触媒脱アシル化反応における基質として用いた。ＳＯＡに対してＳＯＰが与える１つの重要な利点は、より高い疎水性を示す溶媒、例えばヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンなどへの溶解性が有意に増大する点である。求核剤としてｎ−ブタノールが入っているヘプタン内でＳＯＰを脱アシル化する能力に関して、加水分解酵素類のスクリーニングを行った。２４時間培養した後の一定分量をＨＰＬＣで分析した。表１１に示すように、数多くの加水分解酵素がＳＯＰの脱アシル化を生じさせた。１つの興味の持たれる実施例において、リパーゼＡＹ３０およびプロテアーゼＸＸＩＩＩ型から得られるヘプタプロピオネートを一緒にＨＰＬＣに注入すると、２つの異なる化合物が現れ、このことは、酵素部位選択性が異なることを立証している。
【００７０】
【表１１】
【表１２】
ａ） さらなる詳細を実験セクションの中に見い出すことができるであろう。
【００７３】
ｂ） ブタノールとアシル酵素との反応で生じるプロピオン酸ブチル。
【００７４】
ｃ） ｃＡＵｓは、吸収単位を１００で割った値で表すピーク面積である。
【００７５】
ｄ） ＨＰＬＣ分析を用いてこの生成物分布を得た。
【００７６】
ｅ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ保持時間である。
【００７７】
リパーゼＡＹ３０およびプロテアーゼＸＸＩＩＩ型が触媒するＳＯＰ脱アシル化に対する溶媒の効果
表１２および１３に示すように、数多くの無水有機溶媒中のリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩＩ型を用いて同じＳＯＰ脱アシル化を実施した。ＳＯＡの場合と同様、ＳＯＰの酵素脱アシル化は際だった溶媒効果を示し、ヘキサン、ヘプタンおよびオクタンなどの如き非常に高い疎水性を示す溶媒を含む種々の溶媒の中で良好な変換率を達成することが可能であった。
【００７８】
【表１３】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００８０】
ｂ） ＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００８１】
ｃ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ保持時間である。
【００８２】
ｄ） 他のピークがこの七および六プロピオン酸スクロースのピークを干渉していることからこれらの値を検出することができなかった。
【００８３】
【表１４】
ａ） log Pは、溶媒が示す疎水性の尺度である（ｎ−オクタノールと水との間の溶媒分配係数の対数）。この表のlog P値は、Laane他からのものである。
【００８５】
ｂ） ＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００８６】
ｃ） この列に示す値は分で表すＨＰＬＣ保持時間である。
【００８７】
ｄ） 他のピークがこの七および六プロピオン酸スクロースのピークを干渉していることからこれらの値を検出することができなかった。
【００８８】
ｐＨ沈澱させたＳＯＰ脱アセチル化用加水分解酵素
ＳＯＰで活性を示す酵素類の数および活性を増大させる目的で、ＳＯＡに関して記述したのと同様なｐＨ沈澱実験を行った。いくつかの追加的酵素、例えばリパーゼＡＰ１２、アルカラーゼ、プロレザー、プロテアーゼＮ、リパーゼＩＩ型およびＭＭリパーゼが、ＳＯＰを脱アセチル化する能力を有することが見いだされた。これらの後者の酵素類はＳＯＡおよびＳＯＰ両方の脱アシル化を行う。これらの実験の結果を表１４に示す。
【００８９】
【表１５】
ａ） この挙げた緩衝液ｐＨは、無水媒体内の酵素活性に最適なｐＨである。
【００９１】
ｂ） ２４時間培養後のＨＰＬＣ分析でこの生成物の分布を得た。
【００９２】
実験
下記の酵素類をAmanoから入手した：リパーゼＡＰ１２（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、１２５Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＹ３０（カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）、３４Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＧＣ４（ゲオトリクム・カンジヅム（Geotrichum candidum）、４．４Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＡＫ（シュードモナス種（Pseudomonas sp.）、２２Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＣＥ（フミコロサ・ランギノサ（Humicolosa langinosa）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＮ（リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、８０Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＬ１０（カンジダ・リポリチカ（Candida lypolitica）、１１Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＭＡＰ１０（ムコル・ジャバニクス（Mucor javanicus）、１０．６Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＰＧＥ（ウシ舌根および唾液腺、０．７Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＲ１０（ペニシリウム・ロクエホルチ（Penicillium roqueforti）、１０Ｕ／ｍｇ）、ＬＰＬ−８０（リポ蛋白質リパーゼ、８８１Ｕ／ｍｇ）、ニューラーゼＡ（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、４１．８Ｕ／ｍｇ）、ニューラーゼ２（リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、１５Ｕ／ｍｇ）、ペプチダーゼＡ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、１０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼ２Ａ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、２２．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＢ（ペニシリウム種（Penicillium sp.）、２Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＭ（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、６Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＮ（枯草菌（Bacillus subtilis）、１８６Ｕ／ｍｇ）、プロレザー（枯草菌（Bacillus subtilis）、１０．５Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＰＺＴ（ブタのすい臓およびアスペルギルス属（Aspergillus）、５４Ｕ／ｍｇ）、スタキアーゼ（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、０．３Ｕ／ｍｇ）、ＰＬＥ−Ａ（ブタの肝臓、５．２Ｕ／ｍｇ）、ビオチームＳ（菌・カビのアミラーゼ、６４Ｕ／ｍｇ）；下記の酵素類をSigmaから入手した：リパーゼＩ型（麦芽、９．６Ｕ／ｍｇ）、リパーゼＩＩ型（ブタのすい臓、５０Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＩＩＩ型（アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、０．４Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＩＸ型（アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus sojae）、０．４４Ｕ／ｍｇ）、プロテアーゼＸＸＩＩＩ型（アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、３．５Ｕ／ｍｇ）、キモトリプシン（ウシのすい臓、４８Ｕ／ｍｇ）、パパイン（パパイヤ・ラテックス（Papaya latex）、２．８Ｕ／ｍｇ）、ブロメライン（パイナップルの茎、２２．９Ｕ／ｍｇ）、ホスファターゼアシッド（麦芽）；Biocatalystsから下記の酵素類を入手した：ＭＭリパーゼ（ムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）、１７Ｕ／ｍｇ）、ＣＶリパーゼ（クロモバクテリウム・ビスコスム（Chromobacterium viscosum）、２５Ｕ／ｍｇ）、ＰＣリパーゼ（ペニシリウム・シクロピウム（Penicillium cyclopium）、１．２５Ｕ／ｍｇ）、ＲＡリパーゼ（リゾプス・アリザス（Rhizopus arrhizus）、３．５Ｕ／ｍｇ）、ＰＦリパーゼ（シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、１４．５Ｕ／ｍｇ）。ニュートラーゼ（Newtrase）、ＳＰ−４３５リパーゼ（カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、７ＰＬＵ／ｍｇ）、およびアルカラーゼ（バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis））はNovo Nordiskから与えられたものであった。
【００９３】
Fluka AG.からハイフロスーパーセルおよびシリカゲル（７０−２３０メッシュ）を入手した。他の全ての化学品は最高グレードのものであり、Aldrichから購入した。
【００９４】
