CN104713963A - 一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型纳米复合材料用于蛋白质样品预处理的新方法。该材料用于蛋白质样品预处理能够有效减小高丰度蛋白质的丰度，降低样品的复杂程度，鉴定到血浆中更多的中低丰度蛋白质。相比于传统的蛋白质样品预处理方法，具有方便易行、成本低廉等特点。

Description

一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质样品预处理方法，具体地说是一种基于聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物的制备及其在蛋白质样品预处理中的应用。

背景技术

生物样品内蛋白质的组成极其复杂，而且动态范围比较宽，浓度差异大（丰度差异大），比如血浆样品中前10种高丰度蛋白质含量占到总蛋白质含量的90%，前22种蛋白质占到99%，余下几千种蛋白却仅占到1%，高丰度蛋白质的存在会掩盖低丰度蛋白质，从而干扰对低丰度蛋白质的鉴定，而这些低丰度蛋白质往往存在潜在的生物学意义，在疾病标志物的发现与治疗方面可能会发挥重要生物功能（J.Proteome Res.,2011,10,516）。因此在蛋白质样品分析过程中需要降低其中高丰度蛋白质的丰度差别，缩小这种差异以方便用现有的检测技术检测到低丰度蛋白质成为蛋白质样品预处理的核心问题之一。

目前发展的去除高丰度蛋白质的技术方法主要包括染料配体法、超速离心过滤法、免疫去除法及预分级技术。染料配体法是将汽巴蓝F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒表面，通过染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白(Journal of Chromatography B,2006,832,216-223)。该方法样品的处理量大，但特异性较差。超速离心过滤法主要通过选择具有不同截留分子量的膜实现蛋白质的分离，并去除某些分子量较大的高丰度蛋白质（Molecular&Cellular Proteomics,2003,2,10961103）。然而高丰度蛋白质并非都是大分子量的蛋白质，因此会存在对高丰度蛋白质去除不充分，而且可能会同时去除高分子量的低丰度蛋白质等问题。与前两种去除方法相比，免疫去除法的特异性很高(Mol CellProteomics2008,7,1963-1973;J Proteome Res2010,9,4982-4991;JProteome Res.,2007,6,947-954)。然而，该方法仍存在很多不足，如，低丰度蛋白质易与部分高丰度蛋白质非特异性结合，产生共去除现象(Electrophoresis2010,31,471-482)；已发现的抗体种类少(20种)；处理样品的体积有限；去除后的样品被稀释；不同蛋白质去除效率有一定差异性等。近期，人们还通过采用液相等电聚焦和多维液相色谱等方法进行样品的预分级，有效地降低了样品的复杂程度(J.ProteomeRes.,2009,8,11431155;Electrophoresis,2009,30:249-261;Electrophoresis,2010,31,35803585;J.Proteome Res.,2009,8,11431155;J.Proteome Res.,2010,9,1902-1912)。但是液相等电聚焦方法只能根据已有的等电点膜将样品按照有限的等电点区间进行分级。因此，高丰度蛋白质所在级分仍存在对低丰度蛋白质的掩盖问题。而多维液相色谱方法不仅操作繁琐、运行时间长，而且也难以避免去除高丰度蛋白质的同时造成低丰度蛋白质的共洗脱。

发明内容

针对以上方法目前存在的不足，本发明提供一种简便高效的蛋白质样品处理方法以降低蛋白质样品的复杂程度。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

在不同pH条件的缓冲溶液中，采用聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒处理蛋白质组样品，以降低蛋白质组样品中高丰度蛋白质的丰度，并同时实现蛋白质组样品复杂程度的降低。

所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒的制备与蛋白质样品处理的具体步骤如下，

（1）样品处理方法中所述的材料聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒的制备：将氧化石墨烯分散于水中，超声使其分散均匀。加入与氧化石墨烯质量比为10-1000倍的聚亚乙基亚胺（PEI），室温震荡反应5min-70min后，加入与聚亚乙基亚胺质量比为1/5-1/100的氯金酸（HAuCl43H₂O），震荡均匀，30-100℃反应5-90min。双蒸水反复洗涤后，离心并分散于100μL水中。向200-500μL上述颗粒中加入25-100mg SH-PEG溶液，水溶液体系中反应2-24h，水洗涤即制得聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒。

