CN103364494A

CN103364494A - 一种对血清糖肽组高选择性富集的方法

Info

Publication number: CN103364494A
Application number: CN2012100960083A
Authority: CN
Inventors: 陆豪杰; 刘丽婷; 张莹; 杨芃原
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-03-31
Also published as: CN103364494B

Abstract

本发明属生化分析领域，涉及一种血清糖肽组高选择性富集的新方法。尤其是利用功能化有序介孔纳米材料对血清糖肽组高选择性富集的方法。本发明选用具有合适孔径大小的功能化介孔纳米材料作为样品吸附剂，利用结合功能基团的糖肽捕获和介孔的尺寸排阻双重能力对血清中内源性糖基化多肽进行富集，PNGase F糖苷酶切除糖链后进行纳升级液相色谱串联质谱分析，数据库搜索鉴定氨基酸序列和相应的糖基化位点，成功实现了对血清糖肽组学的揭示。本发明提供了一种步骤简单、操作方便、快速高效，适应糖肽组学研究要求，高灵敏度检测和鉴定内源性糖基化多肽进而揭示血清糖肽组学的高选择性富集的新方法。

Description

一种对血清糖肽组高选择性富集的方法

技术领域

本发明属生化分析领域，涉及一种血清糖肽组高选择性富集的新方法。尤其是利用功能化有序介孔纳米材料对血清糖肽组高选择性富集的方法。

背景技术

多肽组学，作为蛋白质组学中低分子量的一个重要分支，越来越受到国内外科学工作者的密切关注。血清样本中含有的低分子量循环蛋白和多肽，可以提供丰富的信息资源。据研究报道，超过一半发现的癌症生物标志物都是糖基化的蛋白质或者多肽，糖链结构的改变与肿瘤的发生和发展密切相关，因此特异性揭示血清中的内源性糖基化肽段和相应的糖基化位点非常有利于疾病生物标志物的发现和临床诊断。目前，尽管血清糖肽组学的研究具有很大的潜力，仍然存在一些困难和挑战严重阻碍了糖肽组学的研究，如：血清蛋白极高的动态丰度范围(～10¹²)、糖肽组学的低分子量范围(≤20 kDa)以及糖基化肽段相对低的丰度(2％～5％)使得糖肽组学的研究极其困难。因此，糖肽组学中首先要解决的关键问题便是如何能够将糖基化多肽从血清中高效、高通量地分离出来，达到质谱可以检测的水平。

现有技术公开了各种样品预处理方法来覆盖多肽组学研究的低分子量范围，包括有机溶剂沉淀法、离心超滤法、固相萃取法、限进介质材料色谱柱等等。其中，介孔纳米材料由于结合吸附和尺寸排阻机理而具有强的富集能力，其表现显著优于其它方法。因具有的独特的孔洞结构、丰富的表面性质以及超大的比表面积使得上述的介孔材料非常适合于多肽的富集。然而，它们却不能用于糖肽组学的研究，因为样本预处理方法应该对糖肽具有特异性。目前特异性富集糖肽的方法发展成熟，包括凝集素亲和法、肼化学反应法、硼酸法、亲水作用法等等。基于不同糖肽富集原理的一些功能化纳米材料也已经用于特异性地富集糖肽，然而，这些功能性的纳米材料由于没有尺寸排阻能力而不能应用于糖肽组学的研究。因此，亟需发展一种既具有尺寸排阻能力又能特异性富集糖肽的血清糖肽组高选择性富集的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清糖肽组高选择性富集的新方法。尤其是利用功能化有序介孔纳米材料对血清糖肽组高选择性富集的方法。该方法步骤简单、操作方便、快速高效，适应糖肽组学研究要求，能高灵敏度检测和鉴定低丰度内源性糖基化多肽进而实现对血清糖肽组学的揭示。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1)选择具有合适孔径大小的功能化介孔纳米材料作为样品吸附剂；

2)利用结合功能基团的糖肽捕获和介孔的尺寸排阻双重能力对血清低丰度内

源性糖基化多肽进行富集；

3)PNGase F糖苷酶切除糖链后进行纳升级液相色谱串联质谱分析；

4)数据库搜索鉴定氨基酸序列和相应的糖基化位点。

本发明能够将糖基化多肽从血清中高效、高通量地分离出来，达到质谱可以检测的水平，实现对血清糖肽组学的揭示。

具体而言，本发明的一种血清糖肽组高选择性富集的方法，其特征在于，采用具有合适孔径大小的功能化介孔纳米材料作为样品吸附剂，利用结合功能基团的糖肽捕获和介孔的尺寸排阻双重能力对血清中内源性糖基化多肽进行富集，PNGase F糖苷酶切除糖链后进行纳升级液相色谱串联质谱分析，数据库搜索鉴定氨基酸序列和相应的糖基化位点，其包括步骤：