この研究で用いた有機溶媒は、無水物として購入したものであるか、或は３Åのモレキュラーシーブ上で貯蔵したものであった。「生物化学および分子生物学の実用ハンドブック」（Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology）に記述されている操作に従って、この研究で用いた全ての緩衝液を調製した（ｐＨ１０および９に関してはグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用い、ｐＨ８および７に関しては燐酸ナトリウム緩衝液を用い、そしてｐＨ６、５および４に関してはクエン酸塩−燐酸塩緩衝液を用いた）。
【００９５】
ＨＰＬＣ分析。それぞれ八酢酸スクロース（ＳＯＡ）および八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）を伴う反応用溶離剤としてアセトニトリル／水（３５／６５）またはアセトニトリル／水（６０／４０）のどちらかを用いたイソクラティック（isocratic）モード使用Supelcosil LC-18-DBカラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、５μ）を用いて常規スクリーニングを行った。全ての流量は１．０ｍＬ／分であり、２２０ｎｍでＵＶを検出した。ＳＯＡの脱アセチル化で得られる全ての生成物を同定する目的で、水中１５％から３５％のアセトニトリルを４０分間用いた後３５／６５のアセトニトリル／水イソクラティック溶離を２０分間用いた勾配モードを使用した。ＳＯＡ脱アセチル化のための求核剤をスクリーニングする目的で、３０／７０のアセトニトリル／水を１６分間用いた後、水中３０％から３５％のアセトニトリル勾配を５分間用い、そして最後に３５／６５のアセトニトリル／水を用いたイソクラティック溶離を１６分間用いた、イソクラティック溶離モードを使用した。ＳＯＡ脱アセチル化に関する酵素部位化学を評価する目的で、２５／７５のアセトニトリル／水を５５分間用いたイソクラティック溶離モードを使用した。
【００９６】
酵素的に得られる五、六または七酢酸スクロース類の同定。五、六または七酢酸スクロース類の画分を下記の如く同定した。興味の持たれる化合物（類）を、１．０ｍＬの９９．０原子％ピリジン−ｄ5の中に溶解させた後、１．０ｍＬの９９＋原子％無水酢酸−ｄ6を添加した。この得られる溶液を、ＴＬＣ分析（シリカゲル、９／１のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ）で反応が完結したことが示されるまで、４５℃および３００ＲＰＭで数時間振とうした。この反応混合物を真空中で蒸発させた後、その残渣を水で数回洗浄することにより、残存しているピリジン−ｄ5または無水酢酸−ｄ6を除去した。この得られる油状固体を５ｍＬのクロロホルムの中に溶解させた後、１ＰＳシリコンで処理した１２．５ｃｍのWhatmann濾紙に通すことで水を除去した。クロロホルムを蒸発させた後、その残渣を1Ｈ−ＮＭＲ分析の目的で１／１のピリジン−ｄ5／ベンゼン−ｄ6の中に溶解させた。
【００９７】
酵素沈澱。Novoから供給された２５ｍＬのアルカラーゼ溶液に３７．５ｍＬの冷アセトン（−２０℃）を添加することによってアルカラーゼを調製した。水系アセトンをデカンテーションで除き、そしてその残渣を２５ｍＬのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）の中に溶解させた。ＮａＯＨ希釈溶液を数滴用いてこの溶液のｐＨを９．０に調整した。この緩衝させたアルカラーゼ溶液に冷アセトン（−２０℃の３７．５ｍＬ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗を用いて濾過することで沈澱物を集めた後、２ミリトールで一晩乾燥させた。この得られるペレットを微粉末に粉砕した後、飽和炭酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）４℃で２４時間貯蔵した。
【００９８】
市販の粉末酵素類のｐＨを下記の方法で調整した。酵素（３ｇ）を２５ｍＬの適当な緩衝液の中に溶解させた後、希釈ＮａＯＨまたはクエン酸／燐酸溶液でｐＨを調整した。冷アセトン（（−２０℃の３７．５ｍＬ）を加え、そして中間的間隙率を有するガラス漏斗上に沈澱物を集めた後、２ミリトールで一晩乾燥させた。この蛋白質ペレットを微粉末に粉砕した後、飽和炭酸カリウム水溶液上（ＲＨ：４３％）４℃で２４時間平衡にした。
【００９９】
酵素固定化。１８ｍＬの水の中に９００ｍｇの緩衝させたアルカラーゼが入っている溶液のｐＨを希釈ＮａＯＨで９．０に調整した。ハイフロスーパーセル（６ｇ）を加えた後、このスラリーを完全混合した。この混合物を２ミリトールの真空下で一晩乾燥させた後、飽和硫酸アンモニウム水溶液上（ＲＨ：８２％）で２４時間貯蔵した。蛋白質溶液を燐酸ナトリウムでｐＨ７．０に調整する以外は同様にしてリパーゼＡＹ３０の固定化を行った。
【０１００】
ＳＯＡ脱アセチル化のための酵素および溶媒スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素の１００ｍｇと、有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの八酢酸スクロース（ＳＯＡ）の１．０ｍＬを仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めてＮ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１０１】
