CN103949228B - 一种外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其步骤为：A以Fe₃O₄为磁性粒子，乙醇和蒸馏水为反应溶剂，TEOS为分子前驱体，得磁性硅胶微球；B以无水甲苯为溶剂，将磁性硅胶微球与KH-550反应，得氨基化磁性硅胶微球；C以双酚A为模板分子，TEOS和PTMS为交联剂，HCl为催化剂，与氨基化磁性硅胶微球反应，洗脱模板分子，得双酚A印迹磁性硅胶微球；D将双酚A印迹磁性硅胶微球与KH-560反应，水解，得外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球。本发明的方法具有制备简单、选择性强、富集性好、分离效率高的优点，可有效排阻生物大分子，减少处理后样品的杂质，可在样品前处理的分离萃取中广泛使用。

Description

一种外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法

技术领域

本发明涉及萃取分离材料的制备方法，具体地说涉及一种能够排阻生物大分子的外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法。

背景技术

双酚A（BPA）是一种重要的化工原料，主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚酚氧等，其广泛存在于人们日常生活所接触到的食品包装袋、婴儿奶瓶等塑料制品中。在使用过程中双酚A有可能迁移到食品中，被人食入后可在人体内与雌激素受体结合，从而影响人体正常的内分泌代谢活动，可能会引发如糖尿病、心脏病、肥胖和乳腺癌等一系列疾病。鉴于其存在安全隐患，世界各国对食品包装材料中双酚A及其衍生物的溶出量有严格限制，如欧盟规定其迁移量为3mg/kg，日本为2.5mg/kg，美国为0.05mg/kg，中国为0.05mg/kg。为此，针对双酚A的迁移检测，已经成为目前国际上研究的热门课题。目前，分析测定双酚A的方法有气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、高效液相色谱和毛细管电泳等。而决定这些方法的准确性和精确度的关键步骤是样品的前处理，即从被测样品中萃取并富集所要测得的双酚A物质。

分子印迹聚合物是通过分子印迹技术合成的对目标分子及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物，已广泛应用于分离提纯、免疫分析、催化作用以及固相萃取等方面，其具有对目标分子特异性识别能力、吸附选择性好、便于功能设计、可重复利用等优点。磁性聚合物微球是一种由磁性材料和非磁性聚合物材料复合而成的新型功能微球，已广泛应用于生物分离、药物控释、疾病诊断等领域，它能够在外加磁场的作用下快速萃取分离溶液中的目标分析物，其具有操作简单、效率高、成本低、安全性好等优点，但存在选择性差的问题。为此，人们将磁性与分子印迹技术相结合，得到兼具磁性快速分离和分子特异性识别的磁性分子印迹聚合物微球（MMIPMs）。如CN102304211A公开了一种双酚A亚微米磁性分子印迹的制备及在包装食品检测前处理中的应用，其主要通过水热法合成磁性亚微米材料Fe₃O₄；再采用溶胶凝胶法合成硅包磁（Fe₃O₄SiO₂）微球，将合成出的Fe₃O₄SiO₂和二溴异丁酰溴进行偶联形成表面带Br基团的Fe₃O₄SiO₂Br，通过原子自由基转移法合成表面分子印迹亚微米粒子（Fe₃O₄MIP）。该材料具有比表面积相对较大，吸附效率高，高特异性选择性吸附能力等特性。又如朱丽丽等研究了核壳结构的双酚A磁性纳米分子印迹聚合物的合成及应用[分析化学,11期,1724-1728]，其方法是采用了三步细乳化法合成的：（1）将OA-Fe₃O₄分散在氯仿中，边搅拌边滴加到含SDS的水溶液中，超声细乳化得细乳液A；（2）将MMA、EGD-MA、BPA、CA和异丙醇混合均匀后，加入到含SDS的水溶液中，超声细乳化得到细乳液B；（3）将细乳液A、B混合，并通氮除氧，加入过硫酸钾，反应，洗脱模板分子，即得双酚A磁性纳米分子印迹聚合物。该方法制备的磁性纳米分子印迹聚合物能够高效地测定湖水中双酚A的含量。但是，在实际使用过程中发现，这些方法制备的硅胶微球材料用于分离富集样品中的小分子化合物时，其样品中的生物大分子如蛋白质、核酸等遇到磁性微球时，会吸附在其表面上，这种现象不仅影响待测物的吸附效率，而且严重干扰仪器对待测物后续检测的准确性和精确度。因此，如何使制备的分子印迹磁性硅胶微球的内表面能够高效选择吸附待测小分子，而外表面亲水排阻生物蛋白等大分子，减少分离待测物中的杂质，提高检测的准确性和精确度是目前行业内亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的就是提供一种外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，以解决现有方法制备的硅胶微球在分离样品时由于其外表面容易吸附生物大分子而导致分离效率低、杂质含量高、对检测干扰大的问题。