(1)血清样品中加入两倍体积的乙腈于沸水浴加热变性，摇晃，离心弃除沉淀，收集上清液；

(2)功能化介孔纳米材料与收集的上清液混合，补加三乙胺，在4-37摄氏度下孵育，摇晃使糖基化肽段结合使样品富集；

(3)离心后弃除上清液，收集下层固体相，用含有三乙胺的乙腈水溶液清洗，分别离心后弃除上清液，收集下层固体相，依次用含有酸的不同浓度乙腈水溶液洗脱固体相，离心后收集每次的洗脱液，合并真空冻干；

(4)冻干样品重新溶解于25-100mM碳酸氢铵溶液，加入0.2-2μL PNGase F糖苷酶，37摄氏度下温浴、摇晃12-18小时以使糖链充分切除。

(5)沸水浴加热终止酶切反应，用C18除盐小柱除去水溶性小分子，真空冻干后重新溶于0.1％甲酸5％乙腈水溶液中，进行纳升级液相色谱串联质谱分析；

(6)数据库搜索，鉴定内源性糖基化多肽的氨基酸序列和糖基化位点。

本发明步骤(1)中，血清样品为0.5-10毫升，血清样品中加入乙腈后于沸水浴加热变性10-15分钟；

本发明中，采用后接枝法键合硼酸基团进行有序介孔纳米材料功能化，所述功能化有序介孔纳米材料的孔径为1-4nm；

本发明步骤(2)中，补加的三乙胺的浓度为0.1％-0.5％，在4-37摄氏度下孵育；功能化有序介孔纳米材料进行样品富集的温度是4-37摄氏度，样品富集的时间是2-3小时；

本发明步骤(3)中用100-1000μL含有三乙胺的乙腈水溶液清洗富集后的功能化有序介孔纳米材料2-3次，用含有0.1％-5％酸的浓度为20％-80％的乙腈水溶液洗脱富集后的功能化有序介孔纳米材料。

本发明步骤(5)中，水溶性小分子选自盐类水溶性小分子

本发明的优点在于：

本发明使用的功能化介孔纳米材料，其孔径在较为合适的1-4nm范围内，使用后接枝方法将硼酸基团键合到孔道内表面；血清加热变性后不仅能使蛋白酶失活从而抑制蛋白和多肽的降解，而且可以有效的将多肽从结合的载体蛋白或高丰度蛋白(如人血清白蛋白等)上分离开来，乙腈溶液则促进了多肽的溶解和提取，有利于后续糖基化肽段的富集。该功能化介孔纳米材料不仅拥有较大的比表面积，而且其介孔结构有效地将血清中大尺寸蛋白排阻在孔洞外，小分子蛋白和多肽则进入孔道内，在碱性条件下糖基化多肽会和介孔内表面的硼酸基团结合，而非糖基化多肽在清洗过程中去除干净，加入酸性的乙腈水溶液，糖基化肽段在酸性条件下被释放，从而高特异性和高选择性地富集内源性糖基化肽段；PNGase F糖苷酶切除糖链后进行纳升级液相色谱串联质谱分析，根据二级质谱图搜索数据库确定氨基酸序列以及分子量的质量变化确认糖基化位点。

本发明在含有三乙胺的乙腈水溶液条件下对糖基化多肽进行富集，不仅最大限度的提取了多肽，而且其碱性条件保证了糖链和硼酸基团的结合，同时乙腈的存在又减小了非糖基化肽段与介孔纳米材料的非特异性吸附，使得糖基化多肽富集具有极高的特异性和高效性。另外，三乙胺为可挥发性有机碱，不影响后续质谱的检测。

本发明所选用的功能化有序介孔纳米材料能高选择性、高效率地富集糖基化肽段，并且其有序介孔结构能有效地将大尺寸蛋白排阻在介孔外，从而高效率的特异性富集血清样品中糖基化多肽，极大提高了极低丰度内源性糖基化多肽的检测。本方法具有步骤简单、操作方便、快速高效等特点。

附图说明

图1为本富集方法的流程图。

图2为原始和依次功能化的三种介孔纳米材料(原始介孔纳米材料，氨基功能化介孔纳米材料和硼酸功能化介孔纳米材料)对标准蛋白质分子吸附的尺寸排阻效应结果，

其中，(a)为原始介孔纳米材料，(b)为氨基功能化介孔纳米材料，(c)为硼酸功能化介孔纳米材料的透射电子显微镜表征图；(a，b，c)表明硼酸功能化后的介孔纳米材料保持了清晰的六角多面体形态的有序介孔结构；