酵素的ＳＯＡ脱アセチル化による七酢酸スクロース類の合成
方法Ａ（プロレザー、リパーゼＩＩ型、リパーゼＡＰ１２、ＳＰ−４３５リパーゼまたはアルカラーゼ）：ＳＯＡの０．２０３ｇ（０．３ミリモル）を１５ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた後、該加水分解酵素を１．５ｇ添加した。この反応混合物の音波処理（５秒間）を行った後、４５℃および３００ＲＰＭにセットした回転振とう器の中に６日間入れた。この酵素を濾過で除去してアセトニトリルで洗浄した。濾液／洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、その残渣を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（２／３）を用いたシリカゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。蒸発させることで、相当する七酢酸スクロース類がそれぞれ４０ｍｇ（アルカラーゼ）、３９ｍｇ（リパーゼＩＩ型）、３４ｍｇ（リパーゼＡＰ１２）、１１ｍｇ（ＳＰ−４３５リパーゼ）および６０ｍｇ（プロレザー）得られた。
【０１０２】
方法Ｂ（リパーゼＡＹ３０）：ＳＯＡの０．１７０ｇ（０．２５ミリモル）を５ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルの中に溶解させた後、０．５ｇのリパーゼＡＹ３０を添加した。この反応混合物を方法Ａと同じ条件下で処理した後、後処理することにより、４３ｍｇの七酢酸スクロース類が得られた。
【０１０３】
６−ＰＡＳの合成：ジイソプロピルエーテル中のアルカラーゼを用いたＳＯＡの脱アセチル化。ＳＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモル）を１００ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、アルカラーゼ（１０ｇ、ｐＨ９の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００ＲＰＭで４日間振とうした。この酵素を濾過で除去してアセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。ヘキサン／酢酸エチル（２／３）で溶離させることにより、２，３，４，６，１’，３’，４’−と２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの混合物（１／７）が３６０ｍｇ得られた。続けてヘキサン／酢酸エチル（１／４）で溶離させることにより、２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースが８６ｍｇ得られた。最後に、５００ｍＬの酢酸エチルで溶離させることにより、４−ＰＡＳと６−ＰＡＳの混合物が４０ｍｇ得られた。シリカゲルクロマトグラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用いヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで五酢酸スクロースを精製することにより、６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
【０１０４】
６−ＰＡＳの合成：メタノールが入っているジイソプロピルエーテル中のプロレザーに触媒させたＳＯＡの脱アセチル化。ＳＯＡ（１．３５ｇ、２ミリモル）を、１Ｍのメタノールが入っている１００ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、プロレザー（５ｇ、ｐＨ１０の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００ＲＰＭで振とうした。２日後、５ｇのプロレザーを添加して更に３日間この混合物の振とうを行った。この酵素を濾過で除去してアセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（２３ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけた。ヘキサン／酢酸エチル（２／３）で溶離させることにより、２，３，４，６，１’，３’，４’−と２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースの混合物（１／７）が５７９ｍｇ得られた。続けてヘキサン／酢酸エチル（１／４）で溶離させることにより、２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースが２０５ｍｇ得られた。最後に、５００ｍＬの酢酸エチルで溶離させることにより、五酢酸スクロース類の混合物が８６ｍｇ得られた。シリカゲルクロマトグラフィー（１０ｘ２．５ｃｍ）を用いヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで五酢酸スクロースを精製することにより、６−ＰＡＳが２４ｍｇ得られた。
