CN106198710B - 一种检测小分子化合物的方法及富勒烯标记物的应用 - Google Patents
一种检测小分子化合物的方法及富勒烯标记物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了富勒烯标记物作为质荷比位移试剂在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中检测氨基化合物的应用及其检测小分子化合物的方法，其中富勒烯标记物为富勒烯衍生物，含有能与小分子化合物反应的活性基团；所述小分子化合物为质荷比<500Da的小分子化合物。与通常用MALDI质谱检测小分子化合物所得到的复杂的基质加合峰不同，本发明将小分子化合物通过C60标记物衍生后能得到简洁单一的准分子离子峰M‑，不仅显著改善了这些氨基化合物在质谱谱图中的辨识度，也极大地提高了它们在质谱中的检测灵敏度。本发明灵敏度高、普适性强、操作简便、无基质干扰、样本损耗少，且无需制备复杂的基质和衍生化试剂，就可以定量检测样品中小分子化合物。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法及富勒烯标记物作为质荷比位移试剂的应用。
背景技术
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)自上个世纪八十年代末期被发展以来，已广泛应用于蛋白质，糖类，核酸，多肽等生物大分子以及高分子聚合物的结构分析与分子量测定。MALDI-TOF MS具有操作简便、检测速度快、通量高、抗干扰能力强、有机溶剂消耗少和样品用量少等优点。但是，由于传统的MALDI-TOF MS基质主要为低分子量的有机酸例如：α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA)，2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)，芥子酸(sinapinic acid，SA)，烟酸等，它们容易在低分子量区域(<500Da)产生大量基质信号峰，干扰小分子分析物的检测。为克服这一缺点，现有文献报道的解决策略主要分为两类：1)开发基质干扰小的基质，比如多孔硅、纳米微球、金属氧化物、碳材料等，但新的基质对分析小分子具有一定的局限性，只针对部分特定的小分子有作用，目前依然没有一种方便、广泛适用的基质被开发出来；2)利用化学衍生的办法，设计大分子衍生化试剂衍生小分子待测物，使其质荷比远离背景干扰区，但现有文献报道的衍生化试剂通常需要很繁琐的制备过程，并且有一定局限性。因此，在使用MALDI-TOF-MS分析小分子化合物时迫切需要发展一种简便的、高灵敏度、普适的衍生方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种MALDI-TOF-MS 检测小分子化合物的方法及富勒烯标记物作为位移试剂的应用，将小分子化合物通过富勒烯标记物衍生后，能克服MALDI-TOF-MS分析中低分子量区域的干扰，显著改善小分子化合物在质谱谱图中的辨识度，极大地提高了其在质谱中的检测灵敏度。
本发明为解决上述技术问题所提出的技术方案为：
富勒烯标记物作为质荷比位移试剂(m/z位移试剂)在MALDI-TOF-MS中检测小分子化合物的应用。
一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法，以富勒烯标记物作为质荷比位移试剂。
按上述方案，所述富勒烯标记物为富勒烯衍生物，含有能与小分子化合物反应的活性基团即可，所述活性基团如-COCl基团、-N＝C＝S基团、-CO-NHS基团等等。
按上述方案，本发明中所述的小分子化合物的质荷比<500Da。
按上述方案，本发明中所述的小分子化合物可以为氨基小分子化合物、羟基小分子化合物等。
按上述方案，所述氨基小分子化合物可以为氨基酸、脂肪胺、芳香胺等，所述羟基小分子化合物为脂肪醇与酚类化合物等，如甲醇、乙醇、苯酚。
一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法，包括如下步骤：
1)建立标准曲线：配制一系列不同浓度的小分子化合物标准品溶液，并用富勒烯标记物进行衍生化反应，所得标准品衍生产物中加入内标物后进行MALDI-TOF-MS分析，然后以小分子化合物标准品溶液的浓度为横坐标、标准品衍生产物与内标物峰强度比值为纵坐标建立标准曲线；