本发明的目的是这样实现的：一种外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，包括以下步骤：

A、将Fe₃O₄磁性纳米粒子溶于由乙醇和蒸馏水组成的混合溶剂中，用氨水调节溶液的pH值至8-9，超声分散，加入四乙氧基硅烷（TEOS），搅拌，洗涤，干燥，得磁性硅胶微球；所述Fe₃O₄磁性纳米粒子、混合溶剂及四乙氧基硅烷的质量体积比为1g:200ml:4ml；所述乙醇和蒸馏水的体积比为1-9:1；

B、将所述磁性硅胶微球溶于无水甲苯溶剂中，加入氨丙基三乙氧基硅烷（KH-550），回流，洗涤，干燥，得氨基化磁性硅胶微球；所述磁性硅胶微球与氨丙基三乙氧基硅烷的质量体积比为1:4；

C、将双酚A模板分子溶于甲醇溶剂中，加入所述氨基化磁性硅胶微球，搅拌回流，加入交联剂和催化剂，室温反应后，用洗脱液洗脱模板分子，得双酚A印迹磁性硅胶微球；其中交联剂是由体积比为1:1的四乙氧基硅烷（TEOS）和苯基三甲氧基硅烷（PTMS）组成的混合物；催化剂是摩尔浓度为1.0mol/L的HCl溶液，所述双酚A、氨基化磁性硅胶微球、交联剂及催化剂的质量体积比为1g:1g:8ml:2ml；

D、将双酚A印迹磁性硅胶微球分散到无水甲苯溶剂中，加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560），搅拌回流，洗涤，干燥，得到的产物用H₂SO₄水解，将水解产物水洗至中性，干燥，即得外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球；所述双酚A印迹磁性硅胶微球、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为1:4。

本发明步骤A中乙醇和蒸馏水的体积比为1-9:1，更优选4:1。在制备反应中乙醇和蒸馏水体积的比值对磁性硅胶微球的分散性起关键作用，当乙醇和蒸馏水的体积比为4:1时，其制备的磁性硅胶微球分散均匀、粒径大小适度，外形美观。

本发明步骤B中所述磁性硅胶微球与无水甲苯的质量体积比为1:100。

本发明步骤B中所述回流时间为8h。

本发明步骤C中双酚A与甲醇的质量体积比为1:100。

本发明步骤C中所述洗脱液为甲醇和盐酸按体积比为1:1组成的混合液。

本发明步骤D中所述双酚A印迹磁性硅胶微球与无水甲苯的质量体积比为1:100。

本发明步骤D中所述H₂SO₄的摩尔浓度为0.1mol/L，所述双酚A印迹磁性硅胶微球与硫酸的质量体积比为1:100。

本发明首先制备了磁性硅胶微球，再对磁性硅胶微球进行氨基表面修饰，进一步加入模板分子制备了双酚A印迹磁性硅胶微球，最后对双酚A印迹磁性硅胶微球进行环氧基表面修饰，通过这样层层组装，制得了内表面疏水-外表亲水的反向结构的分子印迹磁性硅胶微球。本发明在制备过程中通过巧妙合理的设计，控制了材料外表面的亲水基团、内部孔径以及作用位点，在分离萃取时，可以使得样品中的模板小分子化合物选择性地快速进入，并吸附和富集在材料的内部孔穴中，而样品中的生物大分子被排阻在材料的外层，从而，在实现待测目标物快速分离的同时，达到其杂质含量明显降低、检测的准确性和精确度显著提高的目的。