【０１０５】
６−ＰＡＳの合成：ジイソプロピルエーテル中のリパーゼＡＰ１２に触媒させた２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースの脱アセチル化。２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース（０．０５５ｇ、０．０９２ミリモル）を、８ｍＬのジイソプロピルエーテルの中に溶解させた。この溶液に、リパーゼＡＰ１２（０．８ｇ、ｐＨ６の緩衝液から沈澱させた）を加えた。５秒間の音波処理を行った後、この反応混合物を４５℃および３００ＲＰＭで２０時間振とうした。この酵素を濾過で除去してアセトニトリルで洗浄した。この濾液と洗浄液を一緒にして減圧下で蒸発させた後、この残渣を、シリカゲルカラム（１０ｘ２．５ｃｍ）使用クロマトグラフィーにかけ、ヘキサン／酢酸エチル（１／９）で溶離させることで６−ＰＡＳが５ｍｇ得られた。
【０１０６】
アルカラーゼ、プロレザーまたはリパーゼＡＰ１２に触媒させたＳＯＡ脱アセチル化のための求核剤スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如く調製した粉末酵素を１００ｍｇ、そしてジイソプロピルエーテルの中に溶解させた２０ｍＭの八酢酸スクロース（ＳＯＡ）と２００ｍＭの求核剤を１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで６６時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めてＮ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１０７】
酵素活性に対する濃度の効果をスクリーニングする目的で、この求核剤濃度を０から２００ｍＭで変化させる以外は同じプロトコルに従った。
【０１０８】
八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）の合成。１００ｍＬのピリジンの中に１０．２７ｇ（３０．０ミリモル）のスクロースが入っている懸濁液を撹拌しながら還流にまで加熱した。約７５分後、溶解していないスクロースが若干入っている半透明の溶液が得られ、これを周囲温度にまで冷却した後、４６．９ｍＬ（３６２．７ミリモル、５１％過剰）の無水プロピオン酸を一度に加えることで処理した。初期の発熱で４５−４６℃になった後、この反応混合物を周囲温度で１９時間撹拌した。ＴＬＣ分析（シリカゲル、ジエチルエーテル／アセトン、４／１）で、この反応が完了したことが示された。この混合物を真空中で蒸発させることでシロップ状物を残存させ、これをトルエンの中に溶解させた後、３回再蒸発させることで、できるだけ多くのピリジンを除去した。このシロップ状物を１００ｍＬの塩化メチレンの中に溶解させそして連続して２５ｍＬの水、１００ｍＬの１％ＮａＨＣＯ3そして２５ｍＬの水で洗浄することにより、残存しているピリジンおよび／またはプロピオン酸を除去した。ＭｇＳＯ4上で乾燥しそして濾過した後、塩化メチレンを蒸発させることでほとんど無色のシロップ状物を残存させたが、これは、周囲温度で数日後にゆっくりと結晶化して白色のワックス状固体を生じた。Supelcosil LC-18-DB逆相カラムを使用したＨＰＬＣ分析で６０／４０アセトニトリル／水を用いたイソクラティック溶離を行うことにより、Ｒt＝２２．９分であることが示され、純度は９８．６％であると見積もられた。Ｃ36Ｈ54Ｏ19に関する分析：理論値Ｃ：５４．６８；Ｈ：６．８８；測定値Ｃ：５４．２３；Ｈ：６．８０。
【０１０９】
ヘプタン中のＳＯＰ脱アシル化のための酵素スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如く入手したか或は調製した粉末酵素を１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍＭのブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めて、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１１０】
ＳＯＰ脱アシル化のための溶媒スクリーニング。シンチレーション用小びんの中に連続して、記述した如きリパーゼＡＹ３０またはプロテアーゼＸＸＩＩＩを１００ｍｇ、そして有機溶媒の中に溶解させた２０ｍＭの八プロピオン酸スクロース（ＳＯＰ）と２００ｍＭのブタノールを１．０ｍＬ仕込んだ。５秒間音波処理した後、この小びんを、４５℃に温度調節されている振とう器中３００ＲＰＭで２４時間培養した。この反応混合物の一定分量２００μＬを取り出して遠心分離にかけた。その上澄み液を集めて、Ｎ2流下で蒸発させた。この残渣を２００μＬのアセトニトリルの中で再構成した後、この溶液の１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
【０１１１】
ここで用いる言葉「１’−酢酸スクロース」、「４’−酢酸スクロース」、「６’−酢酸スクロース」、「４−酢酸スクロース」および「６−酢酸スクロース」は、オクタ−、ヘプタ−またはヘキサ−Ｏ−アセチルスクロース類を表しており、ここで、示した位置にアセチル置換基が含まれており、その残りのアセチル置換基の位置に関する特別な指示はない。
