CN104181258B - 基于石墨烯的糖蛋白n-糖链一步法富集-衍生化处理及maldi-tof-ms分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析方法。该方法包括糖蛋白N-糖链的酶解释放，使用将石墨烯和芘丁酸酰肼一步法富集-衍生化N-糖链，N-糖链洗脱和质谱分析等步骤。本发明利用芳香族化合物和石墨烯独特的π-π共轭相互作用，以及含酰肼或者氨基官能团的芳香族化合物和N-糖链的半缩醛的特异性高效共价偶联反应，可以实现N-糖链的一步法富集-衍生化，在对N-糖链进行特异性富集的同时，完成高效衍生化。因此，该方法不但避免了繁杂的操作步骤，提高了样品处理通量并且显著降低了样品损失。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析方法。
背景技术
人体50％以上的蛋白质都带有糖基化修饰。糖基化参与了几乎所有重要的生命过程，例如受精、发育、免疫应答、细胞间识别及通讯等。其中，蛋白质N-糖链的组成和结构对糖基化蛋白质的构象、功能以及与其它生物分子的相互作用都具有巨大的影响。同时也有研究表明，多种疾病的发生发展过程中都伴随着蛋白质N-糖链组成和结构的改变，如肿瘤、自身免疫疾病、糖尿病等。因此，高通量、高灵敏度的N-糖链检测技术对于阐明糖链在各个生理过程和疾病发生发展中的作用及对于临床诊断标志物的发现显得尤为重要。但是N-糖链本身含量有限，并具有高度微不均一性，同时易受高丰度蛋白质、肽段、核酸及盐类等的干扰，导致质谱分析时信号易受抑制。而且，由于糖链是一种多羟基化合物，其疏水性差及离子化效率低等特点进一步加剧了其质谱检测的难度。
基于以上原因，发展高效的N-糖链富集及检测技术，对于复杂生物样品中的N-糖链分析是十分必要的。凝集素亲和色谱、石墨柱固相萃取及亲水相互作用色谱是常见的糖链富集方法。然而，每种凝集素只对特定的糖型具有富集作用，难以实现全部糖链的富集检测；其次，虽然石墨柱和亲水色谱可以实现糖链的无差异化富集，但是由于其与糖链的作用属于物理相互作用，特异性较差，常伴有一些亲水性杂质(例如肽段、核酸和盐类)的共洗脱。此外，对糖链进行化学衍生化，提高其疏水性和结合质子能力，可以提高其在质谱中的信号响应。然而，现有衍生化方法往往需要较繁杂的操作步骤，导致不必要的样品损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理方法。
本发明所提供的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理方法，包括下述步骤：
1)使糖蛋白N-糖链酶解释放；
2)将石墨烯、含酰肼或氨基的芳香族化合物和经步骤1)处理后的待富集的N-糖链一起孵育，得到了富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品。
其中，步骤1)中使糖蛋白N-糖链酶解释放的方法具体如下：将糖蛋白溶于碳酸氢铵溶液或磷酸盐缓冲液中，并加热变性，待冷却后加入肽N-糖苷酶F进行酶解反应，使N-糖链完全释放。
所述糖蛋白包括标准糖蛋白和含糖蛋白的复杂生物样品；所述碳酸氢铵溶液为pH＝6.0-9.0、浓度为25-500mM的碳酸氢铵溶液；所述磷酸盐缓冲液为pH＝6.0-9.0的磷酸盐缓冲液；所述糖蛋白的浓度为1mg/mL；所述加热变性的温度为90-100℃、时间为3-20min；所述肽N-糖苷酶F的加入量为：每100μg糖蛋白加入1-100U肽N-糖苷酶F；所述酶解反应条件为：25-38℃水浴中孵育2-20h。
标准糖蛋白N-糖链的酶解释放。以去唾液酸胎球蛋白为例，将其溶解于50mM碳酸氢铵(pH＝8.0)或磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)中，浓度为1mg/mL。之后95℃加热变性10min，待冷却后按照1U肽N-糖苷酶F(PNGaseF)：100μg标准糖蛋白的比例加入适量PNGaseF，在37℃水浴中孵育16h，将N-糖链完全释放。之后将所得样品冻存于4℃条件下备用。