2)将富勒烯标记物与小分子化合物待测品进行衍生化反应，所得待测品衍生产物中加入内标物后进行MALDI-TOF-MS分析，得到待测品衍生产物的质谱图，将待测品衍生产物与内标物峰强度比值代入步骤1)所得标准曲线中，进而计算得到小分子化合物待测品的浓度。
按上述方案，所述内标物为含有羧酸基团、结构与衍生产物类似且不相同即可。
优选地，所述小分子化合物为氨基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式1所示，所述内标物结构如式2所示；所述小分子化合物为羟基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式3所示，所述内标物结构如式4所示；
按上述方案，所述步骤1)中小分子化合物为一种或几种。
按上述方案，所述步骤1)中小分子化合物的浓度范围是0.7-100μM。
按上述方案，所述步骤1)中小分子化合物标准品溶液与富勒烯标记物浓度比为1：(2- 4)。
按上述方案，所述步骤2)中富勒烯标记物的加入量与步骤1)相同。
按上述方案，所述步骤1)和步骤2)中衍生化反应的条件：溶剂为可将待测物与富勒烯标记物溶解的即可，反应条件为弱碱性，温度在20-70℃，时间为0.5-2h。其中，溶剂可以采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲苯等有机溶剂，弱碱性条件可以由三乙胺、氨水、4-二甲氨基吡啶等提供。该衍生化反应完成后，需要加入酸调节衍生产物的pH为中性，该酸可以采用甲酸等弱酸。
按上述方案，所述步骤1)和步骤2)中内标物的加入量以保证内标物的浓度在0.7-70 μM之间；优选地，所述步骤1)和步骤2)中内标物的加入量以保证内标物的浓度在20-40μM之间，即标准曲线线性范围的中间值区域。
按上述方案，所述步骤1)和步骤2)中MALDI-TOF-MS分析的条件是：所用的基质选用常用的有机基质即可，本发明优选为反-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈 (DCTB)。
本发明中富勒烯标记物作为质荷比位移试剂在MALDI-TOF-MS中检测小分子化合物的应用，该富勒烯标记物与小分子化合物进行衍生化反应，从而其从低分子区域拉至高分子区域，避免了MALDI-TOF-MS中低分子区段(<500Da)基质效应对检测的干扰，从而克服MALDI-TOF-MS在小分子化合物检测方面的劣势，开发了以功能化的C60标记物作为m/z位移试剂来衍生小分子代谢物的新型MALDI-TOF-MS检测手段，开拓MALDI-TOF-MS在代谢组学检测领域的应用。其中，所涉及氨基小分子化合物、羟基小分子化合物的衍生化反应过程如下所示：
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明使用富勒烯标记物对小分子化合物进行衍生化反应后进行MALDI-TOF-MS检测，能得到简洁单一的准分子离子峰M-，不仅显著改善了这些小分子化合物在质谱谱图中的辨识度，也极大地提高了它们在质谱中的检测灵敏度，这与通常检测小分子化合物所得到的复杂的基质加合峰明显不同。
2、本发明以富勒烯标记物作为质荷比位移试剂(m/z位移试剂)在MALDI-TOF-MS中检测小分子化合物的应用时，方法灵敏度高、普适性强、无基质干扰，且无需制备复杂的基质和衍生化试剂，就可以定量检测样品中小分子化合物，在代谢组学的研究中有很大的应用前景。
3、本发明中方法操作简便，待测物用富勒烯标记物标记后直接用MALDI-TOF-MS分析，具有快速、样品用量少等优点，特别适用于生物样品的分析。
4、本发明涉及的衍生方法可以显著提高小分子待测物在MALDI-TOF-MS中的检测灵敏度，检出限可达到nM级别。
附图说明
图1是实施例1中m/z位移试剂C60-CONHS衍生氨基小分子化合物所得衍生产物的质谱图。
图2是实施例2中m/z位移试剂C60-CONHS衍生部分氨基酸后所得衍生产物的质谱图。
图3是实施例2中9种氨基酸混和标准溶液(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、牛磺酸、亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸，各种氨基酸浓度均100μM)衍生前后(即氨基酸本身与氨基酸衍生后产物)的MALDI-TOF-MS检测效果对比图；其中(a)为衍生前，氨基酸本身以CHCA作为基质检测的质谱图；(b)为衍生前，氨基酸本身以C60作为基质检测的质谱图；(c)为衍生前，氨基酸本身以DCTB作为基质检测的质谱图；(d)为氨基酸衍生后产物以DCTB作为基质检测的质谱图。