【０１１２】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【０１１３】
１． 少なくとも６個のエステル基を有するスクロースエステル類の酵素触媒脱アシル化によるスクロースの部分アシル化誘導体の製造方法において、このスクロースエステルを溶解し得る有機溶媒を含む無水反応溶媒の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触媒し得る加水分解酵素または加水分解酵素類の組み合わせで処理することにより、予め選択した一の位置または複数の位置においてその出発スクロースエステルよりも少なくとも１個多い遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含む方法。
【０１１４】
２． 該スクロースエステルがスクロースアルカノエート、スクロースα−ハロアルカノエートまたはスクローストリハロアルカノエートであり、ここで、このアルカノエート部分が８個以下の炭素原子を有している第１項の方法。
【０１１５】
３． 該スクロースエステルが酢酸スクロース類、プロピオン酸スクロース類、ｎ−もしくはｓ−酪酸スクロース類、クロロ酢酸スクロース類、フルオロ酢酸スクロース類、トリクロロ酢酸スクロース類およびトリフルオロ酢酸スクロース類から成る群から選択される第２項の方法。
【０１１６】
４． 該スクロースエステルが八酢酸スクロース、七酢酸スクロース、六酢酸スクロース、八プロピオン酸スクロース、七プロピオン酸スクロースまたは六プロピオン酸スクロースである第３項の方法。
【０１１７】
５． 該酵素がリパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはアミラーゼである第１項の方法。
【０１１８】
６． 該酵素がリパーゼＡＹ３０、ＳＰ−４３５リパーゼ、プロテアーゼＮ、リパーゼＩＩ型、アルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２、プロテアーゼＸＸＩＩＩ型、プロテアーゼＭ、リパーゼＶＩＩ型、プロテアーゼＸＩＩＩ型、ビオチームＳ、プロテアーゼ２Ａ、リパーゼＣＥ、ＰＣリパーゼおよびＭＭリパーゼから成る群から選択される第５項の方法。
【０１１９】
７． 該有機溶媒が炭化水素、エーテル、ケトン、エステル、アルコールまたはハロゲン化炭化水素である第１項の方法。
【０１２０】
８． 該有機溶媒がトルエン、ジイソプロピルエーテル、四塩化炭素、エチレングリコールジメチルおよびジエチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、アセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、シクロヘキサノン、２−メチルＴＨＦ、ｔ−ブチルメチルおよびエチルエーテル、２，５−ジメチルＴＨＦ、シクロヘキサノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、３−ヘプタノン、メチルイソブチルケトン、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテル、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、フェネトール、ヘキサン、ヘプタン、オクタンおよびシクロヘキサンから成る群から選択される１員である第７項の方法。
【０１２１】
９． 該有機溶媒がジイソプロピルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、３−ヘプタノン、ジプロピルエーテル、ブチルエチルエーテル、ｔ−アミルメチルエーテル、クロロホルム、２，２，５，５−テトラメチルＴＨＦ、トルエン、四塩化炭素、酢酸ｎ−ブチル、ベンゼンまたはアニソールである第８項の方法。
【０１２２】
１０． 該反応媒体がまた有機求核剤を含んでおり、ここで、この求核剤が、アルコール類、アミン類、アミノアルコール類、チオール類およびオキシム類から成る群から選択される１員である第１項の方法。
【０１２３】
１１． 該求核剤がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、シクロヘキシルメタノール、フェネチルアルコールおよびジイソプロピルアミンから成る群から選択される１員である第１０項の方法。
【０１２４】
１２． 該求核剤がメタノール、ｎ−ブタノール、ジイソプロピルアミンまたはフェネチルアルコールである第１１項の方法。
【０１２５】
１３． ＳＰ−４３５リパーゼ、プロテアーゼＮ、アルカラーゼ、プロレザー、リパーゼＡＰ１２から成る群から選択される酵素類の組み合わせで八酢酸スクロースを同時もしくは逐次的に処理することを含み、ここで、上記組み合わせは、該八酢酸スクロースの４−、１’−および６’−位または６−、１’−および６’−位のエステル基を脱アセチル化する目的で選択され、そしてこのようにして生じさせた６，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースまたは４，２，３，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースか或はこれらの両方を回収することを含む第１項の方法。