(d)为功能化前后具有不同孔径的这三种介孔纳米材料对蛋白质分子吸附的尺寸排阻效应；聚丙烯酰胺凝胶电泳分离四种标准蛋白混合物(辣根过氧化物酶(HRP)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、马心肌红蛋白(Myo)和马心细胞色素c(Cyto C))，孔道1、5、9均为吸附前的标准蛋白对照，孔道2-4、孔道6-8和孔道10-12分别为原始介孔纳米材料、氨基功能化介孔纳米材料和硼酸功能化介孔纳米材料吸附后的标准蛋白，孔道2、6、10，孔道3、7、11和孔道4、8、12分别是吸附后的上清液、清洗液和洗脱液。

图3为5fmol/μL标准糖蛋白辣根过氧化物酶的酶解混合物经硼酸功能化介孔纳米材料富集后的MALDI-TOF-MS谱图，

其中，(a，b)是1mL样品溶液富集后得到的，(a)显示的是质荷比在850-2000范围，(b)显示的是质荷比在2000-6000范围，＊代表酶解辣根过氧化物酶的糖基化肽段，选择m/z＝2591的糖基化肽段，以信噪比为3计算得出检出限低至1fmol/μL，表明本方法具有高灵敏性。

图4为25fmol/μL辣根过氧化物酶的酶解混合物与标准非糖蛋白牛血清白蛋白的酶解混合物以质量比为1∶100掺杂的MALDI-TOF-MS谱图，

其中，(a，b)是1mL样品溶液富集后得到的，(c，d)是未经富集得到的，(a，c)显示的是质荷比在850-2000范围，(b，d)显示的是质荷比在2000-6000范围，＊代表酶解辣根过氧化物酶的糖基化肽段。

图5为2pmol/μL辣根过氧化物酶的酶解混合物与大鼠血清以质量比为1∶200掺杂的MALDI-TOF-MS谱图，

其中，(a，b)是富集后得到的，(c，d)是未经富集得到的，(a，c)显示的是质荷比在850-2000范围，(b，d)显示的是质荷比在2000-6000范围，＊代表酶解辣根过氧化物酶的糖基化肽段。

图6为高精度串联质谱鉴定到的代表性糖基化肽段N^#NSDDNRVNICPDN的二级质谱谱图，

其中，#代表N-糖基化的氨基酸残基，使用PNGase F糖苷酶切除糖链后天冬酰胺N转变为天冬氨酸D，质量增加0.98402Da。

下面结合附图和实施例对本发明提出的利用功能化有序介孔纳米材料对血清糖肽组高选择性富集的新方法进一步说明。

具体实施方式

实施例1

硼酸功能化有序介孔纳米材料对标准蛋白吸附的尺寸排阻能力试验配制总浓度为0.2mg/mL的蛋白混合液(四种标准蛋白HRP、SBTI、Myo、Cyto C以相同质量溶于10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4))。分别将功能化前后三种介孔纳米材料在一定体积的上述蛋白混合液中孵育2小时，离心5分钟后收集上清液。然后，在下层固体相中加入与前述蛋白混合液等体积的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，摇晃5分钟以清洗材料，离心5分钟收集上清液。最后，在下层固体相中加入等体积的洗脱液(0.1％三氟乙酸50％乙腈水溶液)，摇晃30分钟后离心5分钟收集上清液。取等体积未经处理的上述蛋白混合液作为对照样品。将吸附、清洗、洗脱每个步骤中收集的上清液以及对照样品分别冻干，用作聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。通过凝胶上灰度值的差异评价吸附前后三种材料对不同尺寸标准蛋白的吸附能力(如图2d所示)。表1为四种标准蛋白质的性质。

实施例2

硼酸功能化有序介孔纳米材料对标准糖蛋白酶解肽段的富集能力试验

配制5fmol/μL级别的标准糖蛋白辣根过氧化物酶的酶解混合物(溶于含有三乙胺的乙腈水溶液中)，将硼酸功能化有序介孔纳米材料在上述溶液中孵育1小时后离心5分钟，弃除上清液，然后取5μL 0.1％三氟乙酸50％乙腈水溶液重新混匀固体相，摇晃30分钟后离心5分钟，取上清液(最终的含有糖基化肽段的乙腈上清溶液)2μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的DHB基质溶液(0.1％三氟乙酸50％乙腈水溶液)，干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，结果显示，选择m/z＝2591的糖基化肽段，以信噪比为3计算得出检出限低至1fmol/μL，表明本方法具有高灵敏性(如图3所示)。