复杂蛋白质样本(如离体的人血浆或胎球蛋白)中糖蛋白N-糖链的酶解释放。以人血浆为例：将人血浆样品用50mM碳酸氢铵(pH＝8.0)或磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)稀释至蛋白质浓度约为1mg/mL，之后95℃加热变性10min，待冷却后以1UPNGaseF：100μg蛋白质的比例加入所需的酶，37℃水浴16h，酶解糖蛋白释放糖链。
步骤2)中所述含酰肼或氨基的芳香族化合物中的芳香基部分可以含有1、2、3或3个以上的苯环，具体为苯、联苯、菲或芘。所述含酰肼或氨基的芳香族化合物优选酰肼类芳香化合物，具体可为芘丁酸酰肼(PBH)或苯甲酰肼等。所述的PBH具有酰肼官能团，可以糖链还原端的醛基进行共价偶联；同时，芘环也可以通过与石墨烯的π-π共轭相互作用吸附于其上，实现对微量糖链的一步法富集-衍生化。
步骤2)中所述石墨烯的加入量对于芳香族化合物是过量的。以PBH为例，石墨烯和PBH的配比可以大于等于1mg∶15nmol。
步骤2)中所述芳香族化合物对于所需富集糖链的量也是过量的。以PBH为例，PBH和糖链的摩尔配比可以大于等于50∶1。
步骤2)中所述孵育在含有酸性催化剂或者碱性催化剂的有机溶剂中进行；所述酸性催化剂具体选自下述至少一种：甲酸、乙酸、三氟乙酸和三氟甲酸；优选乙酸，其质量浓度可为0.1％-10％，优选为0.5％。所述碱性催化剂具体选自下述至少一种：碳酸氢铵、氨水和氢氧化钠；所述有机溶剂选自下述至少一种：甲醇、四氢呋喃、乙腈和二甲基亚砜，优选为甲醇。
步骤2)中所述孵育的温度为50-95℃，优选为90℃；所述孵育的时间为10-60min，优选为60min。
本发明还提供了一种对糖蛋白N-糖链进行MALDI-TOF-MS分析的方法。
该方法包括下述步骤：
1)按照上述方法对糖蛋白N-糖链进行一步富集-衍生化，得到富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品；
2)对所述富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品分别用去离子水及甲醇洗涤，以去除非特异性吸附的或其他未结合的亲水或者疏水杂质，然后将洗涤后的样品用二甲基甲酰胺(DMF)洗脱后进行MALDI-TOF-MS分析。
在用4800ProteomicAnalyzer上进行MALDI-TOFMS分析时，选定正离子反射模式(positivereflectormode)，加速电压20KV，扫描范围为m/z1000-4000，激光能量为6000，每张质谱图由总激光发射脉冲次数为1000质谱图平均累计产生。在数据采集前，用马心肌肌红蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作为标准物校正仪器的绝对准确度至0.1Da，相对标准偏差至10ppm。用DateExplorerSoftware4.5计算每个离子的单同位素峰的面积，衍生化效率定义为发生衍生化后糖链的[M+Na]+与未发生衍生化的[M+Na]+峰面积之比；回收率定义一步法富集之后糖链的[M+Na]+与富集之前糖链的[M+Na]+峰面积之比。基质为5mg/mL2，5-二羟基苯甲酸的50％乙腈和50％水(质量浓度0.1％三氟乙酸)溶液。取1μL待分析样品置于不锈钢板上使其自然风干，之后取1μL基质使样品充分结晶以待分析。
本发明中所使用的石墨烯可以通过商业途径获得，也可按照如下方法制备得到。
具体制备方法包括a)和b)两个步骤。
a)氧化石墨烯的制备。通常，将0.5g磷片石墨和0.5gNa2NO3加入到23mL预冷的浓硫酸中。随后，向其中缓慢加入4gKMnO4。将所得混合物在冰浴下搅拌10min后转移到35℃水浴下搅拌。1h之后将40mL去离子水缓慢滴加到上述体系中，同时使该体系的温度维持在90至95℃。1h之后向其中加入100mL去离子水及3mLH2O2并将该反应溶液在室温搅拌2h。随后，将所得产物用1000mL含5mLHCl的去离子水洗涤并且随后用去离子水洗涤直至洗脱液的pH变为中性。最后将所得产物在50℃真空干燥24h得到所需的氧化石墨烯；