【０１２６】
１４． １’−酢酸スクロースをアルカラーゼで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２７】
１５． １’−酢酸スクロースをプロレザーで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２８】
１６． １’−酢酸スクロースをプロテアーゼＮで処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１２９】
１７． ４’−酢酸スクロースをプロテアーゼＮで処理することによりこの４’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３０】
１８． ６’−酢酸スクロースをプロテアーゼＮで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３１】
１９． １’−酢酸スクロースをリパーゼＡＹ３０で処理することによりこの１’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３２】
２０． ４’−酢酸スクロースをリパーゼＡＹ３０で処理することによりこの４’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３３】
２１． ６’−酢酸スクロースをＳＰ−４３５リパーゼで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３４】
２２． ４−酢酸スクロースをリパーゼＡＰ１２で処理することによりこの４−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３５】
２３． ６−酢酸スクロースをリパーゼＡＰ１２で処理することによりこの６−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１３６】
２４． （ａ）アルカラーゼまたはプロレザーで八酢酸スクロースを処理することにより２，３，４，６，１’，３’，４’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，６，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルスクロースとの混合物を生じさせ、そして
（ｂ）段階（ａ）の生成物をアルカラーゼまたはプロレザーで処理することにより２，３，４，６，３’，４’−ヘキサ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる、
段階を含む第１項の方法。
【０１３７】
２５． 段階（ｂ）の生成物を更にアルカラーゼまたはプロレザーで処理することにより２，３，６，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる第２４項の方法。
【０１３８】
２６． 段階（ｂ）の生成物を更にリパーゼＡＰ１２で処理することにより２，３，６，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースと２，３，４，３’，４’−ペンタ−Ｏ−アセチルスクロースを生じさせる第２４項の方法。
【０１３９】
２７． 該有機溶媒がエーテルである第２４項の方法。
【０１４０】
２８． 該有機溶媒がエーテルである第２５項の方法。
【０１４１】
２９． 該有機溶媒がエーテルである第２６項の方法。
【０１４２】
３０． 該反応媒体がエーテルとアルコールの混合物である第２７項の方法。
【０１４３】
３１． 該反応媒体がエーテルとアルコールの混合物である第２８項の方法。
【０１４４】
３２． 該反応媒体がエーテルとアルコールの混合物である第２９項の方法。
【０１４５】
３３． ６’−酢酸スクロースをアルカラーゼで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１４６】
３４． ６’−酢酸スクロースをプロレザーで処理することによりこの６’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
【０１４７】
３５． ４’−酢酸スクロースをリパーゼＩＩ型で処理することによりこの４’−位のエステル基を脱アセチル化することを含む第１項の方法。
Claims (1)
- 少なくとも６個のエステル基を有するスクロースエステルの酵素触媒脱アシル化によるスクロースの部分アシル化誘導体の製造方法において、このスクロースエステルを溶解し得る有機溶媒を含む無水反応溶媒の中で、オクタアシル化スクロース、ヘプタアシル化スクロースおよびヘキサアシル化スクロースから成る群から選択されるスクロースエステルを、上記スクロースエステルの脱アシル化を触媒し得る加水分解酵素または加水分解酵素の組み合わせで処理することにより、予め選択した一の位置または複数の位置においてその出発スクロースエステルよりも少なくとも１個多い遊離ヒドロキシル基を有する部分脱アシル化されたスクロース誘導体を生じさせた後、その得られる部分脱アシル化スクロース誘導体を回収することを含む方法。
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