实施例3

硼酸功能化有序介孔纳米材料对标准糖蛋白酶解肽段富集的抗非糖肽干扰能力试验

配制辣根过氧化物酶的酶解混合物(25fmol/μL级别)与标准非糖蛋白牛血清白蛋白的酶解混合物以质量比为1∶100掺杂的混合溶液(溶于含有三乙胺的乙腈水溶液中)，取2μL上述混合溶液点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的DHB基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，结果如图4c，d所示；然后将硼酸功能化有序介孔纳米材料在上述混合溶液中孵育1小时后离心5分钟，弃除上清液，然后用含有三乙胺的乙腈水溶液连续清洗材料2次，分别离心5分钟弃除上清液，最后加入5μL 0.1％三氟乙酸50％乙腈水溶液重新混匀固体相，摇晃30分钟后离心5分钟，取上清液(最终的含有糖基化肽段的乙腈上清溶液)2μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的DHB基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，结果如图4a，b所示。

实施例4

硼酸功能化有序介孔纳米材料对血清中掺杂标准糖蛋白酶解肽段的富集能力研究

配制辣根过氧化物酶的酶解混合物(2pmol/μL)与大鼠血清以质量比为1∶200掺杂的混合溶液(总体积为25μL)，取1μL溶液点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的DHB基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，见图5c，d。将上述剩余混合溶液中加入两倍体积的乙腈，混合均匀，沸水中加热10分钟后，摇晃30分钟，离心15分钟收集上清液。将硼酸功能化有序介孔纳米材料在此上清液中(补加一定浓度三乙胺)孵育1小时，离心5分钟，弃除上清液。然后用含有三乙胺的乙腈水溶液连续清洗材料2次，分别离心5分钟弃除上清液，最后加入5μL 0.1％三氟乙酸50％乙腈水溶液重新混匀固体相，摇晃30分钟后离心5分钟，取上清液(最终的含有糖基化肽段的乙腈上清溶液)2μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积DHB基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，结果如图5a，b所示。

实施例5

硼酸功能化有序介孔纳米材料对血清中内源性糖基化肽段的富集试验

取一定体积的血清样品，冰上冻融后缓慢加入两倍体积的乙腈，立即振荡此混合物后于沸水中加热10分钟，摇晃30分钟后离心15分钟，收集上清液。将硼酸功能化有序介孔纳米材料在此上清液中(补加一定浓度三乙胺)孵育3小时，离心5分钟，弃除上清液。然后用含有三乙胺的乙腈水溶液连续清洗材料2次，分别离心5分钟弃除上清液，最后依次用含有一定浓度酸的不同浓度乙腈水溶液重新混合固定相，分别摇晃30分钟后离心5分钟，收集洗脱液。合并每次的洗脱溶液，真空冻干，重新溶解于碳酸氢铵溶液中，按照操作手册加入适量的PNGaseF糖苷酶切除糖链，37℃孵育过夜。沸水加热10分钟终止酶切反应，用C18除盐小柱除去盐类等水溶性小分子，真空冻干后重新溶于0.1％甲酸5％乙腈溶液中，进行纳升级液相色谱串联质谱分析。数据库搜索，鉴定内源性糖基化多肽的氨基酸序列和糖基化位点，鉴定结果如表2所示。

表2

(N#表示N-连接的糖基化位点)。

Claims

1.一种血清糖肽组高选择性富集的方法，其特征在于，采用具有合适孔径的功能化介孔纳米材料作为样品吸附剂，利用结合功能基团的糖肽捕获和介孔的尺寸排阻双重能力对血清中内源性糖基化多肽进行富集，PNGase F糖苷酶切除糖链后进行纳升级液相色谱串联质谱分析，数据库搜索鉴定氨基酸序列和相应的糖基化位点，其包括步骤：

(4)冻干样品重新溶解于25-100mM碳酸氢铵溶液，加入0.2-2μL PNGaseF糖苷酶，37摄氏度下温浴、摇晃12-18小时以使糖链充分切除。

2.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的血清样品为0.5-10毫升。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的血清样品中加入乙腈后于沸水浴加热变性10-15分钟。

4.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(2)中的功能化有序介孔纳米材料的孔径为1-4nm。

5.按权利要求4所述的方法，其特征是，所述的有序介孔纳米材料采用后接枝法键合硼酸基团功能化。

6.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(2)中补加的三乙胺的浓度为0.1％-0.5％，在4-37摄氏度下孵育。

7.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(2)中功能化有序介孔纳米材料进行样品富集的温度是4-37摄氏度，样品富集的时间是2-3小时。

8.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(3)中用100-1000μL含有三乙胺的乙腈水溶液清洗富集后的功能化有序介孔纳米材料2-3次。

9.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(3)中用含有0.1％-5％酸的浓度为20％-80％的乙腈水溶液洗脱富集后的功能化有序介孔纳米材料。

10.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(5)中水溶性小分子

选自盐类水溶性小分子。