图4是实施例2中m/z位移试剂C60-CONHS对甘氨酸衍生后所得甘氨酸衍生产物的标准曲线。
图5是实施例2中正常人(a)与糖尿病(b)患者血清样品中所含部分氨基酸的质谱图。
图6是实施例2中正常人(a)与糖尿病(b)患者血清样品中所含部分氨基酸的浓度。
图7是实施例3中m/z位移试剂C60-COCl衍生羟基化合物(甲醇，乙醇，苯酚，浓度分别为500μM)所得衍生产物的质谱图；其中(a)甲醇衍生后产物以DCTB作为基质检测的质谱图；(b)乙醇衍生后产物以DCTB作为基质检测的质谱图；(c)苯酚衍生后产物以 DCTB作为基质检测的质谱图。
图8是实施例4中3种羟基化合物混和标准溶液衍生前后(即羟基化合物本身与其衍生后产物)的MALDI-TOF-MS检测效果对比图；其中(a)为衍生前，羟基化合物本身以 CHCA作为基质检测的质谱图；(b)为衍生前，羟基化合物本身以DCTB作为基质检测的质谱图；(c)为羟基化合物本身衍生后产物以DCTB作为基质检测的质谱图。
图9是实施例4中m/z位移试剂C60-COCl对苯酚衍生后所得苯酚衍生产物的标准曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
下述实施例1和2中选用人体血清样品作为检测对象，原因在于人体血清样品中基质成分复杂，并含有丰富的氨基酸，可以作为检测氨基小分子化合物的代表，以此来说明本发明的技术方案。故下述实施例2中以富勒烯标记物作为MALDI-TOF-MS的m/z位移试剂用于定量分析人体血清样品中的氨基酸物质。
下述实施例1和2中所述富勒烯标记物的结构如下所示，缩写为C60-CONHS，是在C60基础上接羧酸基团，在EDC作用下通过脱水与N-羟基琥珀酰亚胺形成含有活泼酯官能团的富勒烯m/z位移试剂。
下述实施例1和2中采用的内标物选择与衍生产物(衍生产物即为富勒烯标记物C60- CONHS衍生氨基酸后的衍生物)的类似物，即含有COOH官能团的C60衍生物作为内标物，可以利用C60与对甲酰基苯甲酸甲酯、N-乙基甘氨酸反应，再酸化，合成得到含有 COOH官能团的C60衍生物，缩写为C60-COOH。反应过程如下：
下述实施例3和4中选用甲醇、乙醇、苯酚作为检测对象，分别代表脂肪醇和酚类化合物，可以作为检测羟基小分子化合物的代表，以此来说明本发明的技术方案。下述实施例3 和4中所述富勒烯标记物的结构如下所示，缩写为C60-COCl，内标物如式4所示，缩写为C60-COOPh。
下述实施例中采用日本Shimadzu公司的AximaTOF2型基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。
实施例1
考察氨基小分子化合物采用富勒烯标记物衍生前后质谱谱图的变化
氨基小分子化合物(500μM,10μL)与C60-CONHS m/z位移试剂(50μM,100μL)混合，加入140mM三乙胺(TEA)11μL，60℃下衍生2h后，得到氨基化合物衍生产物；将所得衍生产物中加入140mM甲酸11μL除去TEA，取所得反应液1μL，然后与1μL基质 (DCTB)混合后点板；待室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI- TOF-MS)，采用负离子反射模式分析，结果去图1所示。
其中，氨基小分子化合物分别为甘氨酸、鸟氨酸、苯胺、苄胺、丁二胺、庚二胺。
如图1所示，m/z位移试剂C60-CONHS可以对氨基小分子化合物进行衍生，将其从低m/z区域转移至高m/z区域，很好地消除基质对氨基小分子化合物的干扰，说明本发明所述方法能够实现质荷比<500Da的氨基小分子化合物在质谱谱图中的辨识度，极大地提高它们在质谱中的检测灵敏度。
实施例2
正常人和糖尿病患者血清样品中氨基酸的分析检测
正常人和糖尿病患者血清样品通过标准的临床渠道从湖北省中南医院获得，保存在-80℃冰箱中。在进行检测氨基化合物分析之前，血清样品先加入等量的乙腈除蛋白(具体条件为：涡旋，12000r/min离心10min)，然后取上清液作为氨基酸化合物待测品。