本发明提供的分子印迹磁性硅胶微球具有制备简单、粒径均匀、选择性强、萃取分离速度快、富集强、对样品基质净化好、可控制等优点，可在样品前处理的分离萃取中广泛使用。

附图说明

图1是本发明材料的合成机理图。

图2是实施例1制备的材料的扫描电镜图。

图3是实施例1制备的双酚A分子印迹硅胶微球的红外光谱分析图。

图4是实施例1制备的材料对大分子排阻能力图。

图5是实施例1制备的材料的结构反相特性图。

图6是实施例1制备的材料的富集特性图。

图7是实施例1制备的材料分离的样品的检测色谱图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

（1）制备磁性硅胶微球：称取0.5gFe₃O₄，加入到80ml乙醇和20ml蒸馏水混合溶剂，再用2.5ml氨水（25-28%，w/w）调节溶液的pH值，使其溶液的pH值保持在8-9之间，超声分散5min，逐滴加入2ml四乙氧基硅烷，室温下机械搅拌12h。收集产物，将产物用蒸馏水洗涤3-4次，在60℃下干燥12h，得到磁性硅胶微球，其电镜扫描图为图2（c）所示。从图2对比可以看出，图2(c)合成的磁性硅胶微球分散性很好，且粒径大小均匀，外形美观。

（2）制备氨基化磁性硅胶微球：取0.5g磁性硅胶微球分散到50ml无水甲苯中，再加入2ml硅烷KH-550，在氮气的保护下，回流8h。得到的产物分别用甲苯、乙醇洗涤4次，在40℃下干燥12h,得到氨基化磁性硅胶微球。

（3）制备双酚A印迹磁性硅胶微球：取0.5g双酚A（BPA）溶解于50ml甲醇中，在搅拌下加入0.5g氨基修饰的磁性硅胶微球，搅拌并回流30min后，加入2ml四乙氧基硅烷（TEOS）和2ml苯基三甲氧基硅烷（PTMS），1ml1.0mol/LHCl，在室温下反应15h。得到的产物分别用乙醇、蒸馏洗涤4次，在80℃下干燥12h。取上述合成的微球，加入25ml甲醇和25ml1.0mol/LHCl组成的混合液，搅拌3h。收集产物，用水洗至中性。产物80℃下干燥12h，得到双酚A印迹磁性硅胶微球。

对双酚A印迹磁性硅胶微球进行红外扫描测定，其红外光谱图如图3所示。从图中可知：578.00cm^-1处为Fe₃O₄的特征吸收峰，1081.68cm^-1处为Si-O-Si和Si-O-H的伸缩振动峰，1563.66cm^-1处为N-H伸缩振动峰，2972.64cm^-1处为C-H伸缩振动峰，说明微球表面已经修饰上氨基，1450.00,1511.43和1620.01cm^-1处为苯环骨架伸缩振动峰，说明苯基三甲氧基硅烷已经成功包覆在磁性硅胶微球的表面。

（4）制备外表面亲水的双酚A分子印迹磁性硅胶微球：取0.5g双酚A印迹磁性硅胶微球分散到50ml无水甲苯中，加入2mlKH-560，在氮气保护下，搅拌回流12h，收集产物，分别用乙醇、水洗涤4次，60℃下干燥12h，将干燥产物，加入到50ml0.1mol/LH₂SO₄中,搅拌下室温反应12h，收集产物，用蒸馏水洗至中性，60℃下干燥12h，得到外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球。其合成的机理图如图1所示。