（2）体液样品包括血液和尿液样品；组织样品包括动物组织样品如动物大脑、心脏、肺、胃、肝脏等组织样品；细胞样品如Hela细胞样品、类淋巴母细胞等细胞株样品。

（3）蛋白质样品的处理：采用（1）制备的纳米复合物颗粒与蛋白质样品在pH值为3-10的缓冲溶液中孵育0.5-10h，孵育温度为1-40℃。

（4）蛋白质洗脱：将颗粒去除上清液后，采用与(2)中孵育溶液相同的缓冲液进行洗涤，去除上清液，得到纳米复合材料与蛋白质的复合物。

（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE）

向（3）中所述纳米复合材料与蛋白质的复合物中加入同等体积的SDS-PAGE上样缓冲溶液，在沸水中煮沸后，将其加于凝胶孔道中。采用5%浓缩胶和12%的分离胶，在120V恒压条件下进行分离。

（6）蛋白质酶解：将（3）中得到的纳米复合材料与蛋白质的复合物在50-100℃的溶液条件下加热变性，再分别进行胰酶酶解。具体过程如下：向变性后的复合物中加入二硫苏糖醇反应1.5h，实现蛋白质的还原过程，再加入碘乙酰胺溶液，避光条件下反应40min对蛋白质进行烷基化，最后加入与蛋白质质量比为25:1-50:1的胰蛋白酶，37℃进行酶解反应16h。离心后收集上清。

（7）二维液质联用分析与数据处理：将上述蛋白质酶解产物进行强阳离子交换-反相液质联用(SCX-RP-LC-MS/MS)分析。质谱数据采用Mascot检索。

本发明具有如下优点：

（1）本发明所采用的样品处理方法能够有效降低样品中高丰度蛋白质的丰度，降低复杂样品的复杂程度；（2）制备的颗粒稳定，制备方法与样品处理结果重现性好，；（3）样品处理方法耗费少，操作简便，通过离心操作便能实现，不需要液相色谱、电泳仪等仪器辅助，且无需使用抗体柱等。

附图说明

图1为聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒透射电镜图

图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质样品结果图

具体实施方式

下面采用具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

1.材料表征

制备的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒透射电镜结果表征如图1所示，根据该图可看出纳米金颗粒在石墨烯层中分散均匀，说明石墨烯层上修饰的聚亚乙基亚胺成功还原氯金酸溶液，在其表面生成纳米金颗粒，并且材料具有很好的分散性。

2.样品处理过程

将制备的纳米复合物颗粒与血浆蛋白质样品在pH值为4.0,7.4,9.0的三种磷酸缓冲溶液中孵育0.5h，孵育温度为25℃。将颗粒离心去除上清液后，采用与孵育溶液pH值相同的磷酸缓冲液进行洗涤，去除上清液，得到纳米复合材料与蛋白质的复合物。

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE）

向上述的纳米复合材料与蛋白质的复合物中加入同等体积的SDS-PAGE上样缓冲溶液，在沸水中煮沸后，将其加于凝胶孔道中。采用5%浓缩胶和12%的分离胶，在120V恒压条件下进行分离。结果如图2所示，原始血清中高丰度蛋白质条带较多，几乎全是血浆白蛋白质条带，经处理后可发现高丰度蛋白质条带明显减弱。降低了高丰度蛋白质的丰度能够减小高低丰度蛋白质之间的丰度差异，说明了该方法在蛋白质样品预处理中的有效性。实施例2

1.蛋白质与纳米复合材料的酶解

将得到的纳米复合材料与蛋白质的复合物加热变性，再分别进行胰酶酶解。具体过程如下：将样品在90℃条件下变性20min，加入一定量的二硫苏糖醇（DTT，每毫克蛋白质加入8μmol二硫苏糖醇溶液)，56℃反应1.5h，以实现蛋白质的还原过程，再按比例加入碘乙酰胺溶液(IAA，1μmol DTT加入2.5μmol IAA)，在避光条件下反应40min对蛋白质进行烷基化，最后加入胰蛋白酶（胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:25），在37℃反应16h。