MALDI-TOF-MS检测正常人和糖尿病患者血清样品中氨基化合物的方法，包括如下步骤：
1)建立标准曲线：配制一系列不同浓度的氨基酸标准品溶液，其中氨基酸标准品溶液中同时含有多种氨基酸，每一种氨基酸的浓度范围均在0.7-70μM之间(具体氨基酸种类与浓度区间如表1所示)，并用富勒烯标记物进行衍生化反应，所得标准品衍生产物中加入内标物后进行MALDI-TOF-MS分析，然后以氨基酸标准品溶液的浓度X为横坐标、标准品衍生产物与内标物峰强度比值Y为纵坐标建立标准曲线，具体如表1所示；其中，衍生化反应条件和内标物的加入量均与步骤2)相同；
2)①将100μL 0.3mM富勒烯标记物C60-CONHS(即m/z位移试剂)与20μL血清样品(即氨基酸待测品)混合，并加入140mM TEA 11μL，于60℃下进行衍生化反应2h，然后加入140mM甲酸11μL除去TEA，即得到血清样品衍生物；
②将所得血清样品衍生产物中加入适量内标物溶液C60-COOH(0.3mM、10μL)混合后，取1μL与1μL基质(DCTB)混合点板，室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用负离子反射模式分析，得到血清样品衍生产物的质谱图；
③将血清样品衍生产物与内标物峰强度比值代入表1所得标准曲线中，进而计算得到血清样品中各氨基酸的浓度，结果如图6所示。
如图2所示，m/z位移试剂C60-CONHS可以较好的衍生氨基酸，将其从低分子量区域拉至高分子量区域，且图3很好的表明，本发明所述方法能很好地消除基质对氨基小分子化合物的干扰，实现对氨基小分子化合物的灵敏的检测。
如图5所示，本发明所述方法对血清样品中氨基酸进行成功的检测。应用本发明所提供的氨基酸定量分析检测的方法学考察数据如表1所示，包括标准曲线和检出限等，其中Y为纵坐标，X为横坐标。
对血清样品分别进行低(5μM)、中(15μM)、高(50μM)三个浓度加标，考察加标回收率及日内、日间精密度，实验各重复5次。如表2所示，目标物检测相对标准偏差RSD﹤14.9％，相对回收率在80％-117％之间，说明本发明所述方法准确性和精密度可以满足实际样品检测需求，定量检测氨基小分子化合物的方法准确度高，稳定性好。。
本实施例计算得到血清样品中各氨基酸的浓度，结果如图5-6和表3所示，与正常人相比，除支链氨基酸如亮氨酸的含量明显升高，生糖氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、精氨酸的含量都有所降低。
表1
表2
表3
实施例3
考察羟基小分子化合物采用富勒烯标记物衍生前后质谱谱图的变化
羟基小分子化合物(500μM,10μL)与C60-COCl m/z位移试剂(100μM,100μL)混合，加入100mM 4-二甲氨基吡啶(DMAP)10μL，40℃下衍生0.5h后，得到羟基小分子化合物衍生产物；取所得反应液1μL，然后与1μL基质(DCTB)混合后点板；待室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，采用负离子反射模式分析，结果去图1所示。
其中，羟基小分子化合物分别为甲醇、乙醇、苯酚。检测结果如如图7所示，m/z位移试剂C60-COCl可以对羟基小分子化合物进行衍生，将其从低m/z区域转移至高m/z区域，很好地消除基质对羟基小分子化合物的干扰，说明本发明所述方法能够实现质荷比<500Da的羟基小分子化合物在质谱谱图中的辨识度，极大地提高它们在质谱中的检测灵敏度。
实施例4
1、配制羟基小分子化合物的标准品混合溶液，其中标准品溶液中甲醇、乙醇、苯酚浓度分别为150，200，150μM；
羟基小分子化合物的标准品混合溶液(10μL)与C60-COCl m/z位移试剂(100μM,100 μL)混合，加入100mM 4-二甲氨基吡啶(DMAP)10μL，40℃下衍生0.5h后，得到标准品衍生产物(体积120μL)；
取1μL标准品衍生产物与1μL基质(DCTB)混合点板，室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用负离子反射模式分析，结果如图8所示；
2、配制一系列苯酚的标准品溶液，其中苯酚的浓度范围在1-100μM之间，并用C60-COCl进行衍生化反应，得到标准品衍生产物；
所得标准品衍生产物(体积120μL)中加入内标物溶液C60-COOPh(0.3mM、10μL) 进行MALDI-TOF-MS分析，然后以苯酚标准品溶液的浓度X为横坐标、标准品衍生产物与内标物峰强度比值Y为纵坐标建立标准曲线，结果如图9所示。