b)将上述得到的氧化石墨烯用NaBH4进行还原处理得到石墨烯。通常，将20mLNaBH4溶液(1M)加入到100mL氧化石墨烯溶液(100mg)中并搅拌均匀。随后用10wt％Na2CO3将体系的pH调节至10。将所得产物在90℃加热1h之后，将其温度冷却至室温。最后，将所得产物用去离子水和乙醇溶液分别洗涤3次之后将其真空干燥得到所需的石墨烯。
以PBH为例，对本发明方法的原理进行如下说明：
如图1所示，PBH由于具有四个共轭苯环和一个酰肼官能团，一方面可以通过π-π共轭和石墨烯发生相互作用，吸附于其表面，另一方面也可以通过酰肼官能团和N-糖链的半缩醛发生高特异、高效的共价偶联，从而实现N-糖链的选择性富集。同时，由于PBH-糖链偶联物和PBH以及其他杂质在石墨烯上的吸附能力不同，可以通过调节洗脱溶剂将PBH-糖链偶联物选择性洗脱，之后无需脱盐便可直接进行质谱分析，大大简化了样品处理步骤，减少样品损失，从而达到对所需检测糖链的高效富集-衍生化。
本发明所提供的基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析方法可以用于标准寡糖麦芽七糖(DP7)的高效富集及衍生化。在存在高丰度蛋白质(DP7∶BSA＝1∶50，质量比)干扰的情况下，仅需将所需富集的DP7和BSA混合物与适量的PBH及石墨烯溶解于含0.5％乙酸的甲醇溶液中在90℃下孵育1h。弃去上清后，将所得石墨烯样品用去离子水及甲醇分别洗涤3次之后，将所富集-衍生化的DP7用DMF洗脱，并进行MALDI-TOF-MS分析。该方法有效去除了BSA对DP7检测信号的干扰，并提高了DP7的质谱信号相应，使其在MALDI-TOF-MS质谱中的信号强度提高了33倍。
标准糖蛋白N-糖链的一步法富集-衍生化方法：将N-糖链从糖蛋白上酶解释放出来，之后向体系中加入适量的PBH和石墨烯，并将所得混合物在含0.5％乙酸的甲醇中在90℃下孵育1h。弃去上清后，将所得石墨烯样品用去离子水及甲醇分别洗涤3次之后，将所富集的N-糖链用DMF洗脱之后进行MALDI-TOF-MS分析。经该富集-衍生化方法处理后，与未经处理直接检测、经亲水色谱富集或经2-肼基吡啶衍生化后的N-糖链样品相比，显著提高了N-糖链的质谱信号强度。
复杂蛋白质样本中糖蛋白N-糖链的一步法富集-衍生化处理方法。将N-糖链从糖蛋白上酶解释放出来。之后向体系中加入适量的PBH和石墨烯，并将所得混合物在含0.5％乙酸的甲醇中在90℃下孵育1h。弃去上清后，将所得石墨烯样品用去离子水及甲醇分别洗涤3次之后，将所富集的N-糖链经DMF洗脱之后进行MALDI-TOF-MS分析。该一步法富集-衍生化处理方法可以在人血浆样本中检测得到48种N-糖型。
本发明提供的技术方案具有以下优点：
1、石墨烯具有超大的比表面积和柔性结构，与待富集的低丰度样品有较高的碰撞几率和较小的空间位阻。同时石墨烯是由碳原子以Sp2杂化连接形成的单原子层二维结构，可以与芳香类化合物发生π-π共轭相互作用。利用芳香族化合物和石墨烯独特的π-π共轭相互作用，以及含酰肼或者氨基官能团的芳香族化合物和N-糖链的半缩醛的特异性高效共价偶联反应，可以实现N-糖链的一步法富集-衍生化，在对N-糖链进行特异性富集的同时，完成高效衍生化。因此，大幅度提高了糖链在质谱中的检测灵敏度。
2、由于芳香族化合物-糖链偶联物与芳香族化合物以及其它杂质(例如蛋白质、肽段、核酸和盐类等)在石墨烯上的吸附能力不同，可以通过优化洗脱条件，选择性洗脱芳香族化合物-糖链偶联物，因此无需后续脱盐处理便可直接进行质谱分析，且不会因杂质的共洗脱对质谱分析产生干扰。
3、本方法将N-糖链的富集、衍生化及脱盐步骤整合为一步，减少了繁杂的操作步骤，提高了样品处理通量并显著降低了样品损失。
附图说明