2.离子交换-反相串联液质分析与数据处理

将上述酶解之后的材料进行离心后，收集上清，进行离子交换-反相串联的液质(SCX-RPLC-MS/MS)分析。采用三种流动相：流动相A为2%乙腈，98%水，0.1%甲酸；流动相B为98%乙腈，2%水，0.1%甲酸；流动相C为醋酸铵，摩尔浓度为1mol/L。当样品载于SCX捕集柱上之后，分别采用5%,10%,15%,20%,30%及100%的流动相C冲洗15min，每次冲洗后采用流动相A平衡捕集柱15min，再采用如下分离梯度进行反相分离，0-5%B,分离5min；5-35%B，分离95min；35-80%B，分离5min，之后采用80%流动相B冲洗10min。LTQ质谱采用正离子扫描模式，碰撞能量为35%。将质谱得到的原始数据采用Mascot(2.4.0version)进行检索，数据库为IPI_human_v3.8.7(91464sequence)。将肽段假阳性率设置为1%以下，以得到高度可信的蛋白质。

对得到的蛋白质列表信息进行统计分析，结果如表1所示。该结果表明，血浆样品经过PEGAuPEIGO纳米复合材料处理后，血浆中蛋白质的鉴定数目提高了1.35倍(原始血浆鉴定到858个蛋白质，处理后鉴定到2023个蛋白质，唯一性肽段数>1)，肽段鉴定数目提高了1.69倍(原始血浆鉴定到17314条唯一性肽段，处理后鉴定到46549条肽段)。说明该方法在降低样品复杂程度的基础上能够显著提高血浆中蛋白质的鉴定数量。

表1原始血浆与处理后血浆样品蛋白质质谱鉴定结果

实施例3

将制备的纳米复合材料在pH3.0的柠檬酸缓冲液、pH9.0的乙酸钠缓冲液及pH7.0的磷酸缓冲液中与鼠脑组织蛋白质样品进行孵育，处理组织样品。

实施例4

将制备的纳米复合材料在pH3.0的柠檬酸缓冲液、pH9.0的乙酸钠缓冲液及pH7.0的磷酸缓冲液中与尿液蛋白质样品进行孵育，处理尿液样品。

实施例5

将制备的纳米复合材料在pH3.0的柠檬酸缓冲液、pH9.0的乙酸钠缓冲液及pH7.0的磷酸缓冲液中与尿液蛋白质样品进行孵育，处理海拉细胞样品。

Claims (7)

1.一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法，其特征在于：

新型纳米复合材料与蛋白质组样品在不同pH值的缓冲液中进行孵育，并采用相应缓冲液洗涤后，得到相应pH条件下材料与蛋白质的复合物。

2.按照权利要求1所述的样品预处理方法，其特征在于：缓冲液体系pH值为3-10，所述缓冲液体系中包括三种或三种以上的缓冲液，所述缓冲液为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中的一种或两种以上。

3.按照权利要求1所述的样品预处理方法，其特征在于：所述新型纳米复合材料的组成为聚乙二醇、纳米金颗粒、聚乙烯亚胺及氧化石墨烯中的一种或两种以上。

4.按照权利要求3所述的样品预处理方法，其特征在于：所述纳米复合材料以氧化石墨烯或者石墨烯为基质，其表面用聚乙二醇链修饰，以聚乙烯亚胺连接纳米金。

5.按照权利要求4所述的样品预处理方法，其特征在于：所述纳米复合材料上各组成部分的关系为：聚乙烯亚胺通过静电作用与氧化石墨烯结合。聚乙烯亚胺作为还原试剂和固定化试剂，在氧化石墨烯上生成和固定纳米金，得到纳米金修饰的氧化石墨烯复合纳米材料。

6.按照权利要求4所述的样品预处理方法，其特征在于：所述聚乙二醇链，其分子量为400-10000，通过末端的巯基修饰于金表面。

7.按照权利要求1所述的样品预处理方法的应用，其特征在于：蛋白质组样品包括体液、组织样品或细胞株样品中的一种或两种以上。