由图8-9可知：本发明所述方法能很好地消除基质对羟基小分子化合物的干扰，并且羟基小分子化合物的浓度与检测信号存在线性关系，实现对羟基小分子化合物的灵敏的检测，检出限nM级别。
综上所述，本发明使用富勒烯标记物对能够对包括氨基小分子化合物、羟基小分子化合物等在内的小分子化合物进行衍生化反应后进行MALDI-TOF-MS检测，能克服MALDI-TOF- MS分析中低分子量区域的干扰，显著改善小分子化合物在质谱谱图中的辨识度，极大地提高了其在质谱中的检测灵敏度，普适性强，能准确定量检测样品中小分子化合物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.富勒烯标记物作为质荷比位移试剂在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中检测小分子化合物的应用，其特征在于所述小分子化合物为氨基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式1所示；所述小分子化合物为羟基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式3所示；
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述小分子化合物为 质荷比<500Da的小分子化合物。
3.一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法，其特征在于以富勒烯标记物作为质荷比位移试剂；所述小分子化合物为氨基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式1所示；所述小分子化合物为羟基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式3所示；
4.一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)建立标准曲线：配制一系列不同浓度的小分子化合物标准品溶液，并用富勒烯标记物进行衍生化反应，所得标准品衍生产物中加入内标物后进行MALDI-TOF-MS分析，然后以小分子化合物标准品溶液的浓度为横坐标、标准品衍生产物与内标物峰强度比值为纵坐标建立标准曲线；
2)将富勒烯标记物与小分子化合物待测品进行衍生化反应，所得待测品衍生产物中加入内标物后进行MALDI-TOF-MS分析，得到待测品衍生产物的质谱图，将待测品衍生产物与内标物峰强度比值代入步骤1)所得标准曲线中，进而计算得到小分子化合物待测品的浓度；
所述小分子化合物为氨基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式1所示，所述内标物结构如式2所示；所述小分子化合物为羟基小分子化合物时，所述富勒烯标记物其结构如式3所示，所述内标物结构如式4所示；
5.根据权利要求4所述的一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法，其特征在于所述氨基小分子化合物选自氨基酸、脂肪胺、芳香胺，所述羟基小分子化合物为脂肪醇和酚类化合物。
6.根据权利要求4所述的一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法，其特征在于所述步骤1)中小分子化合物为一种或几种；小分子化合物的浓度范围均为0.7-100μM；所述步骤2)中富勒烯标记物的加入量与步骤1)相同；步骤1)和步骤2)中内标物的加入量以保证内标物的浓度在0.7-100μM之间。
7.根据权利要求4所述的一种MALDI-TOF-MS检测小分子化合物的方法，其特征在于步骤1)中小分子化合物标准品溶液与富勒烯标记物浓度比为1：(2-4)；所述步骤1)和步骤2)中衍生化反应的条件：弱碱性环境，温度在20-70℃，时间为0.5-2h；步骤1)和步骤2)中内标物的加入量以保证内标物的浓度在20-40μM之间。
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2016
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