实施例2

在制备磁性硅胶微球时，以90ml乙醇和10ml蒸馏水为反应溶剂，其余步骤同实施例1。其制备的磁性硅胶微球的电镜扫描图如图2(a)所示。

实施例3

在制备磁性硅胶微球时，以50ml乙醇和50ml蒸馏水为反应溶剂，其余步骤同实施例1。其制备的磁性硅胶微球的电镜扫描图如图2(b)所示。

对比例1

制备非印迹磁性硅胶微球(NIPs)：其制备方法同实施例1，仅在制备过程中不添加双酚A。

实施例4

测定实施例1合成的材料对蛋白大分子的排阻能力。具体实施方法如下：

将上述制备的亲水性分子印迹磁性硅胶微球，采用匀浆填充法装入不锈钢柱（55×4.6mm）内,再分别配制40mg/ml的牛血清蛋白和溶菌酶溶液，进行在线高效液相色谱分析。液相色谱条件：流动相：水/乙腈60:40(v/v)+0.050M磷酸氢二钠；进样体积：10μL；紫外检测波长：280nm；流速：1.00ml/min。

测定结果如图4所示：牛血清蛋白（分子量66.430kDa）和溶菌酶（分子量14.4kDa）在不锈钢柱中的保留时间相同，由此可以说明本发明合成的亲水性分子印迹磁性硅胶微球具有良好的蛋白大分子排阻能力。

实施例5

测定实施例1合成材料结构的反向特性。具体实施方法如下：

配制0.1mg/ml苯萘蒽的混合溶液，其填充的不锈钢柱的制备同实施例4，进行在线高效液相色谱分析。液相色谱条件：流动相：水/乙腈25:75(v/v)；进样体积：10μL；紫外检测波长：254nm；流速：0.5ml/min。

测试结果如图5所示，由图5可知以苯、萘、蒽为测试溶剂，在所选洗脱条件下，苯、萘、蒽的洗脱顺序证实了本发明制备的材料具有内表面疏水、外表面亲水的反相色谱行为，其具有明显的反相结构特性。

实施例6

测定实施例1合成材料的高选择性能。具体实施方法如下：

选择四溴双酚A和对苯二酚为双酚A的类似物，进行选择性考察。分别取30mg实施例1制备的亲水性分子印迹磁性硅胶微球和对比例1制备的非印迹磁性硅胶微球，加入到10ml100mg/L双酚A(BPA)，四溴双酚A(TBBPA)和对苯二酚(HQ)的混合溶液中，在水平振荡器中，常温吸附12h,最后用小磁铁分离得到上清液，上清液的浓度用高效液相色谱检测。液相色谱条件：流动相：水/甲醇30:70(v/v)；进样体积：10μL；紫外检测波长：278nm；流速：1.00ml/min。

如表1所示，通过溶液的初始浓度和吸附后的平衡浓度，用以下公式计算出了分配系数(K _D)，选择性系数(k)，相对选择性系数(k′)。

分配系数={(初始浓度-平衡浓度)/平衡浓度}*(溶液的体积/微球的质量)

选择性系数=分配系数(双酚A)/分配系数(类似物)

相对选择性系数=选择性系数(印迹微球)/选择性系数(非印迹微球)

检测结果如表1。

表1合成材料的选择性

由表1中数据得知，亲水性分子印迹磁性硅胶微球对双酚A分子的选择性高于四溴双酚A和对苯二酚，说明在印迹微球的制备过程中，形成了具有稳定的定向选择性结合位点及空穴。

实施例7

测定实施例1合成材料的富集特性。具体实施方法如下：

取20ml0.1mg/L双酚A、四溴双酚A和对苯二酚标准混合溶液加入到锥形烧瓶中，50mg的亲水性分子印迹磁性硅胶微球加入到另一个锥形烧瓶中，加入3.00ml甲醇和3.00ml水进行处理后，微球通过磁铁棒分离，再放入到装有标准混合溶液的锥形瓶中萃取分析物，将混合物搅拌20min，随后将亲水性分子印迹磁性硅胶微球转移到试管中，用2.00ml蒸馏水淋洗，2.00ml1.5%乙酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并氮吹至干，用1.00ml流动相重溶解，通过高效液相色谱分析。色谱条件：流动相：水/甲醇30:70(v/v)；进样体积：10μL；紫外检测波长：278nm；流速：1.00ml/min。

富集因子=富集后的浓度/初始浓度

如图6所示，通过计算，富集因子分别是18.34（BPA）、17.52（TBBPA）和16.44（HQ），由此可见，本发明所制备的亲水性分子印迹磁性硅胶微球对双酚A分子有较好的富集作用。