图1为本发明基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析方法的流程图。
图2为所制备石墨烯的原子力显微镜照片。
图3为石墨烯对PBH的吸附效率曲线以及PBH对DP7的衍生化效率曲线。
图4为DP7和BSA的混合物(1∶50，w/w)经一步法富集-衍生化之前(a)和之后(b)反射模式下DP7的MALDI-TOF-MS谱图。
图5为DP7和BSA的混合物(1∶50，w/w)经一步法富集-衍生化之前(a)和之后(b)线性模式下BSA的MALDI-TOF-MS谱图。
图6为PBH的液相色谱图，其中(a)为0.15mMPBH的DMF溶液(保留时间为4.8min)；(b)为0.15mMPBH吸附于石墨烯之后的DMF洗脱液。
图7为去唾液酸胎球蛋白的N-糖链，未经处理、经亲水色谱富集、2-肼吡啶衍生化及石墨烯和PBH一步法富集-衍生化处理之后的MALDI-TOF-MS谱图中质谱峰面积的对比图。
图8为人血浆中糖蛋白的N-糖链，未处理(A)以及经石墨烯和PBH一步法富集-衍生化处理之后的MALDI-TOF-MS谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，按照图1所示的流程进行实施，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所使用的石墨烯是按照下述方法制备得到的：
a)氧化石墨烯的制备。通常，将0.5g磷片石墨和0.5gNa2NO3加入到23mL预冷的浓硫酸中。随后，向其中缓慢加入4gKMnO4。将所得混合物在冰浴下搅拌10min后转移到35℃水浴下搅拌。1h之后将40mL去离子水缓慢滴加到上述体系中，同时使该体系的温度维持在90至95℃。1h之后向其中加入100mL去离子水及3mLH2O2并将该反应溶液在室温搅拌2h。随后，将所得产物用1000mL含5mLHCl的去离子水洗涤并且随后用去离子水洗涤直至洗脱液的pH变为中性。最后将所得产物在50℃真空干燥24h得到所需的氧化石墨烯。
b)将上述得到的氧化石墨烯用NaBH4进行还原处理得到石墨烯。通常，将20mLNaBH4溶液(1M)加入到100mL氧化石墨烯溶液(100mg)中并搅拌均匀。随后用10wt％Na2CO3将体系的pH调节至10。将所得产物在90℃加热1h之后，将其温度冷却至室温。最后，将所得产物用去离子水和乙醇溶液分别洗涤3次之后将其真空干燥得到所需的石墨烯。所制备的石墨烯由原子力显微镜表征得出平均厚度为0.97nm。(见图2)
实施例1：基于石墨烯的标准寡糖一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析
基于石墨烯和PBH的标准寡糖麦芽七糖(DP7)的一步富集及衍生化。
将10pmol的DP7标准品与500pmol的PBH(PBH)及0.1mg石墨烯混合于0.5mL含0.5％乙酸的甲醇中，在90℃下孵育1h。弃去上清后，将所得石墨烯样品用去离子水及甲醇分别洗涤3次之后，将所富集的糖链用DMF洗脱，并进行MALDI-TOF-MS分析。
质谱分析条件为：仪器为4800ProteomicAnalyzer，选定正离子反射模式(positivereflectormode)，加速电压20KV，扫描范围为m/z1000-4000，激光能量为6000，每张质谱图由总激光发射脉冲次数为1000质谱图平均累计产生。在数据采集前，用马心肌肌红蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作为标准物校正仪器的绝对准确度至0.1Da，相对标准偏差至10ppm。用DateExplorerSoftware4.5进行数据处理。基质为5mg/mL2，5-二羟基苯甲酸的50％乙腈和50％水(0.1％三氟乙酸)溶液(乙腈/水＝1/1，v/v)。取1μL待分析样品(富集的糖链)置于不锈钢板上使其自然风干，之后取1μL基质使样品充分结晶以待分析。为考察存在高丰度蛋白质干扰情况下该方法的富集和衍生化效率，以DP7和牛血清白蛋白(BSA)按质量比1∶50制备模拟复杂样本。经上述方法富集-衍生化后，有效的去除了BSA对DP7检测信号的干扰，并可使DP7在MALDI-TOF-MS质谱中的信号强度提高33倍。
图4为DP7&BSA(1∶50，w/w)混合物富集-衍生化之前(a，[M+Na]+＝1175.0)和之后(b，[M+Na]+＝1459.3)的MALDI-TOF-MS谱图(反射模式)。从图中可以看到，在BSA的干扰下，DP7在MALDI-TOF-MS中的信号较差，经过该富集衍生化处理之后，可以将其信号提高33倍。
图5为DP7&BSA(1∶50，w/w)混合物富集-衍生化之前(a)和之后(b)的MALDI-TOF-MS谱图(线性模式)。在富集-衍生化之前可以看到明显的BSA的质谱峰(Mv为66.4KDa)，经过富集-衍生化之后BSA的质谱峰基本消失。
图6为PBH的液相色谱谱图，A：0.15mMPBH溶于DMF；B：使用DMF洗脱经0.15mMPBH吸附的rGO。从图中可以看到，PBH可以吸附于rGO表面而不被DMF洗脱。
实施例2：基于石墨烯的标准糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析
将去唾液酸的胎球蛋白溶于50mM碳酸氢铵(pH＝8.0)或磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)中，浓度为1mg/mL。之后95℃加热变性10min，待冷却后以1U肽N-糖苷酶F(PNGaseF)∶100μg标准糖蛋白(去唾液酸胎球蛋白)的比例加入所需的酶，37℃水浴16h，以使其糖链充分释放。之后向体系中加入适量的PBH和石墨烯(其中，石墨烯和PBH的配比为1mg∶15nmol；PBH和糖链的摩尔配比为50∶1)，并将所得混合物在含质量浓度0.5％乙酸的甲醇中在90℃下孵育1h。弃去上清后，将所得石墨烯样品沉淀用去离子水及甲醇分别洗涤3次之后，将所富集的糖链用DMF洗脱，并对其进行MALDI-TOF-MS分析。
与亲水作用色谱富集及常规的衍生化试剂2-肼基吡啶衍生化相比，上述方法处理后得到胎球蛋白的四个N-糖链信号强度均有较大幅度的提高(见图7)。其中，亲水色谱实验条件为：取10μL酶切的胎球蛋白溶液将其上样于活化好的双羟基亲水填料中，之后用100μL80％乙腈和20％水(含0.1％三氟乙酸；乙腈/水＝8/2，v/v)溶液进行淋洗，最后用10μL含0.1％三氟乙酸的水溶液洗脱之后进行质谱分析。2-肼基吡啶对糖链的衍生化实验条件为：2-肼基吡啶和糖链以摩尔比为50∶1混合于含0.5％乙酸的0.5mL甲醇溶液中，在90℃下反应1h，得到2-肼基吡啶衍生化的糖链。
实施例3：基于石墨烯的人血浆糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析
将人血浆样品用50mM碳酸氢铵(pH＝8.0)或磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)稀释至蛋白质浓度约为1mg/mL，之后95℃加热变性10min，待冷却后以1UPNGaseF∶100μg蛋白质的比例加入所需的酶，37℃水浴16h，以使其糖链充分释放。之后向体系中加入适量的PBH和石墨烯(其中，石墨烯和PBH的配比为1mg∶15nmol；PBH和糖链的摩尔配比为50∶1)，并将所得混合物在含0.5％乙酸的甲醇中在90℃下孵育1h。弃去上清后，将所得石墨烯样品用去离子水及甲醇分别洗涤3次之后，将所富集的糖链经DMF洗脱之后进行MALDI-TOF-MS分析。该一步法富集-衍生化方法可以在人血浆样本中检测得到48种糖蛋白N-糖型(见图8)。
Claims (14)
1.一种对糖蛋白N-糖链进行MALDI-TOF-MS分析的方法，包括下述步骤：
1)对糖蛋白N-糖链进行一步富集-衍生化，得到富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品；