实施例8

测定实施例1合成材料的净化排杂性能。具体实施方法如下：

将一袋塑料包装的牛奶，在沸水中浸泡30min后，冷却至室温，取5g放入锥形瓶中，加标量为0.1mg/kg，然后向锥形瓶中加入3ml三氯乙酸（2.5%，V/V），振荡1min后，离心，收集上清液，用2ml甲醇再萃取沉淀物2次，合并上清液和萃取液，旋蒸后用5ml甲醇重溶解，调节pH至6.0，待测。10mg的亲水性分子印迹磁性硅胶微球加入到另一个锥形烧瓶中，加入2.00ml甲醇和2.00ml水进行处理后，微球通过磁棒分离，再放入到装有样品的锥形瓶中萃取分析物，将混合物搅拌20min，随后将亲水性分子印迹磁性硅胶微球转移到试管中，用2.00ml蒸馏水淋洗，2.00ml1.5%乙酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并氮吹至干，用1.00ml流动相重溶解，通过高效液相色谱分析。色谱条件：流动相：水/甲醇30:70(v/v)；进样体积：10μL；紫外检测波长：278nm；流速：1.00ml/min。

检测结果显示：图7(a)为样品加标后直接进样色谱图，图7(b)为加标样品经过磁性微球净化后色谱图。可以看出，本发明所制备的亲水性分子印迹磁性硅胶微球有效排阻了样品中目标分子以外的其他杂质，显著提高了其检测的准确性和精确度。

Claims (9)

1.一种外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

A、将Fe₃O₄磁性纳米粒子溶于由乙醇和蒸馏水组成的混合溶剂中，用氨水调节溶液的pH值，超声分散，加入四乙氧基硅烷，搅拌，洗涤，干燥，得磁性硅胶微球；所述Fe₃O₄磁性纳米粒子、混合溶剂及四乙氧基硅烷的质量体积比为1g:200ml:4ml；所述乙醇和蒸馏水的体积比为1-9:1；

B、将所述磁性硅胶微球溶于无水甲苯中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，回流，洗涤，干燥，得氨基化磁性硅胶微球；所述磁性硅胶微球与氨丙基三乙氧基硅烷的质量体积比为1:4；

C、将双酚A模板分子溶于甲醇中，加入所述氨基化磁性硅胶微球，搅拌回流，加入交联剂和催化剂，室温反应后，用洗脱液洗脱模板分子，得双酚A印迹磁性硅胶微球；其中交联剂是由体积比为1:1的四乙氧基硅烷和苯基三甲氧基硅烷组成的混合物；催化剂是摩尔浓度为1.0mol/L的HCl溶液，所述双酚A、氨基化磁性硅胶微球、交联剂及催化剂的质量体积比为1g:1g:8ml:2ml；

D、将双酚A印迹磁性硅胶微球分散到无水甲苯中，加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，搅拌回流，洗涤，干燥，得到的产物用H₂SO₄水解，将水解产物水洗至中性，干燥，即得外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球；所述双酚A印迹磁性硅胶微球、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为1:4。

2.根据权利要求1所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤A中乙醇和蒸馏水的体积比为4:1。

3.根据权利要求1或2所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤B中所述磁性硅胶微球与无水甲苯的质量体积比为1:100。

4.根据权利要求3所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤B中所述回流时间为8h。

5.根据权利要求4所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤C中双酚A与甲醇的质量体积比为1:100。

6.根据权利要求5所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤C中所述洗脱液为甲醇和盐酸按体积比为1:1组成的混合液。

7.根据权利要求6所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤D中所述双酚A印迹磁性硅胶微球与无水甲苯的质量体积比为1:100。

8.根据权利要求7所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤D中所述H₂SO₄的摩尔浓度为0.1mol/L。

9.根据权利要求8所述外表面亲水的分子印迹磁性硅胶微球的制备方法，其特征是，步骤D中所述双酚A印迹磁性硅胶微球与H₂SO₄的质量体积比为1:100。