2)对所述富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品分别用去离子水及甲醇洗涤，然后将洗涤后的样品用二甲基甲酰胺洗脱后进行MALDI-TOF-MS分析；
所述对糖蛋白N-糖链进行一步富集-衍生化，包括下述步骤：
1)使糖蛋白N-糖链酶解释放；
2)将石墨烯、含酰肼或氨基的芳香族化合物和经步骤1)处理后的待富集的N-糖链一起孵育，得到了富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含酰肼或氨基的芳香族化合物中的芳香基部分含有1、2、3或3个以上的苯环。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含酰肼或氨基的芳香族化合物中的芳香基部分为苯、联苯、菲或芘。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含酰肼或氨基的芳香族化合物为芘丁酸酰肼或苯甲酰肼。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述石墨烯与含酰肼或氨基的芳香族化合物的配比大于等于1mg：15nmol；所述含酰肼或氨基的芳香族化合物和N-糖链的摩尔比大于等于50：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孵育在含有酸性催化剂或者碱性催化剂的有机溶剂中进行；所述酸性催化剂选自下述至少一种：甲酸、乙酸、三氟乙酸和三氟甲酸；所述碱性催化剂选自下述至少一种：碳酸氢铵、氨水和氢氧化钠；
所述有机溶剂选自下述至少一种：甲醇、四氢呋喃、乙腈和二甲基亚砜。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述孵育在含乙酸的有机溶剂中进行；所述有机溶剂中乙酸的质量浓度为0.1％-10％。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂中乙酸的质量浓度为0.5％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孵育的温度为50-95℃；所述孵育的时间为10-60min。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述孵育的温度为90℃；所述孵育的时间为60min。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使糖蛋白N-糖链酶解释放的方法如下：将糖蛋白溶于碳酸氢铵溶液或磷酸盐缓冲液中，并加热变性，待冷却后加入肽N-糖苷酶F进行酶解反应，使N-糖链完全释放。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述糖蛋白为标准糖蛋白或含糖蛋白的复杂生物样品；所述碳酸氢铵溶液为pH＝6.0-9.0、浓度为25-500mM的碳酸氢铵溶液；所述磷酸盐缓冲液为pH＝6.0-9.0的磷酸盐缓冲液；所述糖蛋白的浓度为1mg/mL；所述加热变性的温度为90-100℃、时间为3-30min；所述肽N-糖苷酶F的加入量为：每100μg糖蛋白加入1U肽N-糖苷酶F；所述酶解反应条件为：25-38℃水浴中孵育2-20h。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述MALDI-TOF-MS分析的质谱条件为：正离子反射模式；加速电压20KV，扫描范围为m/z1000-4000，激光能量为6000；所用的基质为含三氟乙酸的2,5-二羟基苯甲酸溶液，所述溶液中的溶剂为乙腈与水体积比1:1的混合溶剂，所述溶液中三氟乙酸的质量浓度为0.1％；所述溶液中2,5-二羟基苯甲酸的浓度为5mg/mL。
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